Wie organische Knochensubstanz auflösen

Begonnen von plaenerdd, März 29, 2015, 22:35:16 NACHMITTAGS

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plaenerdd

Hallo,
ich möchte einen Dünnschliff durch einen Knochen machen. Im Schlüter wird empfohlen Knochen zu benutzen, die schon so lange draußen lagen, dass alle organische Substanz aufgelöst ist. Gibt es eine Möglichkeit die aus frischen Knochen heraus zu bekommen, vielleicht mit Wasserstoffperoxyd wie bei den Diatomeen?

Ich habe bis jetzt zwei Flächen eines Rohrenknochen vom Rind (typischer Suppenknochen-Ring) plan geschliffen bis Körnung 600 und jeweils einen Längs- und einen Querschnitt von ca. 1,5mm Dicke mit der Laubsäge abgetrennt. Zum Entfetten schwimmen die Streifen gerade in Benzin, aber ich hätte gerne die pure mineralische Knochensubstanz.

Beste Grüße
Gerd
Fossilien, Gesteine und Tümpeln mit
Durchlicht: Olympus VANOX mit DIC, Ph, DF und BF; etliche Zeiss-Jena-Geräte,
Auflicht: CZJ "VERTIVAL", Stemi: MBS-10, CZJ SMXX;
Inverses: Willovert mit Ph

hebi19

Zitat von: Safari in März 29, 2015, 22:59:29 NACHMITTAGS
: Salzsäure.

Neee - dann ist der Kalk, also die reine mineralische Substanz mit Sicherheit weg und es bleibt der organische Teil (Knorpel) übrig - und den kann man ja gerade nicht schleifen - Salzsäur nimmt man, um den Knorpel übrig zu behalten und daraus z.B. Knochenleim zu kochen.
Grüße von
Martin alias hebi19

Motic BA-300, div Lomo, Stereo-Mikroskop noname

the_playstation

Hallo Gerd.
Messermacher kochen Knochen relativ lange, um daraus Griffschalen herzustellen, wenn ich mich richtig erinnere. In entsprechenden Messerforen solltest Du detaillierte Anleitungen finden.
Liebe Grüße Jorrit.
Die Realität wird bestimmt durch den Betrachter.

Dypsis

Hallo Gerd,

ich brauche gelegentlich auch "nichtmehrstinkende" Knochen. Wenn man sie einfach eine weile in Waschpulver und oder Spülmaschninenspülmittel kocht, dann ist Schluss mit jedem Geruch. ich vermute, dass damit auch jede organische Substanz weitgehend entfernt ist. Spülmaschienenspülmittel ist ziemlich gründlich.

Grüße
Thomas
Ich bevorzuge das forumsübliche Du!

knipser009

hallo Gerd

um die Knochenkomponenten zu erhalten, gibt es die klassischen Schulversuche :

Beweis für die elast. Komponente, den Knorpel : 
   Knochen ca 2 Tage in verd. Salzsäure legen -  anorgan. Substanz ("Kalk") löst sich auf

Beweis für die anorgan. Substanz ("Kalk") :
   Knochen über dem Bunsenbrenner stark erhitzen - Knorpelmasse verbrennt und die Knochenbälkchen bleiben übrig.
Viele Grüße aus dem SaarPfalzKreis

Wolfgang
gerne per "Du"

wilfried48

Hallo Gerd,

wieso willst du die organische Substanz für einen Dünnschliff entfernen ? Dadurch wird das ganze doch nur poröser und schlecht schleifbar.

Wenn du einen guten Dünnschliff erhalten willst musst du die Knochenstücke fixieren (z.B. Formaldehyd), entwässern und entfetten (Alkohohlreihe, Aceton, Xylol (oder Ersatz Rotisol), einbetten (infiltrieren) in Epoxydharz und dann dünnschleifen.

Hier eine Anleitung wie man z.B. bei der Darstellung von Implantaten im Knochenschliff vorgeht:
www.struers.de/resources/elements/12/38873/e-Structure%206_DT.pdf

viele Grüsse
Wilfried
vorzugsweise per Du

Hobbymikroskope:
Zeiss Axiophot,  AL/DL/Ph/DIC/Epi-Fl
Zeiss Axiovert 35, DL/Ph/DIC/Epi-Fl
Zeiss Universal Pol,  AL/DL
Zeiss Stemi 2000 C
Nikon Labo-/Optiphot mit CF ELWD Objektiven

Sammlung Zeiss Mikroskope
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=107.0

JB

Zitat von: plaenerdd in März 29, 2015, 22:35:16 NACHMITTAGS
Im Schlüter wird empfohlen Knochen zu benutzen, die schon so lange draußen lagen, dass alle organische Substanz aufgelöst ist. Gibt es eine Möglichkeit die aus frischen Knochen heraus zu bekommen, vielleicht mit Wasserstoffperoxyd wie bei den Diatomeen?

Ich vermute, dass Schlüter die Knochen lagert, um die grobe organische Substanz (Fleisch, Knochenmark) aufzuloesen. Dafuer eignen sich auch Waschmittellauge oder eine Steckkaeferkultur ;) Die Proteine in der Knochenmatrix, insbesondere Collagen, werden so nicht beseitigt. Collagen im Knochen ist SEHR langlebig; die 14C-Datierung von Knochen beruht auf der Extraktion des "Collagens" aus dem archaeologischen Material, soweit ich das verstehe.

Selektiv Collagen zu entfernen und nur die mineralische Substanz zu hinterlassen geht durch Ausgluehen (unter Verlust der Feinstruktur) oder durch Behandlung der polierten Schnitte mit Collagenase: Green et al. (1985) Bone microstructure by collagenase etching. Biomaterials 6:150-2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2988660
Mit dem Suchbegriff collagenase etching finden Sie sicher weiteres Material.

Selbst diese Methode scheint aber nur die oberflaechennahen Collagene zu entfernen (deshalb "Aetzung"); laut den Autoren finden sich Kanaelchen von bis zu 200 nm dort, wo die Collagenfasern entfernt wurden. Die Verbindung von mineralischen Komponenten und Collagen ist naemlich so intim, so kleinskaliert http://www.nature.com/ncomms/journal/v4/n4/images/ncomms2720-f1.jpg , dass sich dies mit dem Lichtmikroskop gar nicht sinnvoll analysieren laesst.

Beste Gruesse, Jon

wilfried48

#7
Zitat von: JB in März 30, 2015, 01:30:29 VORMITTAG
... Die Verbindung von mineralischen Komponenten und Collagen ist naemlich so intim, so kleinskaliert http://www.nature.com/ncomms/journal/v4/n4/images/ncomms2720-f1.jpg , dass sich dies mit dem Lichtmikroskop gar nicht sinnvoll analysieren laesst.

Hallo,

natürlich braucht man für die Strukturanalyse der Collagen/Hydroxylapatit Verbundmatrix die Transmissionselektronenmikroskopie.
Die Hydroxylapatit Kristalle haben Abmessungen von ca. 15 x 40 nm und die Bandstruktur der Kollagenfibrillen liegt in ähnlicher Grössenordnung.
Mit Lichmikroskopie wird man da also nicht weit kommen. Aber ich denke auch dass Gerd eher die mikroskopische Struktur (z.B. Haversche Kanäle)
sehen will und nicht die Nanostruktur.

viele Grüsse
Wilfried
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l'œil armé

#8
Moin,

ich habe sowas fürs REM schon mal gemacht um den Kalkauf- und -abbau in den Knochen von mit unterschiedlichen Steroid-Präparaten behandelten Ratten zu zeigen. Zunächst die Knöchelchen im frischen Zustand mit scharfem Messer (Mikrotomklinge o.ä.), kleiner Säge oder auch durch schleifen auf Schleifpapier so zurichten, dass man die erforderlichen Abmessungen erreicht und anschließend in Kalilauge einlegen. Nach ein paar Tagen (in Abhängigkeit von der Größe des Knochenstücks) bleiben lediglich die Kalkstrukturen übrig, können gewaschen und getrocknet und für das REM vorbereitet werden. Vorsicht, das kleine Gebilde das da übrigbleibt ist äußerst fragil.

Man kann aber auch vorher bereits den Prozess unterbrechen, wenn alle äußerlich anhaftenden Weichteile zersetzt sind, dann spülen, evtl. fixieren - ich habe damals nur getrocknet. Danach lassen sich die Knochenteile durchaus von Hand zunächst auf Wasserschleifpapier zuletzt bis zur 800er Körnung erst auf der einen Seite planschleifen, mit Zweikomponisten-Klebstoff auf einen Objekträger kleben ( ich benutzte seinerzeit wegen der größeren Stabilität Gießener Objektträger) und bis zur Durchsichtigkeit herunterschleifen, eindeckeln, fertig. Man muss erst ein wenig üben, aber man kann so durchaus gleichmäßige Schliffe bis zu 30-40 Mikrometern Dicke erhalten. Ich selbst habe die allerdings für die Fluoreszenzmikroskopie angefertigt, um durch Fütterungsgabe von Fluoreszenz-Farbstoffen in den Knochen Wachstumsphasen sichtbar zu machen. Im Auflicht benötigt man dann natürlich nicht derart dünne Schliffe, ich habe es dennoch mal ausprobiert, wie weit ich mit dieser Methode herunterkommen kann.

Der umgekehrte Weg geht natürlich auch: Um an ein normal histologisch schneid- und färbbares Präparat zu kommen, wird der Knochen mit EDTA oder nach meiner Erfahrung besser, mit Trichloressigsäure entkalkt, anschließend eingebettet und geschnitten. Hierbei sind dann einigermaßen problemlos Schnitte bis herunter zu 3-5 Mikrometern möglich. Schneiden sollte man mit schräggestelltem Messer im ziehenden Schnitt, sonst gibt es u.U. Schwierigkeiten mit Falten. Fixieren braucht man nach dem Entkalken mit Trichloressigsäure kaum oder garnicht, da diese bereits eine fixierende Wirkung hat. Allerdings gilt es, Schrumpfungen zu minimieren, aber da müsste ich noch einmal in alte Protokolle schauen. Vorausgesetzt ich finde sie noch, weil diese Arbeit bereits 12 oder gar 14 Jahre zurückliegt. Es gibt aber wunderbare Färbungen, z.b. eine Pentachromfärbung, die die Lage und Ausrichtung der Collagenfasern zeigt und auch eine, die die ursprünglich verkalkten Strukturen sehr spezifisch einfärbt.

Freundliche Grüße

Wolfgang

p.s.: es könnte sogar sein, dass ich noch ungeschnittene Blöckchen liegen habe, fällt mir gerade ein

"Du" fänd' ich absolut in Ordnung

das schönste: Zeiss Lumipan
das liebste: Leitz Ortholux/Panphot
das beste: Zeiss Axiomat

Ich bin übrigens keineswegs mit meinem Umfang an Intelligenz zufrieden; ich bin lediglich froh, mit meiner Dummheit so weit gekommen zu sein.

plaenerdd

Hallo,
herzlichen Dank allen Antwortenden. Es ist in der Tat so, dass ich die mineralischen Strukturen mit dem Polmikroskop ansehen möchte. Tja, warum die organische Substanz weg? Weil ich eben im SCHLÜTER gelesen habe, dass man dazu am besten alte Knochen nimmt, wo das weitestgehend fehlt, ich aber nur frische habe. Ich habe inzwischen auch eine andere Quelle gefunden, in der Knochendünnschliffe beschrieben sind: R. DREWS "Mikroskopie als Hobby". Er schreibt. "Säubern Sie zunächst das Objekt von allen organischen Bestandteilen, indem Sie es in verdünnte Natronlauge oder in eine Sodalösung legen. Anschließend müssen Sie das Teil gründlich wässern (mehrmaliger Wechsel über mehrere Tage) und dann trocknen lassen" Danach soll in Epoxitharz eingebettet, gesägt und geschliffen werden. Das ist sicher die edelste Methode, aber mit dem Epoxitharz, möglichst unter Vakuum verarbeitet, wollte ich jetzt nicht noch anfangen.

@ Jorrit: Die Messermacher brauchen einen stabielen Knochen, der aber möglichst weiß sein soll (also entfettet, aber sehr wohl mit der organischen Substanz, die dem Knochen seine hohe Elastizität gibt. Wenn die Knochen selbst zu Werkzeugen verarbeitet werden (Pfeilspitzen, Knochennadeln, Falzbein) muss auch das Fett drin bleiben, auch wenn es mit der Zeit zu einer Gelbfärbung führt.

Ich werde mal versuchen, das organische drin zu lassen und nur zu entfetten, da ich fürchte, dass sonst der Schliff nicht auf dem Objektträger hält.

Die Idee mit dem Fixieren gefällt mir auch. Ob es auch mit hochprozentigem Alkohol geht? Ich habe kein Formol.

Zum Aufkleben wollte ich mit Eukitt arbeiten. In der (Gesteins-)Dünnschliffherstellung nimmt man ja wohl nur noch 2-Komponenten-Geschichten, von denen ich aber auch nichts da habe. Ich will jetzt nicht über Knochen forschen, sondern einfach mal einen dünn genug raspeln, dass ich ihn im Pol-Mik angucken kann. Da wollte ich mir kein zu umfangreiches Chemikalienlager anlegen.

Beste Grüße
Gerd
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Ulrich S

Moin moin,
schon mal darüber nachgedacht dafür auf fossile Knochen zurück zugreifen. Die sind immer auf diversen Börsen und im Netzt erhältlich und wenn Du nur Bruchstücke brauchst auch fürs kleine Geld.
Grüße
Ulrich
Es kommt immer anders wenn man denkt

plaenerdd

Hallom Ulrich,
ich habe selber schon einige fossile Knochen gefunden, unter anderem von Nothosaurus, aber die sind mir irgendwie zu schade...
Grüße
Gerd
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Bernhard Lebeda

#12
Zitat von: plaenerdd in März 30, 2015, 17:31:30 NACHMITTAGS


Ich werde mal versuchen, das organische drin zu lassen und nur zu entfetten, da ich fürchte, dass sonst der Schliff nicht auf dem Objektträger hält.

Die Idee mit dem Fixieren gefällt mir auch. Ob es auch mit hochprozentigem Alkohol geht? Ich habe kein Formol.


Hallo Gerd

wir (Ralf Wagner und Freunde) haben im Februar so einen Knochenjob-Sonntag veranstaltet und hatten  auch versucht uns vorher schlau zu machen wie man am einfachsten vorgeht. Nach allem was ich im Kremer und bei Romeis gelesen hatte, braucht man aufwändige Fixation und Entkalkung nur für Mikrotomschnitte und anschliessende Färbung. Fürs schleifen sollte einfache Vorbehandlung mit Alkohol reichen. Siehe z.B. Romeis:

" Schliffherstellung ohne Vorbehandlung:

Von mazeriertem Knochenmaterial, das von Weichgewebe
befreit ist, und von Zähnen können sowohl im nativen als
auch im fixierten Zustand durch Schleifen transparente
Präparate hergestellt werden.
Diese Präparate werden als Dünnschliffpräparate oder
Schliffe bezeichnet und haben eine Dicke von 50 bis 100
Mikrometern (Abb. 4.6). Sie informieren über den strukturellen Aufbau der verkalkten Bindegewebsmatrix und
geben indirekt und sehr klar Auskunft über die Gestalt der
am Aufbau der in der Hartsubstanz enthaltenen Zellen (v.a.
der Osteozyten)"



Ich erinnere nicht genau, ob Ralf FAE oder 70% Ethanol zu groben Fixierung benutzt hatte. Zum aufkleben haben wir UV Kleber benutzt. Die Resultate waren sehr ansehnlich!


Viel Glück denn

und Mikrogrüße

Bernhard
Ich bevorzuge das "DU"

Vorstellung

l'œil armé

Moin Gerd,

2-Komponenten-Klebstoff gibts im Supermarkt: UHUplus. Der reicht für die angestrebte Klebung voll und ganz aus. Wasserschleifpapier beim Autozubehörhandel, wenn die dort auch Lackiermaterialien vertreiben. das spannst Du über eine etwas dickere Glasplatte und los geht es. Entfetten kannst Du den Knochen äußerlich -mehr braucht es ja nicht zu kleben - auch sehr gut und schnell mit Wundbenzin. In UHUplus habe ich auch schon richtig eingebettet zum schleifen. Ich weiß, klingt alles nicht sehr wissenschaftlich, mein damaliger Chef wollte das auch erst nicht glauben und dann habe ich ihm doch nahezu 100 Präparate auf diese Art und Weise hergestellt. Schleife aber bitte unbedingt nass, sonst funktioniert das nicht.

Wenn man besonders fest kleben möchte, nimmt man UHUendfest 300 und erhitzt den aufgeklebten Knochen auf dem Objektträger im heimischen Backofen für 8-10Minuten auf 180Grad. Dann ist das Material auch sofort schleifbar. Mach Dir da nicht zuviel Gedanken, das funktioniert einigermaßen problemlos. Ein bisschen üben schadet allerdings nicht.

Freundliche Grüße

Wolfgang
"Du" fänd' ich absolut in Ordnung

das schönste: Zeiss Lumipan
das liebste: Leitz Ortholux/Panphot
das beste: Zeiss Axiomat

Ich bin übrigens keineswegs mit meinem Umfang an Intelligenz zufrieden; ich bin lediglich froh, mit meiner Dummheit so weit gekommen zu sein.

plaenerdd

Hallo Wolgang,
ich habe SiC-Pulver (60-120-220) fürs Grobe, dass ich nass auf einem schönen glatten Granit (ehemalige Fensterbank) benutze und 600 und 1000er Kourund für's Feine, das ich - natürlich auch nass - auf einer Glasplatte benutze. Gabs mal als Stein-Schleif-Starter-Set auf einer Mineralienbörse für 10,-€. Schätze, dass das noch grader wird als auf dem Papier bzw. Leinen.
Beste Grüße
Gerd
Fossilien, Gesteine und Tümpeln mit
Durchlicht: Olympus VANOX mit DIC, Ph, DF und BF; etliche Zeiss-Jena-Geräte,
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