Botanik: Klein aber fein (Zwergmädchenkiefer) + Methode der Seifeneinbettung *

Begonnen von David 15, August 02, 2012, 11:26:44 VORMITTAG

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David 15

Hallo schnippler Freunde,

Heute möchte ich euch Nadelquerschnitte der Zwergmädchenkiefer vorstellen, eine Kulturform der Mädchen-Kiefer.

Ich habe für euch ein paar Interessante Infos zur Mädchen-Kiefer:

Die Mädchen-Kiefer stammt ursprünglich aus Japan und wurde um 1850 nach Mitteleuropa eingeführt. In Japan wird der Baum "Hime-ko-matsu'' genannt und er kann ein Alter von über 350 Jahren erreichen. Der winterharte Baum erreicht bei uns eine maximale Höhe von 10m wobei er in seiner Heimat eine Größe von bis zu 25m erreichen kann. Die reine Form ist bei uns kaum anzutreffen,meist sieht man nur Kulturformen wie eben die Zwergmädchenkiefer,die in 10 Jahren nur 1m wächst. Die Mädchen-Kiefer ist ein beliebeter Baum für die Bonsai-Zucht. Auch die Zwergmädchenkiefer wird dafür verwendet.

Die Mädchenkiefer gehört zur Gattung der Kiefern(Pinus),in der Familie der Kieferngewächse(Pinaceae). Der lateinische Name der Zwergmädchenkiefer lautet Pinus parviflora negishi

Bild der Zwergmädchenkiefer


Präparationsverfahren

Die Zwergmädchenkiefer wurde fixiert, in Seife eingebettet und danach am Schlittenmikrotom geschnitten.

Die Seifeneinbettung eignet sich hervorragend für härtere zusammenhängende Gewebe wie z.B für Nadeln. Sie ist weniger aufwendig als das bekannte Paraffinverfahren und die Schrumpfungen fallen wesentlich geringer aus, da die Entwässserung mit reinem ISO entfällt. Die Methode stammt von einem Mikroskopiker aus Lindau namens Bodo Braunstorfinger.

Einbettung:
-Fixierung in AFE 1Woche
-Entwässerung mit Ethanol 30% für 18 Std.
-Glycerin Seife+Glycerin 1:1 bei 60° für (17 Std. Bitte bei Eigenversuchen nicht diese Zeit verwenden ! Das Gemisch war schon alt und deshalb ist die Seife nur langsam eingezogen. Für gewöhnlich reichen 8 Std das muss aber mit dem Auge kontrolliert werden ob die Pobe schon komplett mit Seife durchzogen ist.)
-Reine Seife bei 60° für (17 Std. siehe Bemerkung oben)
-Gießen

Um die Temperatur bei der Infiltartion zu halten eignen sich Babyflaschenwärmer sehr gut. Als Gläser verwende ich leere Flaschen von Babybrei. Wer die Methode ausprobieren möchte dem wünsche ich guten Appetit  :D. Um die Proben bequem aus den Gefäßen zu nehmen verwende ich einen Kaffeesahnebehälter der mit zwei-Komponentenkleber an einen Schaschlickspieß geklebt wurde. Meine Gießformen sind ebenfalls Kaffesahnebehälter. ( Endlich hat man eine Verwendung für das Zeug ;) )


Die fertig gegossenen Blöcke werden dann aufgegklebt und geschnitten. Die Stücke die man beim schneiden erhält werden mit der Seife in Dest.Wasser gegeben, sodass sich die Seife auslöst. Nachdem alle Schnitte drin sind und sich die Seife von den Schnitten gelöst hat kann man die Schnitte mit einer Pipette aubsaugen, in ein Gefäß geben und das Seifenwasser durch Ethanol 70% ersetzten.

Die fertigen Blöcke lassen sich natürlich auch aufbewahren allerdings ist darauf zu achten,dass sie Luftdicht verschlossen sind: Glycerinseife=hygroskopisch !


So genug von der Seifeneinbettung, kommen wir zur Färbung  ;)

Gefärbt wurde sowohl mit W3A-Simultan als auch mit FCA:

W3A-Simultan:
-Färbezeit 20min
-Differenzieren mit Ethanol 30%
-Entwässern mit ISO 100% 3mal
-Einschluss in Euparal

FCA:
-Färbezeit nur 5min ! ( Die Schnitte sind trotz der geringen Zeit immer noch ein wenig überfärbt. Selbst längeres differenzieren hat nichts geholfen)
-Differenzieren mit Ethanol 70%
-Entwässern mit ISO 100%
-Einschluss in Euparal

Die Schnitte mit der Wacker Färbung sind ebenfalls überfäbt. Langes differenzieren hat auch dort nicht geholfen. Am Farbstoff liegt es jedenfalls nicht. Meine Schnitte der Schwarzkiefer haben nämlich eine tolle Färbung.

So nun Kommen die Bilder:

Die Fotos wurden mit am Zeiss Standard 14 mit Achromaten und einer Canon Powershot A520 mit Herrmannschem Adapter erstellt. Es handelt sich alles um ''One-shot-Aufnahmen''. Durch stapeln lässt sich das Ergebniss bestimmt noch etwas verbessern. Die Schnittdicke beträgt übrigens 30 Mikrometer

1.Übersichtsaufnahme der Kiefer. Vergleich zwischen W3A und FCA    Vergrößerung: 100 X


Was sofort auffällt ist der dreieckige Aufbau der Nadel den ich bisher noch nicht gesehen habe.

2.Nochmal Übersichtsaufnahme aber mit grober Beschriftung     Vergrößerung: 100 X


Hg= Harzgang
Lb=Leitbündel
Ap= Asimilationsparenchym in diesem Fall Armpalisaden

3.Detailaufnahme des Leitbündels 400 X

Ph=Phloem
Xy=Xylem
Ed=Endodermis
T=Transfusionstracheiden
S=Straßburgerzellen

4.Detailaufnahme einer Stomata(Spaltöffnung)        Vergrößerung: 400 X

Ep=Epidermis
Hp=Hypodermis
Vh=Vorhof
Sz=Schließzellen
Iz=Interzellularraum
Ap=Asimilationsparenchym in diesem Fall Armpalisaden. Man kann es hier leider nicht gut erkennen aber die Ap enthalten sehr viele Chloroplasten

5.Zu guter letzt habe ich noch einen Längsschnitt aber ohne Beschriftung. Das ist nämlich ein bisschen schwierig. Vergrößerung: 400 X


Das war meine kleine Doku. Ich hoffe es hat euch gefallen. Für Feedback habe ich selbstverständlich ein offenes Ohr.

An dieser Stelle einen herzlichen Dank an Detlef Kramer für die Hilfe bei der Beschriftung von Bild 3

Viele Grüße vom Nachwuchsmikroskopiker
David Kubon









''Wir leben in einem gefährlichen Zeitalter. Der Mensch beherrscht die Natur, bevor er gelernt hat, sich selbst zu beherrschen.'' ( Albert Schweitzer)

Vorstellung: ''Hier''

Herne

Hallo David,
das ist eine sehr schöne Dokumentation von einem hochinteressanten Objekt. Du hast seit deinem Einstieg hier gewaltige Fortschritte gemacht! Gratulation! Besonders die Abhandlung über die Seifeneinbettung fand ich sehr erhellend, da ich selbst schon geraume Zeit damit herumexperimentiere. Auf den offenkundig entscheidenden Dreh mit der Glyzerinmischung bin ich aber nicht gekommen. ;) Ich werde es jetzt mal nach  deiner Methode ausprobieren.
Deine Färbungen sind gut gelungen, vor allem die FCA-Färbung gefällt mir. Wie dick sind die Schnitte? Hier könnte etwas weniger mehr sein - aber das ist schwierig. Meine stelle ich zur Zeit auf etwa 30 - 50 µm ein (z.B. hier : http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=12768.0)


Mit freundlichem Gruß
Herbert
Die animalcula infusoria sind Blasen mit Neigungen.
G. Chr. Lichtenberg

Dieter Stoffels

Hallo David,

alle Achtung! Ein wunderbarer Beitrag, der sich durch eine prägnante Einführung, einen ausführlich beschriebenen, methodischen Teil und eine schöne Darstellung der Ergebnisse auszeichnet.

Vielleicht noch einen kleinen Hinweis: Da Du eine hygroskopische Einbettung verwendet hast, solltest Du nach dem Schneiden die Schlittenbahn gründlich von Seifenresten reinigen und ölen um Korrosion zu vermeiden (vermutlich weißt Du das aber schon).

Herzliche Grüße!

Dieter

David 15

Hallo Herbert,

Herzlichen Dank für dein Lob  :) Das motiviert immer !

Die Schnitte haben eine Dicke von 30µm . Viel dünner kann man mit Seife auch nicht schneiden. 25 µm würden auch noch gehen aber da müsste ich an meinem Mikrotom ständig umstellen da meine Einteilung nur bis 10µm geht.

Schön,dass du die Seifeneinbettung ausprobierst. Wenn du die Proben dann in der Glycerinmischung hast muss man die Zeit ein wenig abschätzen. Jedes Objekt braucht nämlich unterschiedlich lang. Wenn man während der Infiltration ein Stück heraus nimmt sieht man relativ deutlich wie weit die Seife bereits vorgedrungen ist. Bei Querschnitten ist es nicht so schlimm wenn die Infiltration zu kurz war. Man schneidet dann einfach bis zum Punkt wo die Seife vorgedrungen ist. Wenn nur noch Matsch raus kommt muss man abbrechen. Bei Längsschnitten muss die Probe allerdings vollständig durchdrungen sein, sonst bekommt man kaum brauchbare Schnitte.

Viel Erfolg beim probieren der Methode  :) Wenn du bei der Einbettung ein Problem haben solltest, einfach Fragen. Kostet schließlich nichts  ;)

Herzliche Grüße
David
''Wir leben in einem gefährlichen Zeitalter. Der Mensch beherrscht die Natur, bevor er gelernt hat, sich selbst zu beherrschen.'' ( Albert Schweitzer)

Vorstellung: ''Hier''

David 15

Lieber Dieter,

Auch dir vielen Dank für die Blumen  :)

Das Mikrotom wird selbstverständlich nach jeder Benutzung geputzt und geölt. Aber das kann man schließlich nicht oft genug sagen und so bleibt es dauerhaft im Kopf.

Viele Grüße
David
''Wir leben in einem gefährlichen Zeitalter. Der Mensch beherrscht die Natur, bevor er gelernt hat, sich selbst zu beherrschen.'' ( Albert Schweitzer)

Vorstellung: ''Hier''

Herbert Dietrich

Hallo David,

meine Gratulation! Wenn ich bedenke, dass Du erst seit einem Jahr mikroskopierst und schon so perfekt Deine Ergebnisse vorstellst,
wohin soll das noch führen?
Ich freue mich darüber.

Liebe Grüße
Herbert

Fahrenheit

#6
Lieber David,

vielen Dank auch von mir für diesen erstklassigen Beitrag! Mit der Seifeneinbettung hast Du hier ein Verfahren praxisnah beschrieben, das nicht so häufig angewendet wird - klasse.

Was mir an den Querschnitten auffällt: sie wirken ein wenig unnatürlich "verschrumpelt" - was bei dem Längstschnitt nicht der Fall ist. Gibt es da irgendwelche Unterschiede in der Präparation?

Zur Überfärbung: hier hilft vielleicht eine Entdeckung von Rolf-Dieter Müller, der sehr harzige oder tanninhaltige Schnitte vor dem Färben mit Rotihistol behandelt und gute Erfolge erzielt.

Nun ärgert es mich, dass ich mich nicht doch bei Dir gemeldet habe. Wie Du an meinen letzten Beiträgen vielleicht gesehen hast, war ich nämlich im Juli eine Woche am See. Da ich eine ganze Weile nichts von Dir gesehen habe (und vergessen hatte, mich rechtzeitig im Vorfeld anzumelden) habe ich mich aber nicht getraut ...  :-[

Herzliche Grüße
Jörg
Hier geht's zur Vorstellung: Klick !
Und hier zur Webseite des MKB: Klick !

Arbeitsmikroskop: Leica DMLS
Zum Mitnehmen: Leitz SM
Für draussen: Leitz HM

hajowemo

Hallo David,

du hast eine gute Dokumentation verfasst.
Was ich besonders mit Interesse gelesen habe ist die Beschriftung der Zellen. Daran muss ich noch viel arbeiten.
Weiter so!

Liebe Grüße
Jochen
Vorstellung
Homepage www.mikroskopie-hobby.de
Gerne per "Du"
Man sieht nur mit dem Herzen gut.
Das Wesentliche ist für die Augen unsichtbar.

David 15


Lieber Herbert,

Danke für die schönen Worte  :)

Es führt auf jedenfall dazu,dass ich später beruflich in diese Richtung gehe. Nach der Realschule gehe ich nämlich auf das Biotechnologische Gymnasium und danach steht noch studieren auf der ''to do list'' Ebenfalls in die Richtung Biologie.

Ohne dein tolles Mikroskop wäre ich garnicht erst soweit gekommen !

Lieber Jörg,

Auch dir vielen Dank für das Lob !

Auf die Frage,warum der Längsschnitt normal ist und der Querschnitt verschrumpelt habe ich leider keine Antwort. Die leichte ''verschrumpelung'' beruht vermutlich auf der viel zu langen Einwirkezeit von 17 Std. Sie sind wohl durch die Wärmeeinwirkung entstanden.
Das Gemisch war alt und bereits durch andere Proben mit Ethanol verdünnt. Deshalb hat es so lange gedauert bis die Proben durchdrungen waren. Da die Proben aber im Urlaub eingebettet wurden hatte ich keine Chemikalien zur Verfügung um ein neues Gemisch herzustellen.

Den Tipp mit Rotihistol werden ich auf jedenfall ausprobieren ! Nun habe ich morgen was zu tun ;)

Das war hoffentlich nicht dein letzter Ausflug zum See. Melde dich nächstes mal bitte - bloß keine Scheu :)

Lieber Jochen,

Dankeschön :)

Ja,die Beschriftung ist nicht immer ganz einfach. Die Beschriftung der typischeren Gewebe habe ich mir durch Bücher angeeignet. Für spezielle Dinge kann man sich ja Unterstützung holen, so wie ich es getan habe.

Viele Grüße euch allen
David



''Wir leben in einem gefährlichen Zeitalter. Der Mensch beherrscht die Natur, bevor er gelernt hat, sich selbst zu beherrschen.'' ( Albert Schweitzer)

Vorstellung: ''Hier''

Klaus Herrmann

Lieber David,

schön und sorgfältig dokumentiert hast du das! Die Färbung von Koniferennadeln bringt manchmal Überraschungen. Mir scheint aber auch, dass die Schnitte dicker als 30 µm sind und das würde natürlich die höhere Farbsättigung auch miterklären.
Aber dass das überfärbte Rot nicht ausgezogen werden kann ist schon erstaunlich - man hat ja sowohl beim Etzold und noch stärker beim Wacker W3A eher das gegenteilige Problem.

Der kräftige Helligkeitsgradient nach außen bei deinen Fotos kann durch Kontrastverstärkung und Helligkeitskorrektur etwas gemildert werden - ich schick dir die Bilder per Mail. Und der Rest kann mit PS wegradiert werden.
Eventuell hast du zu wenig gezoomt? Ist natürlich ein Kompromiss, wenn man möglichst viel drauf bekommen will.

Ich fahre nächste Woche an die See. An den See komme ich erst wieder Ende August, vielleicht klappt es nochmal mit einem Besuch!
Mit herzlichen Mikrogrüßen

Klaus


ich ziehe das freundschaftliche "Du" vor! ∞ λ ¼


Vorstellung: hier klicken