Zieralgen - Micrasterias

Bernd · Februar 09, 2012, 20:49:33 NACHMITTAGS

Liebes Forum,

ich habe von zwei Micrasterias-Arten (Kulturmaterial) jeweils eine Alge zuerst im DIC und dann die gleiche Alge mit Auflicht-Fluoreszenz zur Sichtbarmachung der Chlorophyll-Autofluoreszenz und damit des Chloroplasten fotografiert. Alle Bilder sind mit Helicon Focus erstellte Aufnahmestapel.

1) Micrasterias americana, 40x

2) Micrasterias rotata, 20x

Viele Grüße,
Bernd

Klaus Herrmann · Februar 09, 2012, 21:40:19 NACHMITTAGS

Lieber Bernd,

deine DIC-Bilder: wie aus dem Vollen herausgefräst. So plastisch wirken die! Einfach toll!

Bei deinen Fluoreszenzbildern bin ich am rätseln, warum sie so "schwammig" sind?

Hast du AL-Optik verwendet? Objektiv >20x aber mit DG?

Oder hat dein Chip die "Rotkrankheit", Rot wird immer flau gezeichnet. Das hate ich mit vielen anderen bei einer Canon PS A 520. Alle anderen Farben waren gut nur Rot hat sich immer mehr verabschiedet.
Canon hat die Chips übrigens lange nach Auslauf der Garantie noch kulant getauscht!

Bernd · Februar 10, 2012, 20:38:28 NACHMITTAGS

Hallo Klaus,

die Fluoreszenzbilder sind, wie auch die DIC-Bilder, mit einem Plan-Neofluar 20x bzw. 40x und einer Canon EOS500D gemacht. Wenn ich deine Abkürzungen richtig verstanden habe also mit DL-Optik und DG. Ich habe ein Filter 450-490, Fl 510, LP 520 verwendet. Dabei fluoresziert der Hintergrund auch schwach. Wenn ich in der Bildbearbeitung den Schwarzpunkt etwas anders setze, werden die Bilder weniger schwammig, allerdings auf Kosten von feinen Details, besonders in den Randbereichen.

Viele Grüße
Bernd

Klaus Herrmann · Februar 10, 2012, 21:09:00 NACHMITTAGS

Hallo Bernd,

dann würde ich vorsichtig vermuten: du hast die Schärfe nicht erwischt. Was passiert wenn du einfach mal stur durch-stackst? Ich vermute, das du dann irgendwo ein schön scharfes Bild erwischt! Sonst ist es der Canon Chip!

Ich kämpfe selbst oft bei AL-Fluoreszenz mit dem Problem, dass die Schärfe schwer einzustellen ist und behelfe mich mit dieser Vorgehensweise!

Bernd · Februar 10, 2012, 21:57:40 NACHMITTAGS

Hallo Klaus,

alle Aufnahmen, auch die Fluoreszenzbilder, sind gestackt.

Viele Grüße
Bernd

Klaus Herrmann · Februar 10, 2012, 23:32:28 NACHMITTAGS

Hallo Bernd,

demütig gebe ich zu: es ist sauschwer! Ich hab bei mir geblättert. Der Unterschied Beobachtung zu Bild ist wie Himmel und Hölle.

Ich hatte wohl eine verklärte Erinnerung!
Die Frage ist nur: warum wird die Rotfluoreszenz so flau abgebildet?

Detlef Kramer · Februar 11, 2012, 09:47:03 VORMITTAG

Lieber Klaus,

m.M. erscheint das Fl-Bild schwammig und unstrukturiert, weil unser Computer, ich meine den, den wir auf den Schultern tragen, damit nichts anfangen kann. Außerdem, wenn Du mal kritisch schaust: in den roten Flächen gibt es wirklich kaum Struktur. Die Ränder sind doch in der Fokusebene scharf.

Ein Erklärungsversuch.

Herzliche Grüße
Detlef

Rolf-Dieter Müller · Februar 11, 2012, 12:00:35 NACHMITTAGS

Zitat von: Detlef Kramer in Februar 11, 2012, 09:47:03 VORMITTAG
...
Außerdem, wenn Du mal kritisch schaust: in den roten Flächen gibt es wirklich kaum Struktur. Die Ränder sind doch in der Fokusebene scharf.
...

Lieber Detlef,

da geben ich Dir vollkommen recht.

Darüber hinaus mache ich ständig die Erfahrung, das gerade bei Primärfluoreszenz die von uns eingesetzte Aufnahmetechnik tatsächlich an Grenzen kommt, was wiederum die Vermutung von Klaus stützt.

Zum Beispiel sind Fluorezenzaufnahmen von Klaus Wörmann ein ganz andere Klasse, in ihrer Wirkung brillianter, schärfer und detaillreicher wovon ich nur träumen kann. Bessere Bilder habe ich noch nie gesehen. Gut, er setzt auch eine AxioCam ein, ich versuche mich mit DSLR's.

Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter

Hugo Halfmann · Februar 11, 2012, 22:55:57 NACHMITTAGS

Hallo zusammen,

m.M. nach ist das erste Fl Bild tatsächlich unscharf, die beiden anderen erscheinen mir scharf. Aber alle Bilder sind pxelig. Es scheint, als sei die Belichtungszeit zu kurz gewesen oder die Empfindlichkeit der Kamera zu hoch eingestellt. Wenn dem so ist, wird´s schwierig, hier das "richtige" Verhältnis von ASA und Belichtungszeit zu finden. Normale Kameras sind für solche Aufnahmen (eine Farbe / schwarzer Hintergrund) nicht gedacht.

Horst Wörmann · Februar 12, 2012, 11:57:21 VORMITTAG

Liebe Fluoreszenzler,

nachdem ich schon hier von Rolf-Dieter zitiert wurde, will ich noch meine Einschätzung zum besten geben.

Auch die Axiocam stellt das Chlorophyll im Roten unscharf dar.

Meines Erachtens gibt es zwei mögliche Gründe:
1. ist die Rotfluoreszenz ziemlich monochromatisch, bei meinen Messungen am Extrakt (EtOH) im Maximum bei 668 nm, Halbwertsbreite ca. 25 nm. Das heißt, daß über den Bayer-Filter nur die roten Pixel Licht bekommen und schon deshalb die Auflösung sinkt.
2. Das gesamte Volumen des Chloroplasten wird vom Erregerlicht durchdrungen, so daß auch tiefer gelegene Teile als Selbstleuchter emittieren und das Bild insgesamt überstrahlen. Diesen Effekt habe ich kürzlich auch bei einer Uvitex-Anfärbung von Pilzhyphen gesehen, die deutlich unschärfer erscheinen als im Hellfeld-Bild.
Nicht umsonst machen die Experten Dekonvolution!

Viele Grüße,
Horst
(PS:Rolf-Dieter, ist alles schon für die nächsten MKB-Tagung berücksichtigt).

Eckhard · Februar 12, 2012, 19:30:42 NACHMITTAGS

Hallo,

40x EC PlanNeofluar 1,3 Öl, Bildausschnitt, Chloroplast einer Spirogyra, Epifluoreszenz, Blauanregung mit 100W Halogen und Zeiss Filtersatz 9

Ich kann mich noch sehr gut erinnern, wie diese Aufnahme entstanden ist. Meine ersten Versuche scheiterten kläglich! Die wendelartige Struktur des Chloroplasten war auf dem Foto mehr zu erahnen als zu erkennen: alles unscharf und überstrahlt. Erst als ich das Licht deutlich reduziert und mehrere Sekunden belichtet habe, kam diese Aufnahme zu Stande.

Zitat von: HorstDas gesamte Volumen des Chloroplasten wird vom Erregerlicht durchdrungen, so daß auch tiefer gelegene Teile als Selbstleuchter emittieren und das Bild insgesamt überstrahlen.

Die fluoreszierenden Chloroplasten sind Selbstleuchter, deren Ausdehnung in der z-Achse grösser als die Schärfentiefe des verwandten Objektivs ist.

Herzliche Grüsse
Eckhard

Holger Adelmann · Februar 12, 2012, 20:07:50 NACHMITTAGS

Liebe Kollegen,

die Eigenfluoreszenz ausgedehnter Strukturen wie ganzer Grünalgen ist in der Tat schwierig zu fotografieren, wenn man auch noch viele Details sehen möchte.
Die Fluoreszenzemission von ausgedehnten 3D Objekten wie diesen Algen führt zu erheblichen Überstrahlungen, in der XY Ebene wie auch entlang der Z-Achse, wie Eckhard ja schon völlig korrekt angemerkt hat.

Hier ist die Auflicht-Fluoreszenz der Durchlicht-Fluoreszenz überlegen, da bei der AL-Fluoreszenz nicht der Chloroplast in seiner ganzen Tiefenausdehnung angeregt wird, sondern nur an der Oberfläche bzw. einige µm unter der Oberfläche. Das ergibt dann besser sichtbare Details.

Ich hänge mal ein Bild von der Grünalge Stephanosphaera pluvialis an (der weisse Rand gibt die Ausdehnung der gesamten Kugel wieder, in der sich die 8 Zellen befinden). Das erste Bild ist eine Nativaufnahme mit dem Leitz Orthoplan, Pl Fluotar 40:1; das zweite ist in Image-Pro nachbearbeitet (local contrast enhancement).
Leider habe ich kein DL Fluo Bild zum Vergleich. Allerdings zeigt der Chloroplast bei der AL Anregung dennoch einige Details, die nach der Bearbeitung noch deutlicher hervortreten.

(für Diejenigen, die diese wunderschöne und seltene Alge noch nicht kennen, hier nochmal der Link zu meinem alten Thread https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=5233.0)

Herzliche Grüsse
Holger

Klaus Herrmann · Februar 12, 2012, 20:33:52 NACHMITTAGS

Lieber Holger,
gut dass du das Bild zeigst! Es beruhigt mich schon irgendwie: der Blick durchs Okular zeigt ein traumhaft klar abgebildetes Objekt und das Foto ist einfach flusig. Hat nichts zu tun, mit dem, was man sieht.
Anders ist es bei Fluoreszenz im nicht roten Bereich, das kommt eigentlich schön klar: botanisch - wohl eine Koniferennadel mit W 3A gefärbt. Blauanregung und noch was Technisches: ein Holzlenkrad mit gerissener Fügestelle Autofluoerszenz UV-Anregung:

Holger Adelmann · Februar 12, 2012, 20:53:36 NACHMITTAGS

Absolut, lieber Klaus. Die dunkelrote Fluoreszenz des Chlorophylls ist überaus schwierig zu fotografieren.
Und zwar gilt das für Aufnahmen auf dem gute alten Analogfilm, wie auch für Aufnahmen mit den modernen digitalen Chips.

Herzliche Grüsse
Holger

Bernd · Februar 12, 2012, 20:56:21 NACHMITTAGS

Liebe Autofluoreszenzler,

sicherlich spielen besonders drei Punkte bei den Fluoreszenzaufnahmen eine ganz entscheidende Rolle. Erstens ist die Intesität der Fluoreszenz gering, so daß längere Belichtungszeiten (bei meinen Aufnahmen 2,5 s bei 200 ASA) benötigt werden. Zweitens wird nur der Rotkanal der Kamera benutzt, was man auf den Fotos durchaus ansieht, sie sind pixelig. Drittens – und aus meiner sicht am problematischsten – sind aber die Überstrahlungen.

Der ,,Profi" hilft sich folgendermaßen:
Er benutzt eine hochempfindliche Monochromkamera. Schon liegt die Belichtungszeit wieder im Millisekunden-Bereich. An der Überstrahlung ändert das aber wenig bis gar nichts, wie auf dieser Spirogyra-Aufnahme zu sehen ist:

Schmalbandfilter verringern die Überstrahlungen deutlich, natürlich auf Kosten der Intensität. Da ich kein Fluorezenz-Experte bin, kenne ich solche Filter nur für die Arbeit mit GFP (green fluorescent protein).

Dekonvolution hilft, wirk aber keine Wunder.

Wenns richtig gut werden soll, was man hier sehen kann, http://web.me.com/dassow/Research_Site/Picture_of_the_week/Entries/2010/4/11_Desmid.html, muß halt ein Laserscanning-Mikroskop her.

Vielen Dank an alle für die interessante Diskussion.

Bernd