Grösse der Stackschritte

Begonnen von Kurt Wirz, Juni 15, 2014, 17:25:42 NACHMITTAGS

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Kurt Wirz

Hallo liebe Stacker

Beim Stacken tritt die Frage auf, wie gross müssen die Stackschritte sein, wie kann man sie berechnen?
Ich habe mal nach Erfahrung in der Praxis eine Formel kreiert:
Stackschritte in mm = 0.00055 / (Na x NA) / (10 x NA + 1)
0.00055 / (Na x NA), ist die Tiefenschärfe
10 x NA + 1, ist die Anzahl der Bilder innerhalb der Tiefenschärfe, sie berücksichtigt, dass bei höherer Apertur mehr Bilder innerhalb der Tiefenschärfe nötig sind, um zu einem vergleichbaren Ergebnis zu kommen.
Das "+1" ist bewusst, vor allem im Bereich niedriger Apertur (z.B. 0.1) wirksam.

Diese Formel ergibt im Bereich 1:1 bis 100:1 höchst aufgelöste Stacks.
Verwendet man die doppelte Strecke von Bild zu Bild, resultieren gut aufgelöste Stacks, bei weiterer Verdoppelung der Distanz reicht es knapp noch fürs Internet.

Diese Formel resultiert NICHT aus wissenschaftlichen Untersuchungen, sondern ist die Essenz meiner heimischen Makro- und Mikroskopischen Beobachtung.
(Zur Beobachtung im Heim, lasse ich mir noch etwas Zeit)

Kritik, wie sachdienliche Hinweise sind erwünscht, ebenso humorvolle Randbemerkungen.

Kurt

limno

Hallo Kurt,

Im "Mikrokosmos" Jg. 1988 im Juliheft Seite 216ff. hat Gerhard Göke einen gut verständlichen Artikel "Schärfentiefe und Schärfentiefeerweiterung der mikroskopischen Abbildung veröffentlicht. Die Formel lautet: tm = n(l/2A² + 0,15/A*VMik) wobei tm = Schärfentiefe in mm;  n = Brechzahl ; l = Wellenlänge des Lichts; A = n.A.; 0,15(mm) = zulässige Größe des Unschärfekreises bei  konventioneller Sehweite.  Die Vergrößerung des Mikroskops  Vmik kann durch den Maßstab des Endbildes ersetzt werden. Ich verstehe aber nicht , warum Gerhard (Rawfoto) von ,,absoluter Schärfe" spricht,  die es im  Licht dieses Artikels doch eigentlich garnicht geben kann. Ich hoffe, ich konnte helfen!
Es wünscht ,,Gut Licht"
Heinrich(limno)
In der Formel l=lambda
So blickt man klar, wie selten nur,
Ins innre Walten der Natur.

Rawfoto

Hallo Heinrich

Ich spreche von Kernschärfe und nicht von absoluter Schärfe, die wiederum ist jener kleine Teil der Schärfentiefe indem der Zerstreuungskreis am kleinsten ist ...
Der Zerstreuungskreis von Göke entspricht nicht der Betrachtungsweise von Digitaldaten, die stammt noch aus der Ära des Films. Ich würde die vom Gefühl her auf 0,08 - 0,1 legen. Grund: jeder Käufer eines Bildes betrachtet diese mit 100 x und nicht mehr mit der Lupe ...

Lieber Kurt

Wollte nur die Aussage von Heinrich richtigstellen, ich muss mir Deine Formel erst in Ruhe ansehen und mit meinen Erfahrungswerten vergleichen ...

Liebe Grüße

Gerhard
Gerhard
http://www.naturfoto-zimmert.at

Rückmeldung sind willkommen, ich bin jederzeit an Weiterentwicklung interessiert, Vorschläge zur Verbesserungen und Varianten meiner eingestellten Bilder sind daher keinerlei Problem für mich ...

Kurt Wirz

#3
Hallo Heinrich

Vielen Dank für deinen Hinweis. Es geht jedoch nicht um die Tiefenschärfe, wie sie bei normaler Betrachtung empfunden wird!
Schärfe ist der optische Eindruck beim Sehen und ist ihrerseits von mehreren unterschiedlichen, messbaren Faktoren abhängig, Auflösung, Kontrast usw..
Am wichtigsten erscheint mir die Auflösung, denn diese kann in der digitalen Fotografie nicht so einfach und massiv wie der Kontrast mit Bildbearbeitung erhöht werden.
Ich möchte die Grösse der Distanz von Bild zu Bild beim Stacken wissen, bei unterschiedlichen Objektiven und Abbildungsmassstab, dies bei vergleichbarer resultierender Bildqualität.

Hallo Gerhard
Anbei die Stackschritte in Millimeter in Abhängigkeit der Apertur, bei gleichbleibender Bildqualität und optimalster Auflösung.
Apertur / Stackschritt in mm
0.09 / 0.036
0.11 / 0.021
0.13 / 0.014
0.15 / 0.0098
0.2 / 0.0046
0.25 / 0.0025
0.3 / 0.0015
0.4 / 0.00069
0.5 / 0.00037
0.7 / 0.00014
0.8 / 0.000095

Kurt

Stuessi

Zitat von: Kurt Wirz in Juni 15, 2014, 23:54:43 NACHMITTAGS
bei gleichbleibender Bildqualität und optimalster Auflösung.

Hallo Kurt,

es fehlen Angaben zu Bildgröße oder Sensorauflösung, denn davon hängen die Tabellenwerte doch ab?!

Gruß,
Stuessi

peter-h

#5
Hallo Kurt,

ich habe mit großen Augen auf die Tabelle geblickt und mir erlaubt eine Regressionsrechnung mit den Werten auszuführen.



Jetzt kommt meine Frage zu Aufnahmen mit Immersionsobjektiven und Aperturen über 1,0. Es geht aus der Extrapolation hervor, dass nun die Schrittweiten < 50 nm !!!  sein sollen. Da der Korrelationskoeffizient von 0,999 vorliegt, ist die Extrapolation sicher auch legal.

Jetzt die Frage an alle Feinmechaniker: Können solche Schrittweiten ( nicht theoretisch ! ) sondern in der Praxis mit einem Mikroskoptisch realisiert werden ? Ist die Mechanik dafür ausgelegt?
Oder werden nun Piezoelemente benötigt und nicht der Tisch, sondern das Objektiv verstellt? Oder habe ich etwas noch nicht verstanden? Müssen solche Aufnahmen dann in einem klimatisierten Raum stattfinden? Ein kleines STANDARD oder PHOMI erfüllt solche Anforderungen sicher nicht.

Unwissende Grüße
Peter


Rene

Hi Kurt,

From my own personal experience with a 20x/0.7 lens of fluorescence images (ie full aperture), I routinely stack 1um images. By using an optivar 1.5x (M=30x), I do use 0.67um distance stacks for the most critical specimen. My images (often dinoflagellates) can be found here on the forum. I never found a need for adding more images to the stack.

Technicalities: dry objective 20x NA 0.70 Oly Splanapo at 20 or 30x (optivar); specimen in water; camera 5Mp CMOS colour via 0.75x relay optics. Camera 'resolution' 66 pixels/10um (20x) or 100pixels/10um (30x).

For example, here's a dino from brackish waters:

Alexandrium ostenfeldii, cel diameter about 55um, 20x objective.

Frontal view, stack of 18 img, 1um apart:


Top view, 20x objective, stack of 23 img, 1um apart:


Top view, apical pore, 20x1.5 (30x), 5 images, 0.66um apart, crop at 100% (100 pixels/10um):


And here's the corresponding Pyramid stack with Helicon Focus:

The stack could be a bit better, the first image of the stack shows a more clear inner line of the 'key hole' pore. Mind you, this is at the edge of resolution for this lens. But this is what Helicon Focus makes of it in auto-mode. The thick line of the key hole is about 0.5um thick, the distance between the thick and thin line is 0.7um. The calculated resolution of this lens is 0.5um with green light.

Best wishes, René

l'œil armé

#7
Moin Peter,

meiner Meinung nach müsste das auch mechanisch machbar sein, wenn nicht erforderlich ist, dass der Tisch, auf dem sich das Objekt befindet, bei jedem Bild reproduzierbar stoppt. Wenn der Tisch (oder die Optik, je nachdem ob aufrechtes oder inverses Mikroskop) gegen die Schwerkraft, also von unten nach oben um ruckelndes Nachrutschen zu vermeiden, langsam und gleichmäßig auf der optischen Achse bewegt wird, ist die Feinheit der Einzelaufnahmen doch nur durch ihren zeitlichen Abstand limitiert. Unschärfen durch die Bewegung lassen sich durch kurze Belichtungszeiten - heute dank der Empfindlichkeit der Sensoren wahrscheinlich meist auch ohne Blitz erreichbar - vermeiden.

Kurt hat Vergleichbares doch mit seiner "Büchse der Pandora" schon demonstriert. Sollte es dennoch an der Feinmechnik scheitern, könnte ich mir einen aufsetzbaren, kleinen Heiztisch auf einem Mikroskoptisch gut vorstellen. Ob diese sehr kleinen Schritte aber praxisnah sind, wage ich etwas zu bezweifeln, da das mikroskopische Bild im Hochauflösungsbereich weniger detailreich ist. Am Konfokalmikroskop werden ja durchaus auch mit 63er oder 100er Linsen und hohen Aperturen Bildstapel erstellt um räumliche Information zu gewinnen. Eine derart feine Z-Bewegung, möglichst auch noch reproduzierbar, bringt keinerlei Informationsgewinn mehr. Zumindest solange wir uns im Rahmen üblicher optischer Abbildung bewegen und Sondertechniken wie STORM , SIM oder ähnliche Verfahren mal aussen vor lassen. In der normalen Lichtmikroskopie beträgt die laterale Auflösung unter günstigen Umständen 200nm (wenn man nicht gerade mit UV-Licht beleuchtet :-)), die Auflösung in Z-Richtung ist normalerweise (!, auch da gibt es inzwischen Rechenwege zur Verringerung) um den Faktor 2,5 geringer. Folglich sollten Schrittweiten wesentlich unter ca. 400nm kaum eine echte Verbesserung ergeben.

Allerdings denke ich auch, dass Temperaturschwankungen im Arbeitsraum tunlichst zu vermeiden sind.

Freundliche Grüße

Wolfgang
"Du" fänd' ich absolut in Ordnung

das schönste: Zeiss Lumipan
das liebste: Leitz Ortholux/Panphot
das beste: Zeiss Axiomat

Ich bin übrigens keineswegs mit meinem Umfang an Intelligenz zufrieden; ich bin lediglich froh, mit meiner Dummheit so weit gekommen zu sein.

Horst Wörmann

#8
Lieber Peter, lieber Wolfgang,

"Jetzt die Frage an alle Feinmechaniker: Können solche Schrittweiten ( nicht theoretisch ! ) sondern in der Praxis mit einem Mikroskoptisch realisiert werden ? Ist die Mechanik dafür ausgelegt?"
-> Nein. Dafür sind Mikroskoptische nicht gebaut.  

"Oder werden nun Piezoelemente benötigt und nicht der Tisch, sondern das Objektiv verstellt?"
-> Ja. Das wird mit Piezoelementen bewerkstelligt. Es gibt beide Varianten, Tisch- und Objektivverstellung, mit eigenen Vor- und Nachteilen. Firmen wie Physik Instrumente oder Prior liefern z-Tische mit 1 nm geregelter Auflösung.

"Müssen solche Aufnahmen dann in einem klimatisierten Raum stattfinden?"
-> Nicht unbedingt. Entscheidend ist eine exakte Positionsbestimmung, über die mittels closed-loop-Regelung die Position nachgeregelt wird.

Die erforderliche Schrittweite liegt bei weitem nicht bei 50 nm; Zeiss gibt dazu folgende Information:
"Der mindestens erforderliche Ebenenabstand ergibt sich aus axialen Auflösung d des Objektivs, die umgekehrt proportional zum Quadrat der numerischen Apertur nA ist:

d_axial=2 η*λ/(nA^2 )

wobei η Brechungsindex des Einschlußmediums und λ die Wellenlänge ist.
Beispiel: 540 nm Wellenlänge, Objektiv-nA 1,3, Brechungsindex 1,52: = 970 nm.
Der optimale Z-Abstand ergibt sich nach der Nyquist-Theorie bei einer zweifachen Überabtastung zu ca. 485 nm
."

Aber dazu mögen sich die Optiker mal äußern.

@ Wolfgang:
Man kann sich so einen Tisch selbst bauen, sehr einfach mit einer Höhenverstellung aus Lautsprechern, also nach dem moving-coil-Prinzip. Habe ich mehrfach hier vorgestellt. Eine ausführliche Beschreibung gibt's auf der MKB-Seite, unter "Bibliothek", "Mikroskopische Technik". Entscheidend ist die genaue Positionsbestimmung, die mit einem Differentialkondensator kapazitiv und damit berührungsfrei erfolgt, und so eine closed-loop-Lagerregelung in definierten Schrittweiten ermöglicht. Mit einem angebauten Michelson-Interferometer kann man dann absolute Höhendifferenzen messen. Die 0,67 µm Distanz, die René angibt, glaube ich nicht unbesehen. Die sind vermutlich aus der Feintriebteilung abgeschätzt, und dazu schreibt wiederum Zeiss: "Die Einstellung am Grobtriebknopf ermöglicht eine orientierende Messung der Objektdicke, ... jedoch nicht reproduzierbar (Schlupf)".

Eigentlich braucht man nicht so pingelig sein, es zählt das Ergebnis, wie René gezeigt hat. Ich fand's nur reizvoll, so eine Einrichtung zu bauen. Preis gekaufter Tisch fünfstellig, Eigenbau: Schrottplatz-Teile, ein defekter DVD-Brenner und 200 Eur für die Kapazitätsmessung. Und vollautomatisierbar incl. Fotoauslösung. Sieht so aus (links mit dem runden Loch das Interferometer):




Viele Grüße aus Bonn
Horst
Korrektur: 970 nm natürlich, nicht 0,970 nm (ist oben schon geändert, vielen Dank an Peter).

Kurt Wirz

#9
Hallo Stuessi

Die verwendete Kamera ist eine Nikon D7100, CMOS-Sensor 23.5x15.6mm, 6000x4000 Pixel.

Kurt

JüSchTü

Hallo Wolfgang,

Zitat von: l'œil armé in Juni 16, 2014, 15:18:16 NACHMITTAGS
...Wenn der Tisch (oder die Optik, je nachdem ob aufrechtes oder inverses Mikroskop) gegen die Schwerkraft, also von unten nach oben um ruckelndes Nachrutschen zu vermeiden, langsam und gleichmäßig auf der optischen Achse bewegt wird, ist die Feinheit der Einzelaufnahmen doch nur durch ihren zeitlichen Abstand limitiert...
...
...Kurt hat Vergleichbares doch mit seiner "Büchse der Pandora" schon demonstriert...

das ist nicht direkt vergleichbar, weil die "Büchse" einem Direktantrieb gleichkommt, während der Fein-/Grobtrieb mit dem Tisch über ein Getriebe verbunden ist. Ein Getriebe erzeugt aufgrund seiner Bauart und der Fertigungstoleranz Nichtlinearitäten, die eine perfekt gleichförmige Drehbewegung am Fein-/Grobtrieb in eine nicht gleichförmige Linearbewegung in Z-Richtung umsetzt, d.h. dass exakt gleiche Zeitabstände eben nicht gleichen Z-Wegschritten entsprechen. Eine Steuerung (man "glaubt", dass sich der Tisch so bewegt wie man am Knopf dreht) ist nicht ausreichend. Die Tischbewegung muss geregelt sein, indem sie mit geeigneten Mitteln gemessen und gegebenenfalls korrigiert wird (closed-loop). Nur dann "weiss" man, was der Tisch macht.

Zitat von: l'œil armé in Juni 16, 2014, 15:18:16 NACHMITTAGS
...Allerdings denke ich auch, dass Temperaturschwankungen im Arbeitsraum tunlichst zu vermeiden sind...

Das stimmt schon, ich würde aber die mechanischen Schwingungen an die erste Stelle setzen, da sich Temperaturschwankungen langsamer und kontinuierlich auswirken.

Viele Grüße, Jürgen
I'm not facebooked
"Die Zukunft rast auf einen zu. Man hat nur den einen winzigen Moment, wenn sie vorüberzieht, um sie in eine freundliche, erkennbare, angenehme Vergangenheit zu verwandeln."   (Ray Bradbury)
Zur Vorstellung

Tobse

Zitat von: Kurt Wirz in Juni 15, 2014, 23:54:43 NACHMITTAGS

Anbei die Stackschritte in Millimeter in Abhängigkeit der Apertur, bei gleichbleibender Bildqualität und optimalster Auflösung.
Apertur / Stackschritt in mm
0.09 / 0.036
0.11 / 0.021
0.13 / 0.014
0.15 / 0.0098
0.2 / 0.0046
0.25 / 0.0025
0.3 / 0.0015
0.4 / 0.00069
0.5 / 0.00037
0.7 / 0.00014
0.8 / 0.000095

Kurt


Hallo Kurt,
danke für die Infos, das ist für mich ganz hilfreich um einen Anhaltspunkt zu haben wie ich ein gutes Bild hin bekomme.

Beim 10er wäre das ziemlich genau ein Bild je Teilstrich auf dem Feintrieb, mit dem 20er wäre es auch noch mit dem Feintrieb machbar.
Beim 40er muss ich dann also deutliche Abstriche bei der Bildqualität in kauf nehmen, das ist doch schonmal gut zu wissen.

Gruß
Tobias




l'œil armé

#12
Zitat von: JüSchTü in Juni 19, 2014, 02:29:45 VORMITTAG

das ist nicht direkt vergleichbar, ...

Vielen Dank, Jürgen, für die Erklärung.

Was die Temperaturschwankungen anbetrifft, so kann ich Dir allerdings aus eigener, häufiger und leidiger Erfahrung sagen, das diese sich durchaus kurzfristig auswirken können: In früheren Jahren - heute sind diese Geräte wohl meist ausrangiert - wurden Ultradünn-Schnitte für die Elektronenmikroskopie mit Mikrotomen ausgeführt, die eben der kleinen Schritte wegen (minimal 20-30nm Schnittstärke) mit einem thermischen Vorschub ausgestattet waren, d.h. man erreichte die gewünschte Schnittstärke über die Abstimmung von Heiztemperatur und Schnitt-Geschwindigkeit. Wenn Du gerade die schönsten Serienschnitte - dunkelgrau, Shatter- und Faltenfrei und gleichmäßig in der Serie, wie sich das gehört (das war nicht einfach mit diesen Geräten!)- und jemand machte die Tür zum kalten Flur auf oder so: schwupp, war Dein Präparat weg und Deine Serie am Ende. Der Vorschub hatte das Blöckchen ein paar Nanometer zurückgezogen. Er kam dann auch gleich wieder vor, aber nie an die gleiche Position wie zuvor. >:(


Freundliche Grüße

Wolfgang
"Du" fänd' ich absolut in Ordnung

das schönste: Zeiss Lumipan
das liebste: Leitz Ortholux/Panphot
das beste: Zeiss Axiomat

Ich bin übrigens keineswegs mit meinem Umfang an Intelligenz zufrieden; ich bin lediglich froh, mit meiner Dummheit so weit gekommen zu sein.

l'œil armé

Zitat von: Horst Wörmann in Juni 16, 2014, 16:41:48 NACHMITTAGS
@ Wolfgang:
Man kann sich so einen Tisch selbst bauen, ....

Vielen Dank Horst!

Eine eindrückliche "Bastelarbeit". Ja, mir sind die VoiceCoil Tisch- und Objektiv-Mechanismen von PI durchaus bekannt. Ein bisschen was davon haben wir hier im Labor in der Anwendung. Es führen ja bekanntlich immer mehrere Wege nach Rom. Nur dachte ich, dass eine Lösung in Form eines mittels z.B. eines kleinen 2-4V Glühbirnchen vorsichtig angewärmten POM-Blocks o.ä., der auf einem (Metall-)Objektträger klebt, etwas einfacher zu realisieren sei. Dass so etwas nicht den gleichen Ansprüchen genügt wie die von Dir gezeigte Lösung, steht wohl ausser Frage.

Freundliche Grüße

Wolfgang
"Du" fänd' ich absolut in Ordnung

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Ich bin übrigens keineswegs mit meinem Umfang an Intelligenz zufrieden; ich bin lediglich froh, mit meiner Dummheit so weit gekommen zu sein.

l'œil armé

Zitat von: Safari in Juni 20, 2014, 16:53:04 NACHMITTAGS
Zitat von: l'œil armé in Juni 20, 2014, 14:28:00 NACHMITTAGS
... und jemand machte die Tür zum kalten Flur auf oder so: schwupp, war Dein Präparat weg und Deine Serie am Ende.

Wenn die Masse von dem Vorschubteil groß genug ist, dürfte das öffnen einer Tür keine besondere Auswirkung haben.


Soweit die Theorie :) 4 Jahre Praxis lehrten jedoch etwas Anderes
"Du" fänd' ich absolut in Ordnung

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