Dapi-Färbung von Paraffin eingebettetem Gewebe (FFPE)

[Jacky91]

Hallo Zusammen,

meine Anfrage richtet sich grundsätzlich an alle, die generell Färbungen von Gewebe-Schnitten machen oder gemacht haben.

Wir haben das Problem, dass sich die Zellkerne auf unseren Gewebe-Schnitten für die in Situ Hybridisierung nicht
mit Dapi (Zytovision DAPI/DuraTec-Solution) anfärben lassen bzw. diese sehr matt aussehen.
Wir haben es mit verschiedenen Gewebeschnitten (z.B. Niere, Schilddrüse oder Hoden) von der Ratte probiert.
Auch an Schnitten (Hoden oder Schilddrüse) vom Menschen wurden Färbungen ausgetestet.
Wir bekommen immer wieder das selbe Ergebnis: eine trübe Färbung der Zellkerne in blau.
Diese ist in manchen Fällen am Rand des Gewebeschnittes grell blau (Zellkerne) und somit so wie man es erwarten würde.
Zur Mitte hin baut der Leuchteffekt wieder sehr stark ab und ist nur noch matt zu erkennen.
 
Hat jemand eventuell auch damit Erfahrungen gemacht, bei Dapi-gefärbten Schnitten und hat einen Rat für mich?

Danke schon mal an alle im Vorfeld, die zu diesem Thema etwas beizutragen haben!

Gruß, Jacky

[JB]

Hallo Jacky,

Koennen Sie bitte noch mehr Angaben zum Protokol machen (Fixierung, Einbettung, FISH, DAPI counterstain), in groben Zuegen? Ich nehme mal an, die DAPI-Faerbung wurde ganz zum Schluss, am Schnitt auf einem Objekttraeger, versucht?

Ganz wichtig: Hat es frueher mal geklappt oder ist das Ihr erster Versuch? Was sagen Ihre Kollegen dazu?

Niedriger pH-Wert (saures Fixiermittel) baut DNA ab. RNA-FISH enthaelt einen DNase-Schritt, auch da bleibt keine DNA uebrig, die mit DAPI gefaerbt werden koennte.

Funktioniert eine Kontrolfaerbung (Zellkultur oder Mundschleimhautzellen mit Aceton fixieren und gleich mit DAPI faerben)?

Beste Gruesse,

Jon

[Jacky91]

Hallo Jon,

ich habe das nicht zum ersten Mal gemacht, aber die Dapi-Färbung war von Anfang an nicht der Hit.
Wie ich schon erwähnt hatte ist das Merkwürdige, dass am Rand von jedem Schnitt sich die Kerne anfärben lassen und zur Mitte hin nicht.

Alle Gewebe, die später in Paraffin zu Blöcken gegossen werden, wurden vorher mit gepuffertem Formalin fixiert (pH 7,4).

Meine Positivkontrolle ist die einzige die gut funktioniert. Hierfür verwende ich eine Sonde die ich selbst gelabelt habe.
Als Schnitt nehmen wir ein Vorderbein einer Maus. Die Sonde lagert sich am Kollagen an und bindet spezifisch (Zytoplasmatisch).
Eine Dapi-Färbung findet lediglich an den Kernen statt. Innerhalb der Kerne lässt sich keine Färbung durch die RNA-Sonde nachweisen.

Einen Schritt mit Dnase gibt es beim labeling der RNA-Sonde, jedoch nicht beim in Situ Protokoll selbst.

Labeling:

1.) In ein Eppi.:
         1 µg lin. Plasmid (oder 200ng PCR-Produkt)
     + 2 µl 10 x Dig Labeling Mix  (Roche 11277073910)
     + 2 µl 10 x Transfer Buffer (Transcription Buffer (bei der Polymerase dabei))
     + 1 µl Rnase Inhibitor (Riboloc)

     auf 19 µl auffüllen (mit H20)

2.) Runter zentrifugieren falls nötig

3.) + 1 µl Polymerase (RNA Polymerase (T7/SP6))

4.) Inkubieren:
      37°C,  3h (auf dem Heizblock)
5.) + 1 µl Dnase und inkubiere auf 37 °C für 30 min (Ohne den 10X Buffer der dabei ist)

Optional: store at -80°C oder packe die Proben auf Eis und fahre fort mit der Fällung

Fällung:

7.) Zur Probe geben:
      +100µl TE-Buffer (Tris-EDTA)
      +10 µl 4 M LiCl
      +400 µl 100 % EtOH

8.)   1h , -80°C (vorsichtig mixen( länger auf -80°C geht auch))
9.)   Zentrifugiere bei 14000rpm auf 4°C für 10min.
10.)   Verwerfe die Flüssige Phase und füge 500µl 70%igen Ethanol hinzu
11.)   Zentrifugiere bei 14000rpm bei 4°C für 2min.
12.)   Verwerfe die Flüssigkeit und air-dry das Sediment
13.)   Pellet in 50 µl Wasser lösen, store – 80°C

Mein in Situ Protokoll:

Tag1:
              (1.)Defrost PFA before starting (zum Lösen ruhig auf 70°C erhitzen und den pH7,4 stellen),      pro Küvette immer 100ml Inhalt (2.) TEA ist sehr zäh und darum schon in einem 1,5ml Eppi bereit halten

1.)   Packe die Schnitte für 30min. bei 60°C #8 beim CISH-Hybrite und #9 beim FISH-Hybrite (zum Schmelzen des Paraffins und damit der Schnitt besser am Deckglas haften bleibt, deparaffinieren)
2.)   Die Schnitte auf Raumtemperatur abkühlen lassen
3.)   Die Schnitte kommen in eine Küvette mit Xylol für 10min. (dewaxing, unter der Hood machen)
4.)   Xylol verwerfen(im Lösungsmittelkanister)
5.)   Frisch ansetzen:  1.)25ml 10X PBS+175ml H20+50ml PFA 20% (für 2Küvetten)            oder                         2.) 4 mal 50ml 4%iges PFA, welches in 1X PBS gelöst ist für 2 Küvetten)
6.)   2min. in einer Küvette mit 99%igen Alkohol (rehydrieren)
7.)   2min. in einer Küvette mit 80%igen Alkohol (rehydrieren)
8.)   2min. in einer Küvette mit 50%igen Alkohol (rehydrieren)
9.)   2min. in einer Küvette mit 30%igen Alkohol (rehydrieren)
       10.)5min. in einer Küvette mit 1X PBS
11.)   10min. in einer 4%igen PFA Lösung (siehe 5.), unter der hood, PFA kann wieder in die Flasche und für Schritt 18.) verwendet werden, zum fixieren)
12.)   5min. in einer Küvette mit PBT waschen
13.)    A) 75ml PBS+15µl Proteinase K(aus dem 10ml Qiagen Fläschchen (braun) mit der   Konzentration von 20mg/ml für eine Endkonzentration von 4µg/ml) (In einem 200ml Zylinder mit Rührfisch ansetzen, dient dem Abbau von Proteinen)
          B)20min. bei Raumtemperatur in einer Küvette mit der Lösung aus13.A)(Verdau) 
14.)    Setze schon mal frisch an: 100ml H2O+250µl Essigsäureanhydrid+1,5ml TEA (Triethanolamin (alles fertig vom Hersteller und kann so pipettiert werden))
15.)   Proteinase K-Lösung verwerfen
16.)   5min. in einer Küvette mit PBT (100µl Tween20 zu 100ml PBS=PBT)
17.)   Verwerfe das PBT
18.)   5min. in einer Küvette mit 4%igen PFA (aus Schritt 11.)
19.)   5min. in einer Küvette mit PBT
20.)   Verwerfe das PBT
21.)   10min. in einer Küvette mit TEA-Mix aus Schritt 14.)
22.)   Besorge: Die Sonden aus dem -80°C Kühlschrank (kleine graue 6er-Box)
23.)   Verwerfe den TEA-Mix
24.)   5min. in einer Küvette mit PBT
25.)   Verwerfe das PBT
26.)   Nur kurz mit H2O waschen und kurz im Wasser stehen lassen (1-2min.)
Bis hier in der Küvette!!!
27.)   Die Slides auf die schwarze Platte (in Andreas Schublade) zum Trocknen stellen (air-dry)
28.)   Während die Slides trocknen: Den Hyb-Mix (zum Lösen immer erwärmen)auf 55°C erwärmen lassen im Wasserbad (für die NTC nur Hyb-Mix) und die RNA-Sonden auftauen lassen
29.)   Pro Slide werden 50µl Hyb-Mix+3µl RNA-Sonde gebraucht
        (in einem 1,5ml Eppi ansetzen)
30.)   Auf jeden Slide werden 53µl Hyb-Mix+Sonde aufgetragen
31.)   Jetzt mit Großen Coverslips bedecken und mit Kleber abdichten
32.)   Die Slides kommen jetzt in den Hybrite, wo das Papier schon mit Wasser befeuchtet ist
33.)   Auf 65°C über Nacht in den Inkubator  (Programm 7 im CISH-Hybrite oder Programm 5 im FISH-Hybrite)




Tag2:

(1.   Wasserbad auf 65°C stellen und Küvetten mit 5XSSC, 1XSSC+50%Formamid, 2XSSC und 0,2XSSC hineinstellen, 2. ein anderes Wasserbad auf 37°C vorheizen und Küvetten mit TNE-Buffer hineinstellen, 3. SSC immer mit H2O Verdünnen)
1.)   Slides aus der Box entnehmen, den Kleber abknibbeln und Coverslips entfernen
2.)   In eine Küvette mit 65°C warmen 5X SSC die Slides spülen=rinse (Küvette im Wasserbad bereit)
3.)   Verwerfe das 5X SSC
4.)   Wasche die Slides in einer Küvette mit 65°C warmem 1X SSC+50% Formamid (Mischungsverhältnis 1:1 und bereit in einer Küvette im Wasserbad) für 30min.  (Formamid muss gesondert entsorgt werden)                                                   
5.)   Während die Slides gewaschen werden : Taue den RNaseA Stock aus dem -20°C auf
6.)   Wasche für 10min. in 37°C TNE-Buffer (Küvette im Wasserbad) (Tris-HCl=1,57g, EDTA=0,372g, NaCl=29,22g und auf 1l mit H2O auffüllen)(nicht verwerfen und für Schritt 9.) wieder verwenden)
7.)   Verdaue, in einer Küvette, die Einzelstrang RNA in einer Lösung aus RNaseA gelöst in TNE Buffer (mit einer finalen Konzentration von 20mg/ml, für 30min. bei 37°C (füge 12µl RNaseA aus dem Stock 50mg/ml zu den 150ml TNE-Buffer)
8.)   RNaseA-TNE-Lösung verwerfen
9.)   In eine Küvette mit TNE für 10min. bei 37°C waschen (verwende den TNE-Buffer aus Schritt 6. wieder)
10.)   In eine Küvette mit 2X SSC für 20min. bei 65°C
11.)   Wasche 2 Mal mit 0,2X SSC für 20min. bei 65°C (in einer Küvette)
12.)   Setze schon an: TNT+0,2%H2O2 (6,6ml H2O2+93,4ml TNT(in einer Küvette))
13.)   Wasche 2 Mal in MABT für 5min. bei Raumtemperatur (jedes Mal MABT verwerfen(in   einer Küvette))
14.)   Wasche mit 2% H2O2 in TNT für 30min. bei Raumtemperatur (6,6ml H2O2+93,4ml TNT(in einer Küvette))
15.)   Wasche die Slides für 5min. in  TNT (in einer Küvette)
16.) Bereite den Hybrite vor mit feuchtem Papier
17.) Pipettiere 50µl TNB-Buffer auf jeden Slide und decke mit einem Coverslip ab und Kleber. Setze die Slides nun in den befeuchteten Hybrite für 1h (Blocking)
18.) Verdünne den Anti-Dig-POD 1:200 in TNB-Buffer = pro Slide 1µlAnti-DIG- POD+49µlTNB(Anti-DIG-POD wird mit 1ml TNB als Stock-Solution angesetzt)
19.)   Coverslips entfernen
20.)   Pipetiere 50µl des verdünnten Antikörpers (Anti-Dig-POD) auf jeden Slide. Bedecke nun mit Coverslips und Kleber.
21.)   Inkubiere die Slides über Nacht bei 4°C im Kühlschrank in den Boxen (im Dunkelen, in der Box welche mit Tüchern im Boden ausgelegt ist, die befeuchtet mit H2O sind)

TAG3:

1.)   Wasche 1 Mal für 5min. und 1 Mal für 10min. in TNT in einer Küvette
2.)     TSA-Plus-Kit: Fluorescein 1 : 100 im 1 x Amplification Reagents, 20min. , dunkle Box mit    Coverslips in Raumtemperatur (Fluorescin wird mit 150µl DMSO zur Stock_Solution, pro Slide 1µl Fluorescin+49µl 1X Diluent)
3.)   Coverslips entfernen
4.)   Wasche in 100ml 2%H2O2 in TNT für 5min. bei Raumtemperatur (6,6ml H2O2 + 93,6ml H2O)
5.)   Wasche 3 Mal für 5min. mit TNT in einer Küvette
6.)   Dapi von Zytomed auf das Coverslip drauf+ Immu-Mount von Thermo und so eindeckeln

Ich bedanke mich schon mal im Voraus.

Viele Grüße,

Jacky

[JB]

Hallo Jacky,

Auf Anhieb kann ich das Problem nicht finden. Mir fallen nur eine Reihe von Kontrollen ein, um dem Problem auf den Grund zu kommen.

Bevor wir damit anfangen, machen Sie den letzten Schritt (Tag 3, Punkt 6) so wie vom Hersteller beschrieben, fuer 15 min im nicht-abgedeckten Zustand? Wenn Sie zu frueh abdecken, wuerde nur der Rand gefaerbt werden.

"5. Instructions
After hybridization and wash steps of a FISH experiment, pipette
DAPI/DuraTect™-Solution (ultra) EjqUF onto the slide (for example 30 μl
onto an area of 24 mm x 60 mm). Avoiding trapped bubbles, cover the
samples with a coverslip and incubate in the dark for 15 min.

Carefully remove excess DAPI/DuraTect™-Solution (ultra) EjqUF by gently
pressing the slide between filter papers."

Beste Gruesse,

Jon

[Rene]

Hi Jon/Jacky,

Is proteinase K treatment on the sections a routine procedure that allows DNA staining?  I can imagine by removing all proteins from the nucleus, the DNA might subsequently wash out?
Just a question, no direct experience.

Best wishes, René

[d65]

Hallo Jacky,

was bedeutet denn "Dapi von Zytomed auf das Coverslip drauf" ganz genau? Ist das eine Färbelösung? Wie lange wird inkunbiert? Wird die wieder runter gewaschen? Welche Dapi-Konzentration wird verwendet? Hat diese Dapi-Lösung mal in irgend einem Präparat gut funktioniert? Nicht das sie hinüber ist.

Eins ist mal sicher, wenn der Antikörper ins Präparat reingeht, dann ist Penetration nicht das Problem.

Wenn Du schreibst "am Rand des Gewebeschnittes", dann meinst Du schon 'links oder rechts' und nicht oben und unten am Rand des Schnitts, oder?

Was Du testweise mal machen kannst, ist direkt nach Tag 1 "11.)   10min. in einer 4%igen PFA Lösung" eine Dapi-Färbung (1 µM, 10-30 min, Deckglas drauf und mit Trockenobjektiv 20-40x anschauen). Und wenn es da dann klappt nach soundsovielen Schritten immer mal wieder eine, um zu testen, wo das Problem auftritt.

Viel Erfolg
Steffen

[Jacky91]

Hallo Steffen,

also das was Du mir vorschlägst testweise zu machen habe ich auch versucht, nur mit dem Unterschied ich habe nach Tag 1. ''10.) 5min. in PBS''
mit Dapi gefärbt und das Deckglas drauf gegeben.

Um auf die Dapi-Färbung genau einzugehen:
Wir geben einen Tropfen Dapi auf das Deckgläschen und an den Rand einen Tropfen Einbettmedium von Immomount.
Den Objektträger mit dem Gewebeschnitt legen wir dann drauf und drücken ihn an. Das heißt wir lassen das Dapi drauf und waschen es nicht runter.
Das Funktioniert auch bei der beschriebenen Positivkontrolle. Das ist das Merkwürdige. Die Dapi-Lösung ist ''vorgemixt'' und gebrauchsfertig.
Über die Konzentration kann ich nix sagen. Wäre sie hinüber könnte man das sehen (Wechsel von klar zu leicht rosa), ausserdem haben wir auch eine neue Lösung
verwendet und es funktionierte auch nicht. 

Mit "am Rand des Gewebeschnittes", meine ich rechts und links richtig.

Viele Grüße
Jacky 

[d65]

Und hat die Färbung nach Schritt 10 denn geklappt? Dapi ist zwar nicht membrangängig, aber die Membran ist nach dem ganzen Alkohol vermutlich eh hinüber.

Kann es denn bei der Einbettungsmethode nicht passieren, dass das Einbettmedium die Dapi-Färbelösung schlicht verdrängt? Ich kenne es immer so, dass man das Präparat für z.B. 10 min in Dapi inkubiert, dann kurz wäscht und anschließend das Einbettungsmedium drauf gibt. Im gegebenen Fall würde sich vermutlich anbieten einen sehr großen Dapi-Tropfen zwischen OT und DG zu bringen, zu inkubieren und dann das Deckglas vorsichtig wieder abzuschwemmen, mit Puffer. Dann braucht man nicht so viel mehr Lösung wie bei der anderen Methode.
Viel Erfolg
Steffen

[JB]

Bevor wir damit anfangen, machen Sie den letzten Schritt (Tag 3, Punkt 6) so wie vom Hersteller beschrieben, fuer 15 min im nicht-abgedeckten Zustand? Wenn Sie zu frueh abdecken, wuerde nur der Rand gefaerbt werden.

"5. Instructions
After hybridization and wash steps of a FISH experiment, pipette
DAPI/DuraTect™-Solution (ultra) EjqUF onto the slide (for example 30 μl
onto an area of 24 mm x 60 mm). Avoiding trapped bubbles, cover the
samples with a coverslip and incubate in the dark for 15 min.

Carefully remove excess DAPI/DuraTect™-Solution (ultra) EjqUF by gently
pressing the slide between filter papers."

Wie sieht es denn damit aus?

[Jacky91]

@Steffen:
Die Positivkontrolle hat geklappt nach Schritt 10, die anderen Gewebeschnitte nicht. Das ist gerade das Merkwürdige.

Das es an der Einbettungsmethode liegen könnte haben wir uns auch überlegt und haben nur Dapi genommen ohne Immomount.
Das hat leider auch nicht funktioniert.

@Jon:
Das Werde ich mal versuchen.
Das Protokoll was ich geposted hatte war ein etabliertes.

@Rene:
I am not sure about that.

Danke an alle

[Jacky91]

Hallo Jon,

heute hat die Dapi-Färbung funktioniert.
Es lag tatsächlich daran, das ich direkt nachdem ich die Dapi-Solution auf das Gewebe gegeben hatte das Deckglas drauf gelegt hatte.

Vielen Dank 

[JB]

Super  Schoen, dass es wieder funktioniert!

[Jacky91]

Hallo zusammen,

meine Frage richtet sich diesmal in die entgegengesetzte Richtung und zwar wie bekomme ich es als Kontrolle hin, dass Dapi nicht meinen Schnitt anfärbt?

Ich mache folgendes:

1.)   Packe die Schnitte für 30min. bei 60°C (zum Schmelzen des Paraffins und damit der Schnitt besser am Deckglas haften bleibt, deparaffinieren)
2.)   Die Schnitte auf Raumtemperatur abkühlen lassen
3.)   Die Schnitte kommen in eine Küvette mit Xylol für 10min. (dewaxing, unter der Hood machen)
4.)   2min. in einer Küvette mit 99%igen Alkohol (rehydrieren)
5.)   2min. in einer Küvette mit 80%igen Alkohol (rehydrieren)
6.)   2min. in einer Küvette mit 50%igen Alkohol (rehydrieren)
7.)   2min. in einer Küvette mit 30%igen Alkohol (rehydrieren)
8.)5min. in einer Küvette mit 1X PBS

und jetzt müsste ich doch als Punkt 9.) rDNase I (1000U/ml) auf meinen Gewebeschnitt geben richtig?

10.)Dapi Bad für 2 bis 3min.

Meine Frage ist, wie lange und mit welche Konzentration gebe ich die DNase auf meine Schnitte um zu erreichen das Dapi nix mehr anfärben kann?
Ist an der Reihenfolge was falsch?

Wie bereits erwähnt ist das nur ein Kontrollschritt für mich.

Ich wäre sehr erfreut wenn mir jemand helfen könnte.

Viele Grüße,

Jacky