Frage zum Paraplastschneiden

[hajowemo]

Liebes Forum,
ich habe ein Problem beim Schneiden eines Paraplastblockes. Beim Schneiden löst sich das Gewebe (bei mir ein Pflanzenstiel -Lungenkraut-) aus dem Schnitt. Ich habe also den Paraplastschnitt mit einem Loch und den Pflanzenschnitt getrennt als Ergebnis eines Schneidvorganges.
Woran kann das liegen?
Ich habe noch zu wenig Paraplast und Paraffineinbettungen gemacht und verfüge über wenig Erfahrung. Bei von mir gemachten Schnitten vorheriger Blöcke ist dieser Effekt nicht aufgetreten.
Liebe Grüße
Jochen

[Hugo Halfmann]

Hallo Jochen,

WIE hast Du denn eingebettet. Wenn du deine Vorgehensweise genau beschreibst, macht´s die Fehlersuche leichter.

[hajowemo]

Hallo Hugo,
hier meine Arbeitsanleitung:

Vorbereitung:
Es wurden 1 -1,5cm lange Stücke (auf Länge achten, wegen des Eintauchens ins Paraplast) eines Pflanzenstiels in AFE eingelegt.

Entwässern:
Vor dem Einbetten in Paraffin muss das Präparat entwässert werden. Dies erfolgt über 50%-, 70%-, 96%-Ethanol. Das Präparat bleibt für je 12 Stunden in jedem Bad. (Ich verwende BIO-Ethanol 96% aus einem Baumarkt);
anschließend noch 2 mal in 100% Isopropanol. Zum Schluss wird in PARAFEX S (einem Xylol-Ersatz von CHEMLAB als Intermedium) überführt. Das Präparat bleibt für je 12 Stunden in jedem Bad.

Infiltrieren:
Es wurde eine warme Mischung (ca. 60°C, ich benutze den Wärmeschrank; mittleres Regal) von Paraplast plus und Parafex S im Verhältnis 1:1 erstellt. Das Präparat wurde darin eingelegt und verblieb dort für 4 Stunden.
Danach legte ich das Präparat noch einmal für 4 Stunden in reines Paraplast plus.
Als Schmelztiegel verwendete ich alte Kaffeemilch-Becherchen.
Für den Transport der Pflanzenstiele wurde eine vorgewärmte Pinzette benutzt.

Es wurde eine Stunde vor dem Guß ebenfalls Paraplast plus geschmolzen.

Gießen des Blockes:
Da ich die Möglichkeit habe mit dem Sartorius-Mikrotom zu schneiden, kann die Einbettung in einem Block erfolgen. Ich bastelte mir aus Prägefolie eine Form (20 x 20 x 20 mm). Die Innenseiten der Form wurde mit Glycerin bestrichen.
Ich schmolz Paraplast plus im Wärmeschrank. Ich goss das flüssige Paraplast in die Form und warte einen Moment bis sich am Boden eine Haut bildete; dann stellte ich ein warmes Präparat (Pflanzenstiel) senkrecht in die Mitte der Form. Vorgewärmte Pinzette benutzen. Der Boden des Blockes ist die Schnittkante für das Mikrotom.

Man bläst auf die Oberfläche des Paraplast, bis sich eine dicke Haut bildet.
Anschließend wurde die Form in kaltes Wasser getaucht, bis das Paraplast vollständig erstarrt war (Dauer ca. 30Minuten). Der Paraplastblock muss vor allen Dingen schnell erstarren. Die Oberseite des Blockes bildet einen Trichter aus, so dass ein Teil des Präparats im Freien liegen kann, wenn er zu lang ist.

Ich hoffe du kannst damit etwas anfangen, es ist meines Wissens nach die normale Vorgehensweise.

Liebe Grüße
Jochen

[treinisch]

Hallo Jochen,

vorweg: Ich habe noch nie in Paparast eingebettet, überhaupt noch nie eingebettet, möchte aber trotzdem gern einen Hinweis loswerden:

Für die beiden Infiltrationsschritte erscheinen mir 4 Stunden doch recht kurz! Vor allem aber: Bist Du sicher, dass es nach dem 50% Paraplast-Schritt nicht zwei Schritte mit reinem Paraplast sein müssten? Da würde ich noch mal nachschauen! Ich bilde mir ein mal gelesen zu haben, dass Paraplast empfindlich auf Xylol-Reste reagiert und sich nicht gut schneiden lässt, wenn noch Xylol-Reste vorhanden sind. Ich denke Ronald Schulte schrieb solches.

Vlg
Timm

[Florian Stellmacher]

Hallo Jochen,

generell gilt: Wenn das Objekt aus dem Block ausbricht, dann ist entweder

a) des Paraffin zu weich

oder

b) das Objekt zu hart.

Im ersten Fall ist häufig eine zu große Menge Rest-Xylol im Block daran Schuld, dass das Paraffin zu weich ist und das Objekt nicht zuverlässig hält. Was ein zu hartes Objekt anbelangt, kann ich Dir nicht wirklich weiterhelfen, da musst Du uns sagen, wie fest das Objekt in Relation zum Paraffin ist. Schuld kann hier neben der originären Struktur des Gewebes auch eine mangelhafte Infiltration sein, bei der dann die Xylolreste und ggf. sogar Alkoholreste verdampfen und ein wie geräuchertes, sprödes und z.T. verblüffend hartes Material zurücklässt.

Die Zeitspannen der Infiltrartionsschritte sollte man übrigens nicht allzu statisch sehen. Da ich in der tierischen/menschliche Histologie beheimatet bin, kann ich zu botanischer Paraffintechnik nicht viel sagen, aber zumindest hege ich den Verdacht, dass Du zu schnell gearbeitet hast. Hierbei ist es dann weitgehend unmöglich, mit Sicherheit den zu kurzen Schritt zu finden, weil der Fehler im Grunde überall liegen könnte. Ich selbst nehme zwei Xylol-Schritte als Intermedium (Du nur einen), und ich würde auch die Infltration in Paraffin länger als 4 Stunden laufen lassen. Mir ist bekannt, dass pflanzliches Gewebe hier problematischer sein kann als tierisches, aber ich kann mir vorstellen, dass 6 oder 8 Stunden tolerabel sind (da weiß doch sicher jemand mehr?).

Herzliche Grüße,
Florian

[Klaus Henkel]

Guten Abend Jochen!
Meine Vorschreiber haben schon Wichtiges geschrieben. Ich ergänze nur noch.

1. Sproßstücke von bis zu 1,5 mm sind auf jeden Fall zu lang! Das heiße Paraffin kann nicht so rasch durch die pflanzliche Epidermis dringen.
2. Florian St. erwähnt die große Empfindlichkeit des Paraplast gegen Alkohol- und Xylolreste.
3. Einen Schritt in der Argumentation gehe ich noch weiter: Von allen schlechten Intermedien ist Xylol das dasjenige mit den allerschlechtesten Eigenschaften. Es härtet die Objekte viel zu stark, macht sie spröde und splittrig, so daß das Paraffin bzw. die P.-mischung nicht mehr eindringen kann. Und von einem Xylol-Ersatz, das diese fatalen Eigenschaften nicht besitzt, habe ich noch nichts gehört. n-Butanol ist auf jeden Fall besser.

Kennen Sie diese beiden Aufsätze?

http://www.klaus-henkel.de/isomethode.pdf

http://www.klaus-henkel.de/paraffin-intermedien.pdf

Auch wer die Isomethode nicht anwenden mag, wird doch in der Beschreibung etliche Anhaltspunkte für Fehlerquellen finden.

Abgesehen vom bisher gesagten: Es gibt Pflanzenorgane, die sich mit weder mit Paraffinmischungen einbetten noch schneiden lassen. Muß man probieren, nachdem man mit anderen Pflanzen und Blöcken Erfolg hatte.

Also: Viel Erfolg!
KH

[hajowemo]

Hallo ihr Lieben,
herzlichen Dank für eure Anregungen, sie bringen mich immer ein Stückchen weiter.
Ich selber habe im Romeis (18.Auflage) Seite 126 eine Tabelle gefunden mit dem Thema:
Probleme und Artefakte bei der Schnittpräparation und ihre Abhilfe.
Es gibt eine passende Zeile:
Problem:  Gewebe löst sich aus dem Paraffin
Ursache:  Gewebe war beim Ausgießen zu kalt; Gewebe ist noch alkoholhaltig
Abhilfe:    Block einschmelzen und neu ausgießen; Evtl. Gewebe nochmals zurückführen - Schaden lässt sich nur teilweise beheben.

Ich hatte mehrere Blöcke in einem Arbeitsgang erstellt und werde diese jetzt nacheinander ausprobieren.
Da die Härte des Paraffins beim Schneiden eine Rolle spielt, stellt sich die Frage: "Welche Temperatur sollte der Block beim Schneiden haben?"
Bis jetzt habe ich immer mit Zimmertemperatur gearbeitet, also ca. 20°C.

Ich habe zwei Blöcke geschmolzen und neu ausgegossen.
Liebe Grüße
Jochen

[hajowemo]

Hallo Forum,
Als Nachtrag zu meinem Problem ist zu sagen, dass ich die Blöcke eingeschmolzen und neu gegossen habe. Das Ergebnis ist zufrieden stellend.

Foto 1: 20µm-Schnitte erstellt.



Foto 2: Schnitt aus dem Streckbad herausgefischt:



Foto 3: Trocknen der Schnitte auf der Wärmebank.



Für eure Anregungen möchte ich mich nochmals bedanken.
Liebe Grüße
Jochen