Messung der Fluoreszenzintensität?

[Xylometalin]

Ich hab ein Problem mit meinen autofluoreszenten Proben. Diese wurden nicht angefärbt, sondern lediglich deren Autofluoreszenz angeregt, bzw. verstärkt. Da ich wissenschaftlich arbeiten möchte und dazu Daten etc.brauche und nicht nur Bilder auf denen man die Fluoreszenz sieht, brauche ich konkrete Werte.
Mit der Olympus Analysis Software kann ich Intensitätsbestimmungen machen. Ich benutze Glycerin als Einbettungsmedium und der Hintergrund ist auch wirklich schön dunkel, aber ich kann doch bestimmt nicht einfach die minimalen Hintergrundwerte der Intensität von meinen Intensitätswerten in einem bestimmten Bereich abziehen, oder? Zudem wird die Intensität bei der Fluoreszenzmikroskopie von vielen Faktoren beeinflußt: Belichtungszeit, Einstelllungen imd RGB-Studio, Filter, Kontrastmaximierung und und und...

Meine Idee war ein Objekt zu nehmen, was noch nciht zur Autofluoreszenz angeregt wurde, sehr sark anzuregen und dann den unangeregten Zustand praktisch als 0 festzulegen und den stark angeregten Zustand als 100. All meine Objekte müssten dann (theoretisch) dazwischen liegen.

Leider kann mir hier keiner damit helfen, da sie das Mikroskop für ganz andere Zwecke genutzt hatten und die Fluoreszenz eher Spielerei war...aber ich hätte gern konkrete Werte mit denen ich wirklich etwas vergleichen und eine Aussage treffen kann. Ich bin weder im Internet, noch bei den Herstellern wirklich schlau draus geworden.

Achja, ich mikroskopiere mit einem Axiostar plus, Kamera: Olympus SC20-automatisch kalibrierter Eingang, dreifacher Filtersatz für Fluoreszenz: 365/12, 450-490, 546/12, Olympussoftware Analysis.

Für alle Tipps bin ich dankbar!!!

[reblaus]

Hallo -

um welche Substanzen handelt es sich denn? Falls das geheim ist: Handelt es sich um totes Material, fluoresziert die Substanz nur grün oder über einen weiten Bereich, und ist gesichert, dass die Fluoreszenz nicht verblasst?

Gruß

Rolf

[treinisch]

Hallo Xylometalin,

vielleicht solltest Du im ersten Schritt erstmal spezifizieren, welche Genauigkeit du genau brauchst, davon dürften alle Maßnahmen deutlich abhängen.

Die Fluoreszenz hängt natürlich auch von der uU sehr schlecht zu kontrollierenden Anregungsintensität ab, von der Temperatur, der Schichtdicke, dem Alter der Probe, natürlich auch von der Historie der Probe.


Ich stelle mich da jetzt mal ganz dumm: Was bedeutet bei einer Kamera denn ,,automatisch kalibrierter Eingang" ?


Vlg
Timm

[Horst Wörmann]

Hallo Xylometalin,

zur Kalibrierung würde ich fluoreszierende Referenz-Objektträger vorschlagen, die gibt es für verschiedene Em/Ex-Kombinationen. Ein Satz kostet ca. 40...50 EUR. Intensität bei Anregung 0 und 100 messen, dann alle Parameter für die Aufnahme der Probe gleich lassen. So gibt es für spätere Aufnahmeserien wenigstens eine Referenz.
Weiterer Vorteil: Prüfung der korrekten, gleichmäßigen Ausleuchtung.

Eine anständige Mikroskopkamera sollte lineare, quantitative Meßdaten liefern, keine interne Gamma-Kompensation oder so etwas machen. Die SC20 ist für Fluoreszenz etwas mickrig mit 2 MP bei 10 bit Auflösung, dazu ungekühlt. Ausprobieren, sollte aber eigentlich funktionieren.

Zur Methodik der quantitiven Fluoreszenzmessung gibt es zahlreiche dicke und dünne Bücher. Hier Empfehlung nach dem Motto "Buch macht kluch, zwei Bücher machen klücher":

Werner Schmidt, Optische Spektroskopie. VCH. Kapitel Lumineszenzspektroskopie. Dünnes Buch, Grundlagen.
J.B. Pawley (Hrsg.), Handbook of Biological Confocal Microscopy. Dickes Buch, behandelt zwar Konfokal-Mikroskopie, die Grundlagen sind aber auch für die Weitfeld-Mikroskopie sehr hilfreich, insbesondere Kapitel 42 "Fluorescent Ion Measurement" mit den zugrundeliegenden Auswertungs- und Rechenverfahren.

@Timm: "automatisch kalibrierter Eingang" kann nach Handbuch nur die x,y-Kalibrierung betreffen.

Viele Grüße aus Bonn
Horst

[Xylometalin]

hey, ihr habt mir echt schon weiter geholfen!
Ich werd mir den Pawley jetzt in der Bibliothek bestellen. Das mit den Referenz Objekttägern ist an sich eine gute Sache,
leider betrachte ich meine Objekte in einem Bereich von Ex 365-546 nm...und es gibt diese Objektträger nunmal nur für bestimmte Bereiche.
Ja die SC 20 is eine besch...Kamera^^ Ich sehe zum Beispiel unter bestimmten Voraussetzungen eine Veränderung der Fluoreszenz vom grünen in den gelben Bereich. Beim Durschauen sieht man das ganz deutlich. Auf den Fotos ist aber alles nur grün, man sieht da keinen Unterschied, auch nach sämtlichen Veränderungen der Einstellungen.
Demnächst bekommen wir ein neues Mikroskop von Zeiss, was nur mit Auflicht funktioniert und viel mehr kann. Das Modell muss ich noch erfragen. Ich betrachte Melanine, diese sind sehr interessant und es gibt noch viel daran zu erforschen. Vielleicht kennt ihr euch damit ja aus?!

[Horst Wörmann]

Hallo Xylometalin,

mit den Objektträgern liegt wohl ein Mißverständnis vor.
Wenn ich das richtig verstanden habe, hast Du drei Filtersätze mit folgenden Anregungswellenlängen:
365 nm,
450-490 nm,
546 nm.
Die Objektträger passen für alle Wellenlängen, da sie sehr breitbandig emittieren.

Grüne Fotos? Da ist was krank. Gibt es die Möglichkeit, mal eine Probe zu bekommen? Könnte ich hier mal ausprobieren, allerdings nur 365 und 470 nm.

Viele Grüße aus Bonn
Horst

[reblaus]

Hallo X. -

du regst anscheinend mit UV 365 nm an, auf das manche organischen Komponenten recht empfindlich reagieren. Das Umschlagen der Farbe könnte durch eine Mischfluoreszenz aus einer gelbfluoreszierenden Substanz (z.B. Flavonoid) und einer blaufluoreszierenden (z.B. Stilben) entstehen, wenn der blaufluoreszierende Anteil durch das UV zerstört wird.

Gruß

Rolf

[Horst Wörmann]

Lieber Rolf,

deshalb hätte ich gern mal eine Probe, dann könnte ich eine Umwandlung über Mikrospektralphotometrie nachweisen, also die zeitabhängige Veränderung des Spektrums.
Aber vorher sollte man sicher sein, daß instrumentell alles richtig gemacht wurde.

Viele Grüße
Horst

[Xylometalin]

nein es ist so, die Proben zeige schwachen Autofluoreszenz bei 450-490. Sie werden also im blauen angeregt und emittieren dann grün. Jetzt habe ich ein paar Proben behandelt (rein oxidativ, ohne andere fluoreszierende Substanzen) und da gibt es dann einen richtigen Cut an der Stelle und ab da fluoreszieren diese Proben gelb...aber die Kamera kann das leider nicht einfangen :-/ An dem Stereomikroskop was wir bekommen haben wir eine 20Megapixel Cam, vielleicht sieht mans dann besser.

Ich hab mich über diese Objektträger erkundigt und es gibt meist vier verschiedene, für den jeweiligen Bereich. Wenn die alle in einem breiten Bereich emittieren würden, dann wären doch wohl nicht extra vier verschiedene erhältlich unter Angaben der Wellenlängen, oder?! Aber vielleicht gibt es auch welche, wie ihr die beschrieben habt, aber die hab ich noch nicht gesehen bei meiner Suche :-/

[Horst Wörmann]

Hallo Xylometalin,

es gibt vier Objektträger, optimiert für folgende Anregungen:

Blue excitation - DAPI/Indo/Fura
Green excitation - FITC/GFP
Yellow excitation - Acridine Orange
Red excitation - Rhodamine/Texas Red

Die Spektren findet man z.B. auf der Webseite von Ted Pella Inc.
"Optimiert" heißt z.B. für den blauen Objektträger: bei Anregung mit 365 nm erhält man ein Maximum der Emission, und zwar bei 430 nm (gemessen mit Zeiss Filtersatz 02). Die Halbwertsbreite der Emissionsbande beträgt dabei ca 46 nm. Liegt die Anregungswellenlänge daneben, erhält man auch eine Emission bei 430 nm, aber mit geringerer Intensität; sie nimmt mit steigendem Abstand von der optimalen Ex-Wellenlänge ab. Für den hier beschriebenen Zweck muß man also nicht genau die Anregungswellenlänge einhalten.
Die vier Objektträger sind nun auf die vier Farbstoffe optimiert, d.h. sie zeigen bei der entsprechenden Blau/Grün/Gelb/Rot-Anregung maximale Emission.
Wie der Blick auf die Spektren auf der genannten Webseite zeigt, sind die Emissionsbanden breit und überlappen sich stark.
Für Ex 450...490 nm würde ich den gelben nehmen, Em(max) ist dann etwa 533 nm.

Was heißt "einen richtigen Cut"? Farbumschlag zu einem bestimmten Zeitpunkt, nehme ich an? Deutet auf Rolfs Vermutung.

20 Megapixel helfen nicht unbedingt weiter, Empfindlichkeit ist viel wichtiger, um kurze Belichtungszeiten zu haben.

Viele Grüße aus Bonn
Horst   

[Xylometalin]

Ich schau mal, ob ich etwas wie ein kleines Probierset bekommen kann, wo ich mit einer guten Probe einmal alle vier Objektträger ausprobieren kann.
Danke, die Antworten haben mir sehr geholfen.

Nein es geht wirklich um eine deutliche Zunahme der Fluoreszenz, die schon vor dem betrachten des Präparats stattgefunden hat. Ähnlich wie bei Pilzbefall des Haares, wo es ab der Stelle plötzlich fluoresziert. Am deutlichsten ist es im Bereich der Anregung 546 nm, allerdings brauche ich dafür zum Teil relativ hohe Belichtungszeiten.

[Horst Wörmann]

Hallo Xylometalin,
die Bezugsquelle für die Referenzobjektträger habe ich per PN geschickt. Da brauchst Du nicht lange zu suchen.
Kosten etwa 40 EUR pro Satz.
Viele Grüße
Horst

[Jürgen Boschert]

Hallo Herr Wörmann,

wo kann man die Referenz-Objektträger erwerbe.

Herzliche Grüße und einen Guten Rutsch !

JB

[Horst Wörmann]

Lieber Herr Boschert,
siehe PN.
Herzlichen Gruß, auch Ihnen ein gutes neues Jahr!
Horst Wörmann