Luftbläschen beim dauerpräparieren

Begonnen von Flowrida, Februar 11, 2015, 16:44:13 NACHMITTAGS

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Flowrida

Hallo liebe Mikroskopiker,

langsam bin ich echt am verzweifeln. Nachdem ich mir ein Zylindermikrotom und drei verschiedene Eindeckmittel (Opticanol, Entellan, Includal A) besorgt habe, wollte ich mich nun ans dauerpräparieren von Pflanzenschnitten heranwagen. Leider entstehen bei mir immer hässliche kleine Luftbläschen innerhalb der eingedeckten Schnitte und zwar bei ALLEN DREI Eindeckmitteln. Meine Frage ist also was ich falsch mache oder ob meine Mittel einfach nichts taugen.
Hier meine Anleitung nach der ich meine frischen (ca.50 um dicken) Schnitte behandle:
-Sofortiges färben der Schnitte nach folgender Anleitung: http://www.aeisner.de/methoden/farb1.html
- entwässern in steigender Ethanol-Reihe: 30%, 50%, 70%, 80%, 96% (jeweils 5 min)
-Intermedium: 5min in Xylol
-Einschluß in eines der oben genannten Eindeckmittel durch einlegen des Schnittes in einen dicken Tropfen des Eindeckmittels und auflegen eines Deckglases (30° Winkel, warten bis Eindeckmittel schön verteilt ist, Deckglas andrücken)

Ich verstehe wirklich nicht wo der Fehler liegt ???

etwas genervte Grüße

Flo

P.S. Ist Includal A bei euch auch braun und wird nicht fest? :0
Mikroskope
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Fahrenheit

Lieber Flo,

dazu fällt mir folgendes ein:

Die Schnitte sollten vor dem Färben für mindestens 20 Minuten mit AFE fixiert werden (90 ml Ethanol 70%, 5ml Formaldehyd 36% und 5ml Essigsäure 99 %).  Zur Not reicht auch Ethanol 70% alleine.

Zum Färben schrittweise in Aqua dest. überführen (70% Ethanol, 50% Ethanol, 30% Ethanol, ggf. noch mal 15 oder 10 % Ethanol ....).
Bei stabilen Schnitten reicht auch eine zweifache Spülung mit Ethanol 70% und anschließend vorsichtiges Eintropfen von Aqua dest. Die Schnitte werden tanzen, feines Material kann reissen. Danach zwei mal spülen in Aqua dest.

Nach dem Färben ggf. mit Ethanol 70% unter Lupenkontrolle differenzieren

Dann spülen mit reinem (!) Isopropanol (mehrfacher Wechsel, 3 * reichlich und sofort wieder abziehen, 2 * 1 Minute, 2 * 5 Minuten)

Von da kann sofort in Euparal eingedeckt werden

Für Enthellan ist Xylol das Intermedium (1 * 5 Minuten reicht)
Mit Opticanol und Includal A habe ich keine Erfahrung.

Wenn Du Fragen hast: immer gerne! :)

Herzliche Grüße
Jörg

Wenn Du stöbern magst: Bibliothek Botanische Mikrotechnik auf der Webseite des MKB.
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Herbert Dietrich

Hallo Flo,

wenn Du schon Xylol als Intermedium verwendest, dann probiere es doch mal mit Kanadabalsam z.B.
http://www.ebay.de/itm/Canadabalsam-kunstlich-50-ml-118-00-EUR-Liter-/181652336418?pt=LH_DefaultDomain_77&hash=item2a4b52af22

Bläschen verschwinden bei mir innerhalb kurzer Zeit, 1-2 Tage und der Balsam ist auch glasklar.
Falls Du bekommst kannst Du auch den guten alten Caedax verwenden.

Herzliche Grüße
Herbert

Bernhard Lebeda

Hallo Flo

viele Bläschen verschwinden nach ein paar Tagen trocknen auf einer Wärmebank. Ich mach das gerne in so einem Joghurtbereiter:

http://www.mediamarkt.de/mcs/product/SEVERIN-JOGHURT-FIX-WEISS-GRAU-JG-3516,48353,459571,918667.html?langId=-3&gclid=CNLkyeGo2sMCFYHHtAodsQ8ARg


Das Eindeckmittel zieht ja noch etwas an, bzw. LöMi verdunstet. Die Färbungen sind dann auch viel klarer und brillianter!

Viele bläschenfreie Mikrogrüße

Bernhard
Ich bevorzuge das "DU"

Vorstellung

Rawfoto

Lieber Flo

Bei einigen wenigen Schnitten habe ich auch das Problem, wuerde sagen 0,2% Fehlerquote. Das war aber einmal anders, wuerde sage 10% ...

Ein gesentliches Kriterium ist das Auflegen des Dekglases, auf einer Seite auflegen, langsam absenken ...
Dann kommt die Temperatur, ich decke mit 35 bis 40 warmen Eindeckmittel ein ...
Dann kommt ein Gewicht drauf (Magnet oder Schrauben mit Muttern als Gewicht ...
Bei besonders feinen Strukturen, vor dem Eindecken kurz in den Exi, Unterdruck, dann eindecken ...
Die Viskositaet des Eindeckmittels muss stimmen, nicht zaehfluesseg ...
Im Waermeschrank aushaerten lassen
Duenner schneiden, 0,03 bis 0,025 geben die besseren Bilder, bei UV-Anregung deutlich duenner ...

Liebe Gruesse

Gerhard
Gerhard
http://www.naturfoto-zimmert.at

Rückmeldung sind willkommen, ich bin jederzeit an Weiterentwicklung interessiert, Vorschläge zur Verbesserungen und Varianten meiner eingestellten Bilder sind daher keinerlei Problem für mich ...

JoachimHLD

Hallo Flo,

Das Includal A welches ich kenne ist fast ganz klar, Konsistenz von Honig und ist wasserlöslich, d.h. kein Entwässern und kein Xylol.
Probier doch Eurparal wie Jörg schon geschrieben.

Viel Spass
Joachim

Klaus Henkel

Und vor allem: Nicht das Deckglas "andrücken", ganz egal auf welche Weise das geschieht. Falls zu viel Einschlußmittel genommen wurde: Das nächste Mal weniger nehmen, dann braucht man das Deckglas nicht anzudrücken.

Viel Erfolg
KH

Fahrenheit

Lieber Präparatoren,

genau die richtige Menge Einschlußmittel unter das Deckglas zu bekommen, ist natürlich eine Kunst, die allerdings bei vergleichsweise dicken Schnitten (ich schneide ebenfalls 50 µm dick) schwieriger wird.

Hat man zu viel Einschlußmittel erwischt, besteht ohne ein Andrücken jedoch die Gefahr, dass der Schnitt nicht plan am Deckglas anliegt, was die Beobachtung erschwert. Dies gilt insbesondere für die spätere Betrachtung mit höher vergrößernden Objektiven, die nur eine vergleichsweise geringe Schärfentiefe aufweisen.

Drückt man allerdings zu fest an, können Luftbläschen entstehen und es besteht natürlich die Gefahr, dass der Schnitt reisst.

Ausserdem quillt das überschüssige Einschlußmittel natürlich unter dem Deckglas hervor, was die Makrooptik des Präparates beeinflusst (sieht galt nicht so schön aus ... :) )

Trotzdem: ich beschwere meine Präparate während der Trockenphase sogar. Je nach Art des Objekts mit einer 8er Mutter (für runde 18er Deckgläser)  bis zu Gewichten an die 20 Gramm. Auch kleine Magnete haben sich bewährt - hier ist aber besondere Vorsicht bei der Auswahl (nicht zu stark!) und dem Auflegen nötig, da sonst das Deckglas beschädigt werden kann ...

Mit etwas Übung bekommt man das aber in den Griff: ausreichend wenig Einschlußmittel und nicht zu starker Druck. Wenn man einen Glasstab zum Auftrumpfen benutzt, sollte die Vorratsflasche dabei immer zeitig nachgefüllt werden, um in Etwa immer den gleichen Füllstand zu haben, das macht die Dosierung einfacher. Bei mir hat sich das auf "drei Tropfen in die Flasche, der vierte auf das Präparat" eingependelt, was natürlich auch von der Dicke des Glasstabes und der Viskosität des Einschlußmittels  abhängt.

Noch eine Lanze für das Euparal: Es kann einfach mit reinem (!) Isopropanol wieder auf die gewünschte Konsistenz gebracht werden, wenn es mal etwas eingetrocknet ist und es ist sehr tolerant gegenüber etwaigen verbliebenen Luftblasen (diese verschwinden meist recht schnell, sie werden regelrecht absorbiert). Größere, frei bewegliche Blasen wandern in der Regel während ein oder zwei Tagen an den Rand und entweichen.
Ausserdem gibt es auch keine Probleme mit einer geringen Restfeuchte im Präparat. Diese ist jedoch einfach vermeidbar, in dem man mit reinem Isopropanol ausreichend entwässert. Zumal die Farben - insbesondere die Rottöne - je nach Färbung ziemlich empfindlich sind und bei vorhandenem Restwasser ausbluten ...

Herzliche Grüße
Jörg
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Rawfoto

Guten Abend

Wenn der Magnet zu stak ist kann man das mit einer Papier/Kartonzwischenlage unter dem Objekttraeger gut einstellen ...

Wenn man zu viel Eindeckmittel verwendet hat kann man das herausgetretene Eindeckmittel vorsichtig wegputzen ...

Liebe Gruesse

Gerhard
Gerhard
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Bernd Miggel

Hallo Bernhard und alle anderen,

mit so einem preisgünstigen Joghurtbereiter habe ich beim Aushärten von Euparal-Eindeckungen gute Erfahrungen gemacht.
Es ist vorteilhaft, dass man im Innenraum des Bereiters so viel Platz hat. Man kann problemlos 20 oder mehr OTs gleichzeitig aushärten lassen. Übernacht ist dann alles fertig!
Interessant könnte das Teil auch für die PEG-Freunde sein:
Bei einer Umgebungstemperatur von 19 Grad Cel. messe ich im Behälter:

52 Grad direkt auf dem Bodenblech,
44 Grad in 1 cm Höhe
39 Grad in 2 cm Höhe
35 Grad in 3 cm Höhe über dem Bodenblech.

Bei 22 Grad Umgebungstemperatur schmilzt PEG 4000 so gerade (im Uhrenglas direkt auf dem Bodenblech).

lg
Bernd

Peter Reil

Hallo Floh,

ich kann die Erfahrtungen meiner Vorredner nur bestätigen.  Am meisten Fehler macht man beim Auflegen des Deckgläschens.
Bei Benutzung einer Stereolupe kann man viele Luftblasen vorher entdecken und "zur Seite schieben).

Bei mir geht es (fast immer) problemlos mit Euparal und Hydromatrix.

Bei Glyceringelatine schaffe ich es selten (leider!), ohne Luftblasen einzudecken. Da fehlt mir noch immer der "richtige Tipp".

Freundliche Grüße
Peter
Meine Arbeitsgeräte: Olympus BHS, Olympus CHK, Olympus SZ 30

Rawfoto

Guten Abend

Bevor das Deckglas aufgelegt wird kann man den im Eindeckmittel liegenden Schnitt Unterdruck aussetzen, dabei entweichen die Luftblasen (wechselnde Druckverhältnisse sind ideal ...

Das Wundermittel heißt Exsikkator, ob mit der manuellen pumpe oder der Vakuumpumpe gearbeitet wird ist eine Frage der Bequemlichkeit, beides funktioniert bestens ...

Das schützt aber natürlich nicht vor Luftblasen die man mit dem Deckglas hineindrückt, beim schrägen Auflegen bildet sich aber eine Flüssigkeitsbrücke die es verhindert das Luftblasen entstehen - Voraussetzung, langsames Absenken und verhindern das das Deckglas dabei ins Rutschen kommt ...

Liebe Grüße

Gerhard

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Dünnschliffbohrer

Danke Gerhard, für den Hinweis.

Ich hatte das Problem auch immer, und habe jetzt auf deine Anregung hin mit einem Diamantwerrkzeug mit der Kleinbohr-Schleif-Maschiene (sog. "Dremel") ein Schraubdeckelglas angebohrt. Durch das Loch stecke ich eine 50 ml Spritze, und abgedichtet wird das ganze einfach mit etwas Knetmasse um das Loch. Man bekommt damit kein Vakuum wie mit einer Wasserstrahlpumpe hin, aber einmal kurz aufziehen reicht, um aus dem noch nicht abgedeckten Präparat die Bläschen aus dem (auf dem Objekttträger befindlichen) Tropfen des Einbettungsmittels auszutreiben.

Wenn man dann den Objekträger wieder herausnimmt, so umdreht dass der Tropfen jetzt nach unten hängt, und das Präparat  dem auf einer erhöhten Stelle (z.B. einem Flaschenschraubverschluss oder den Deckgläschenkästchen) zurecht gelegten liegenden Deckgläschen annähert, bis bei dem direkten Kontakt des Hängenden Tropfens das Deckgläschen von dem Tropfen angezogen wird, dann ist der Schnitt blasenfrei eingedeckt. Hört sich umständlich an, ist aber ganz einfach (besser als das Deckläschen kippend auf den Objelkttrger fallen zulassen).
"Und Gott sprach: Es ist nicht gut, daß der Mensch allein sei; und er schuf um ihn Laubmoose und Lebermoose und Flechten und ein Mikroskop!"
[aus: Kleeberg, Bernhard (2005): Theophysis, Ernst Haeckels Philosophie des Naturganzen,  S. 90]

mikropit

Hallo, Bodo baut kleine Unterdruckgeräte mit Spritze zum Vakuum erzeugen. Ca. 5 € eine komplette Einheit. + Versand
Wenn dann die Schnitte absinken ist die Luft raus.
VG Peter - mikropit
mikropit

güntherdorn

#14
bilder von bodo´s spritzen-pumpe die mikropit erwähnt:
- gerne per du -
günther dorn
http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=444.0
www.mikroskopie-gruppe-bodensee.de
gildus-d@gmx.de