Osmiumtetroxid in Cacodylatpuffer oder in Wasser lösen?

[Nora]

Hallo zusammen!

Da sich hier doch auch einige "echte" Chemiker herumtreiben, möchte ich obige Frage stellen.
Wir machen hier normal nur Lichtmikroskopie, und leider ist mein Elektronenmikroskopiepraktikum so viele Jährchen her, daß ich mich an solche Details auch nicht mehr erinnere. Nun sollen aber ausnahmsweise mal ein paar unserer Schwämmchen fürs TEM fixiert werden, und dafür hab ich ein ziemlich umständliches Protokoll bekommen, mit vorfixieren in Osmium, zwei Fixierschritte mit unterschiedlichen Glutaraldehydkonzentrationen, und nochmal nachfixieren mit Osmium. Leider hab ich warum auch immer übersehn daß es bei Roth auch schon gelöstes Osmiumtetroxid gibt und das kristalline bestellt. Ich weiß daß das ein eklig gifitges Dreckszeug ist, habe aber hier ein ausgerüstetes Unilabor zur hand und werde damit umgehn können (hoffe aber dennoch daß das hier keine Routine wird...). Unsicher bin ich mir dabei, ob ich das Osmiumtetroxid in Wasser löse (so wie im Romeis beschrieben), oder gleich im 0,07molaren Natriumcacodylatpuffer mit 1,4%Salinität, in dem es im Endeffekt zum Einsatz kommen wird. Ich habe nur 100mg bestellt die ich für diese hoffentlich einmalige Fixierung auch aufzubrauchen gedenke. Allerdings wird das abwiegen solch kleiner Mengen Cacodylat auch eher popelig, und den Puffer brauch ich für diverse Waschschritte sowieso, drum würd ich den gern vorher in entsprechend größerer Menge ansetzen, möchte aber natürlich auch nicht, daß wasweißichwas passiert, wenn ich das Osmium drin löse... 
Also Dank an alle konstruktiven Antworten!

Nora

[Rene]

brr, quite a protocol. I don't see a problem with OsO4+cacodylate if you use it all. It is generally stored in water as a stock, and then mixed with buffers. BTW, does it mention a wash step in between OsO4 and aldehyde steps?
What kind of Schwämmchen ar you talking about? Mushroom gills? You might get away with a OsO4 vapour pre-fix before the aldehyde steps.

HTH, René

[Nora]

Hi Rene,
Danke für Deine rasche Antwort! Ich schreib mal auf Deutsch weiter weil das für mich schneller geht, hoffe das ist OK.
Die "Schwämmchen" sind Echte Schwämme, also marine sponges, im mm-bereich von der Größe, daher die Verkleinerung, die nichts mit Pilzen zu tun hat... An dem Protokoll werd ich so wie es ist festhalten müssen, da es von den Kollegen so erprobt und publiziert ist, mein Chef es deshalb so möchte und es sich hoffentlich um eine einmalige Angelegenheit handelt, die ich nicht weiter optimieren brauche.
Das komplette Protokoll sieht iü so aus:

Fixative: 1% osmium tetroxide in cacodylate buffer (0.07 mol/l, salinity
1.4%, pH 7.4). Cacodylate buffer was used in all stages of fixation.

Prefixation:  1 ml of fixative mixture added to 3 ml seawater containing
a sponge fragment for three minutes.

Next step: 4 ml of 4% glutaraldehyde in cacodylate buffer for 15 minutes
on ice in the dark.

Then 2% glutaraldehyde for one hour on ice.

Rinse samples twice in buffer.

Postfixation in 1% osmium tetroxide for one hour at room temperature.

Washed twice for 10 minutes in the cacodylate buffer.

Dehydration in a graded ethanol series.

Ich werds dann wohl direkt im Puffer lösen, wenn nicht noch ein Aufschrei kommt, bevor die Lieferung da ist. Ich seh ja auch nicht was passieren sollte, aber ich hatte Chemie nur im Nebenfach und das ist auch einfach schon zu lange her...

[Rene]

Deutsch is ok, it's just that for me it's easier to write in english. It's a long time since I've used solid OsO4, and I remember it does dissolve slowly! OsO4 is reduced by almost everything, so in retrospect  I do think you're better of making a stock in water, and add double strength cacodylate just before use, just to be sure.

Good luck,
René

[Silber_und_Licht]

Moin Nora,

wieso Du zum Schluss auch noch in Puffer wäschst ist mir nicht ganz klar?? Auswaschen ist sicher eine gute Sache, aber dann bitte auch die Puffersalze. Die Proben sind fixiert und als Nächstes bringst Du sie in die Aceton oder Alkoholreihe. Das Einzige was man sich dadurch meiner Meinung nach einhandeln kann sind auskristallisierte Pufferreste auf den Proben. Ich würde schon als Zweitfixation die Osmiumsäure nicht mehr in Puffer lösen. Ich habe das vor Zeiten mal ausgetestet, weil es mir nicht einleuchten wollte (wir haben das immer so gemacht) und konnte keinerlei Nachteile im EM sehen.

Freundliche Grüße

Wolfgang

[Nora]

Danke noch für die weiteren Antworten!
Dann lös ichs in Wasser (Ja, es soll mindestens einen Tag vorher angesetzt werden steht im Romeis). Der GA ist auch schon eine Lösung, da muß ich sowieso schon nochmal Puffer abwiegen. Schade, aber lieber sicher.
@Wolfgang: WARUM ich in dem Protokoll was mache weiß ich eh nicht, das ist nicht auf meinem Mist gewachsen. Wenn man "normale" Protokolle verwendet, kommt es wohl zu "excessive cytoplasmic blebbing from the sponge cells", deswegen werd ich mich jetzt blind an das gegebene Protokoll halten, das augenscheinlich gut funktioniert für den Zweck, und nicht groß rumexperimentieren, auch wenn es sinnfrei scheint. Nicht daß ich dann schuldbin daß man nix sieht... Den Puffer wird man doch mit der Alkoholreihe ganz gut wegwaschen? Den wollt ich dann eh entsprechend mitentsorgen, weil ja eben noch zumindest in den ersten Schritten bestimmt Cacodylat drin ist. Ich hoffe ja, daß ich zukünftig keine TEM-fixierungen mehr machen muß, aber es ist gut zu wissen daß sich hier Leute auch wirklich damit auskennen, Danke!

Das Osmium ist mittlerweile da, dann werd ich mich nun ans Eingemachte wagen 

[Nora]

Achso, NOCH eine Frage: Soll ich das Osmium gleich als 1%ige Lösung ansetzen, und dann Puffer- und Kochsalz kristallin zugeben, oder lieber konzentrierten Puffer ansetzen und mit höherkonzentriertem Osmium mischen? Bis wieviel % löst sich Osmium noch?

[Rene]

I do understand Wolfgang's comment. After the first treatment, the material should not be susceptible anymore to osmolarity/buffering problems anymore during the last steps. But if it works, don't touch it. For best results in fixation there's always some alchemy involved (or craft, if you wish  )

Make up the cacodylate buffer beforehand, you do not want to adjust pH after addition of the OsO4!

Best wishes, René

[Silber_und_Licht]

Achso, NOCH eine Frage: Soll ich das Osmium gleich als 1%ige Lösung ansetzen, und dann Puffer- und Kochsalz kristallin zugeben, oder lieber konzentrierten Puffer ansetzen und mit höherkonzentriertem Osmium mischen? Bis wieviel % löst sich Osmium noch?

Moin Nora,

ich habe 1g OsO4 normalerweise zu 4% in H2O tri dest. aufgelöst, dieser kleine Vorrat stand dann in einer Schiff´schen Flasche einem mit einem Dichtungsring verschlossenen Einmachglas bei mir im Abzug. Daraus habe ich entnommen und verdünnt, was jeweils benötigt wurde und gegebenenfalls mit entsprechend höheren Konzentrationen anderer Lösungen versetzt.

Ein Tipp noch zur Entsorgung: Man tut sehr gut daran, einen guten Schuss billiges (Sonnenblumen- o.ä.) Öl in das für die Entsorgung vorgesehene Gefäß zu geben. Die Osmium-Säure hat eine große Affinität zu Fett und Öl und die sonst u.U. verdampfende Osmiumsäure wandert dort hinein und wird festgehalten, was man an der Schwarzfärbung des Öl sehen kann. Überhaupt ist dringend(!) geboten, für maximale Dichtigkeit der Gefäße zu sorgen. Die verdampfende Osmiumsäure ist nicht nur sehr giftig, krebserregend und kann zur Erblindung führen, sondern schlägt sich auch überall - beispielsweise im Kühlschrank, Abzug o.ä. als schwarzer Belag nieder bzw. lagert sich in der Oberfläche von Kunststoffen usw. ein und ist auch von dort nicht wieder mit normalen Mitteln entfernbar. Das hieße, dass die jeweiligen kontaminierten Gerätschaften korrekterweise als Sondermüll entsorgt werden müssten.

Mit Osmiumsäure ist nicht zu spaßen!

Dann mach mal! Viel Erfolg - und sei nicht betrübt wenn es beim ersten Mal nicht gleich 100%ig wird. Auch eine EM-Einbettung, den Schnitt und vor Allem die Kontrastierung bedürfen einer gewissen Übung.

Freundliche Grüße

Wolfgang

[Nora]

Tralala, ich wollte den Puffer eigentlich gar nicht einstellen, um das pHMeter nicht mit dem Zeugs zu verunreinigen... Soweit ich mich eingelesen hatte, stellt sich der Puffer von selbst bei 7+ ein, und da er ja va die bei der quervernetzung freiwerdenden Protonen abfangen soll, dacht ich paßt das... Aber dann mach ich halt doch einen entsprechenden Stock, wennschondennschon. Danke!

und Danke auch für den Tip mit dem Öl! An das Schwarzfärben erinnere ich mich noch dunkel aus dem Praktikum damals, ich meine unser Prof hätte zur Demo einen Objektträger über die Stirn gezogen und dann in die Dämpfe gestellt. Die gestern befragte Laborleitung hat sowieso gemeint, ALLES was ich an Gerätschaft/Gefäßen dafür benutzt habe als Sondermüll entsorgen, reinigen (mit Natriumthiosulfat? Für den Fall der Fälle?) wäre zu viel Aufwand und unsicher, aber den Abzug schwärzen habe ich dann doch nicht vor.
Ich habs immerhin mittlerweile geschafft die Ampulle zu öffnen, das war mir heut eigentlich schon aufregend genug. Steht jetzt festverschlossen und abgedunkelt unter dem Abzug und ist hoffentlich bis morgen gelöst. 100mg sind ja zum Glück nicht soooooooooooooo viel, und aliquotieren/aufheben brauch ich davon nichts. Auch einbetten, schneiden usw muß ich zum Glück nicht, die Proben werden dann in Alkohol verschickt. "Ich putz hier nur" bzw mach diese Teufelsfixierung.

Also nochmal Danke Euch!

[Silber_und_Licht]

Eine Hilfe beim Lösen (nicht nur von OsO4) ist das Ultraschallbad ...

[Nora]

?
Im Romeis steht das Schallbad würde beim Lösen vom Osmium helfen?
"Mein" Osmium scheint immerhin schon gelöst zu sein, da ich heut aber eh die Prozedur nicht mehr anfange kann es noch bis morgen weiterlösen.
Ich habe jetzt einen 2x Puffer gerührt, der pH war 7,8, unser Aquariummeerwasser hat auch knapp 8, ich finde das paßt "im Rahmen der Meßgenauigkeit". Der GA war aus irgendeinem Grund eingefroren, da muß ich jetzt auch noch warten bis der auftaut. Morgen wirds dann spannend.
Eine Frage fällt mir noch ein: Das Cacodylat war nicht "frisch", sondern beschriftet mit "6.2014 geöffnet", seither hat es wohl niemand mehr benutzt, und das Gefäß war fest zugeschraubt. Sollte tun oder? Optisch sind es einfach weiße Kristalle.

[Silber_und_Licht]

?

Entschuldige bitte, meine Nachlässigkeit. Ich hatte ein "nur" vergessen. Habe ich aber inzwischen oben dazwischen gesetzt.

[Eckhard]

Hallo,

OsO4 Kristalle mit destilliertem Wasser in ein Glasgefäss mit Deckel geben. Dabei die Menge Aqua dest. so berechnen, dass eine 4% Stammlösung herauskommt. Über das Gefäß reichlich Parafilm geben und das Ganze in ein zweites Glasgefäss geben. Über Nacht löst sich das OsO4 und die Flüssigkeit wird leicht gelblich. Wichtig ist, dass alle Gefäße peinlich sauber sind und keine organischen Stoffe enthalten. Alles unter dem Abzug. Merksatz: kannst Du OsO4 riechen, bist Du zu nah. Es riecht wie Chlor.

Der Puffer ist nur für den Fixierschritt mit Glutaraldehyd nötig - sonst sinkt der pH Wert zu stark ab. Die Zugabe von Cacodylatpuffer zu OsO4 ist eigentlich unnötig - man macht es aber oft, damit alle Fixierlösungen eine ähnlicher Osmolarität haben. Es bleiben in der Regel Kristalle übrig, in REM Bildern unschöne Artefakte Deswegen nicht in Cacodylatpuffer waschen, sondern in Aqua dest.

Gehe davon aus, dass Du es mehrmals versuchen musst, wenn Du keine Erfahrung hast. Fixierung fürs REM ist immer noch etwas Alchemie

Viel Erfolg,
Eckhard

[Nora]

Auch hier noch ein Danke!
Wollte schon fragen ob das richtig ist daß die Lösung gelblich wird, oder ob dann das Glas nicht sauber genug war... Gelöst wars gestern schon nach etwa 1h, aber 100mg waren auch wirklich nur ein paar Krümelchen.
Ich werde erstmal wie im Protokoll die zwei Waschschritte mit Puffer machen, daß ich sagen kann ich hab mich ans Rezept gehalte, und dann vor dem Entwässern nochmal mit Aqua dest waschen. Die Alkoholreihe ist ja auch weder gepuffert noch gesalzen. Wär blöd wenn ich nur wegen Pufferkristallen das Ganze nochmal machen müßte. Falls es je ein nächstes Mal gibt bestell ich gleich die Lösung, dann spar ich mir das aufregende Ampullenöffnen...
Ich mein, das Protokoll ist eh komisch, Vorfixiert wird ja mit 1% Osmium PLUS 3ml Meerwasser, das macht wenn ich richtig rechne 0,25% Osmium, und das ganze nur für 3min? Naja, vielleicht besser nicht denken, die werden schon wissen warum...

Ah, und noch eine Frage, weil ich vergessen hab das Öl mitzunehmen: Es muß schon "Echtes" Fett sein, Paraplast oder Dentalwachs tuns nicht nehm ich an? Sowas hätt ich da, ansonsten muß die Entsorgung bis morgen warten.