Wie kommt man an exotische Diatomen + Radiolarien heran?

Begonnen von bernd552, Mai 12, 2017, 13:47:20 NACHMITTAGS

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Silber_und_Licht

#45
Zitat von: Carlos in Mai 18, 2017, 08:22:59 VORMITTAG
Hallo Wolfgang,
ZitatMit den Rändern an den eingetrockneten Proben auch nach dem Waschen mit Aqua tri-dest., welches er aus einer Apotheke bezog war übrigens schlagartig Schluss, nachdem ich ihn mit tri-Destillat aus unserer Destillieranlage in der Elektronenmikroskopie versorgt hatte.
Nach meiner Erfahrung "verdunstet" normales dest. Wasser, wie es z.B. für Bügelautomaten preiswert im Baumarkt erhältlich ist, auf Objektträgern und Deckgläsern rückstandsfrei.
Wenn man allerdings dest. Wasser in Glasflaschen aufbewahrt, kann es Rückstände geben. Mir scheint es übertrieben, "tri-Destillat", wie es in der Elektronenmikroskopie offensichtlich eingesetzt werden muss, in der Aufbereitung von Proben zur Anfertigung von Dauerpräparaten in der "normalen" Mikroskopie zu verwenden.
Gruß Carlos

Hallo Carlos,

das glaube ich auch. Ich hatte damals eher den Verdacht, dass das was Bruno Wirtz damals als destilliertes Wasser verkauft wurde, nicht in Ordnung war, warum auch immer. Vielleicht war die Destille nicht sauber oder es war kein destilliertes Wasser sondern welches das durch einen Ionenaustauscher gelaufen war, dessen Filterung nichts taugte - Möglichkeiten gibt es da viele. Von daher hatte ich kurzerhand unser Wasser genommen, von dem ich durch tägliche Verwendung wusste, dass es sauber war und die Trocknungs-Ränder waren ja auch schlagartig weg.

Das hochreines Wasser Glasflächen anlösen kann ist mir auch bekannt, gilt aber im Wesentlichen für einfache Flaschengläser, weniger für Laborglas und benötigt auch eine gewisse Zeit. Bei destilliertem Wasser, welches nur wenige Tage oder gar nur Stunden von seiner Beschaffung bis zur Verwendung im Behälter ruht, ist das ziemlich sicher nicht ausreichend, durch anlösen des Glases solche Ränder zu erzeugen.

Freundliche Grüße

Wolfgang
"Du" fänd' ich ganz in Ordnung.

das Schönste: ZEISS Lumipan
das Liebste: LEITZ Panphot II, Ortholux
das Beste: ZEISS Axiomat

eine etwas umständliche Vorstellung: www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=28652.0

Klaus Henkel

Zitat von: Silber_und_Licht in Mai 18, 2017, 10:00:02 VORMITTAG
Ich hatte damals eher den Verdacht, dass das was Bruno Wirtz damals als destilliertes Wasser verkauft wurde, nicht in Ordnung war, warum auch immer. Vielleicht war die Destille nicht sauber oder es war kein destilliertes Wasser sondern welches das durch einen Ionenaustauscher gelaufen war, dessen Filterung nichts taugte -
Wolfgang

Im Mai 1982 machte ich meine ersten Dauerpräparate von Blütenpollen, vornehmlich Windblütler. Die Präp. fertigte ich mit größter Sorgfalt an. Zum Ansetzen der Glyzeringelatine nach Kisser besorgte ich mir erstklassige Blattgelatine von Chroma und verwendete destilliertes Wasser aus der Apotheke. Runde Deckgläser, umrandet mit Deckglaslack vom Kosmos-Serice.

Erschrocken mußte ich zusehen, wie sich bei vielen Präp. bald innerhalb der Deckglasumrandungen offenbar Bakterienfraß entwickelte. Ich untersuchte die Umrandungen, kontrollierte nochmals die einzelnen Prozeßschritte, konnte keinen Fehler feststellen. Dann hielt ich die große, braune Laborglasflasche mit destilliertem Wasser ans Licht: Eine große Exuvie der Hauswinkelspinne schwebte im Wasser.

Der Apotheker erklärte mir ungerührt, ich hätte Aqua dest. für bakteriologische Zwecke verlangen müssen, das würde 3fach destilliert - unter Aufsicht. Das gewöhnliche dest. Wasser würde, wie auch an der Tankstelle, mit einem Ionenaustauscher hergestellt und nur entsalzt. Da könne es beim Erneuern der Levatit-Ladung schon vorkommen, daß eine Spinne unbemerkt hineinkröche. In der Apotheke verkaufe man das nur fürs Bügeleisen und an der Tankstelle für die Autobatterie. Echtes dest. Wasser müsse ich übrigens bestellen, weil man es extra für mich destillieren müsse, wenn gerade jemand Zeit habe. Das war mir aber zu teuer, und ich verbuchte die mißlungenen Präparate als Lehrgeld.
Einige Jahre später habe ich erfahren, daß ich für das Ansetzen der Glyzeringelatine ebensogut reines Leitungswasser hätte verwenden können ...
KH

bernd552

Hallo Anne,

Zitat von: anne in Mai 13, 2017, 19:31:25 NACHMITTAGS
Hallo Bernd,
besonders diese beiden Materialien sind sehr schön:

http://www.ebay.de/itm/Diatomite-Miocene-Valmont-Mbr-Monterey-Fm-diatom-microfossil-matrix-sample-Cali-/401231462070?hash=item5d6b423eb6

und dieses

http://www.ebay.de/itm/Diatomite-Miocene-Malaga-Mudstone-diatom-microfossil-matrix-sample-California-/351914080646?hash=item51efb6b986

Jeodch ist das Preis/Mengen Verhältnis unterirdisch.

lg
anne

ich habe beide Proben bestellt und stehe als Anfänger bezüglich fossilen Diatomeen vor einem Rätsel.

Beide Proben sehen aus, als ob diese vor dem Versand gemörsert wurden.
1. Habe jeweils eine kleine Testmenge in Alkohol aufgenommen und 10 sec. ins Ultraschallbad gehalten, sofort hatte ich eine Konglumeratfreie Suspension, die unterm Mikroskop übeprüft jedoch nur aus Bruchstücken bestand.
2. Daraufhin nahm ich jeweils eine native Probe und habe im REM das gleiche Ergebnis gefunden. Auf einer Fläche von 12mm Durchmesser fand ich gerademal ein unzerstörtes Objekt.

Hier zwei Übersichtsaufnahmen




Das einzig nicht deformiertes Objekt


Bruchkante im Detail (ist dem Aussehen nach ein alter Bruch)


Details von Bruchstücken




Nun, dieser Weg war nicht allzu sehr von Erfolg gekrönt, ist solch eine Ausbeute eines Kaufpräparates denn üblich?
Da fehlt mir einfach die Erfahrung.

Wie ist denn Eure Erfahrung mit fosilen Proben?

LG
Bernd

anne

Hallo Bernd,
Ultraschall ist der Killer für Diatomeen schlecht hin - damit bekommt man zu 100% Sicherheit nur noch Bruch.
Fossile Proben haben oft einen sehr hohen Anteil an Bruch - das ist völlig normal.  Nach der Reinigung siebt man die Proben und siebt somit den Bruch weg, es bleiben große Bruchstücke und ganze Diatomeen.
An Deinen, übrigens absolut genialen, Aufnahmen, sieht man schön, dass bei fossilen Proben alles miteinander verbacken ist. Da hilft vermutlich auch keine Plasmabehandlung sondern nur eine klasische Reinigung.

Ein Freund von mir hat Proben aus Oamaru vor der klasischen Reinung bis zu 100 Zyklen einer Wechselbehandlung aus Einfrieren und Auftauen unterzogen um die verbackenen Teile zu trennen.

Für die Fundortplatte aus dem amerikanischen Forum die ich verlinkt hatte, sitzt der Präparator an ca. 100 Objektträgern die jeweils mit einem Tropfen gereinigter und gesiebter Diatomeenlösung betropft wurden und über den ganzen Objektträger verteilt wurde und durchsucht diese nach den ganzen Exemplaren.


lg
anne

bernd552

Hallo Anne,

Zitat von: anne in Mai 19, 2017, 22:38:00 NACHMITTAGS

Für die Fundortplatte aus dem amerikanischen Forum die ich verlinkt hatte, sitzt der Präparator an ca. 100 Objektträgern die jeweils mit einem Tropfen gereinigter und gesiebter Diatomeenlösung betropft wurden und über den ganzen Objektträger verteilt wurde und durchsucht diese nach den ganzen Exemplaren.


.... bei diesem überaus schlechten Wirkungsgrad muß das ja eine Art Passion - oder doch eine "Strafarbeit" sein?

Verbackungen lösen durch 100x Einfrieren und Auftauen könnte man per Peltierelement und Zeitschaltuhr innerhalb von 1 Stunde hinbekommen und dabei gemütlich ein Kaffee trinken, aber wenn die Verbackungen im Vorfeld schon nur aus Bruch bestehen ....

Sind in den fossilen Proben überhaupt noch organische Bestandteile vorhanden, die "klassisch" gereinigt werden können? Ich dachte, da wären anorganische Verunreinigungen wie Ton & co. die nur mechanisch oder per Lauge entfernbar wären (Lauge würde aber sicherlich auch das Gerüst anätzen)? Die Plasmageschichte ist natürlich nur beim Evaporieren von rein organischen Material sinnvoll, also bei Frischmaterial.

Nun, wieder was gelernt, ich muß also einen anderen , als den "fossilen Weg" gehen und statt nach ungewöhnlichen exotischen, nach frischen, einheimische Diatomeen ausschau halten.

LG
Bernd





Bob

Hallo Bernd,

Diatomeen aus dem Frischwasser sind am einfachsten zu reinigen, da kein Sand und Schlamm mit dabei ist. Für Deine REM-Aufnahmen könnte es auch ein Ziel sein, die Diatomeen eher vorsichtig zu reinigen, so dass die Gürtelbänder erhalten bleiben und sich die Schalen eben nicht trennen. Laut Friedrich Hustedt werden durch die Behandlung mit starken Säuren auch die zarten Diatomeen zerstört, und der sollte es ja gewusst haben. Für die Bearbeitung mit dem Lichtmikroskop ist der Verlust nicht so groß, da man bei 5µ-Diatomeen nicht mehr so viel Struktur sieht. Aber für die Untersuchung mit dem REM sollte man die Zielstellung überprüfen.
Ich habe Diatomeen mit Pankreatin gereinigt, das ist vermutlich die schonendste Methode. Bei Bedarf kann ich das gerne mal beschreiben.

Viele Grüße,

Bob

Carlos

Hallo Bob,
Zitat... Für die Bearbeitung mit dem Lichtmikroskop ist der Verlust nicht so groß, da man bei 5µ-Diatomeen nicht mehr so viel Struktur sieht. Aber für die Untersuchung mit dem REM sollte man die Zielstellung überprüfen.
Das entspricht genau meinen Überlegungen für den Einsatz von REM bei Diatomeen. 
Hallo Bernd,
Da ich Interesse an besonders kleinen Diatomeen habe, habe ich von Anne eine Probe ,,Pelose" aus dem Schollenersee (feucht und nicht aufbereitet) erhalten, in der die kleinen  Diatomeen (<10µm) der Zahl nach deutlich überwiegen. Zudem ist der Anteil ,,Bruch",  sowohl bei großen wie auch bei kleinen Diatomeen, sehr niedrig. Im Vergleich zu den von Anne geschriebenen Problemen bei der Aufbereitung von ,,exotischen" Diatomeen ist die Aufbereitung von Pelose deutlich einfacher.
(Wenn man eine ,,Messerspitze" feuchte Pelose (ca. 10 mg ) nicht mindestens in 10 ml dest. Wasser suspendiert, enthält ein Tropfen der Suspension, wie man ihn für die Anfertigung eines Präparates (zwischen  20 x 20 Deckglas und Objektträger) verwendet, viel zu viele, dicht gepackte und häufig überlappende Diatomeen!)
Zum  ,,Üben" der Herstellung von Diatomeen-Präparaten für ein REM scheint mir Pelose daher sehr geeignet. Zudem würden sich vermutlich viele hier im Forum über das Zeigen von REM-Bildern von den kleinen, mit dem normalen Mikroskop kaum ausreichend in ihrer Feinstruktur erkennbaren Diatomeen freuen.
Gruß Carlos

wilfried48

Hallo Bernd,

ich wundere mich bei deinen Bildern schon die ganze Zeit, wie toll das REM ist.
Aber irgendwie kann die Angabe der SEM Magnification nicht stimmen.
Wenn ich den Massbalken in Relation zur angebebenen SEM-Mag stelle kommt auf meinem Laptop bei allen Bildernin der Forendastellung ein Verkleinerungsfaktor von ca. 5,9 heraus. Die Bilder sind in der Forendarstellung auf meinem Laptop 19 cm breit, das heisst das Originalbild auf das sich die SEM Vergrösserung bezieht müsste 1,12 Meter breit sein. Hast du an deinem SEM so riesige Bildschirme ?

viele Grüsse
Wilfried
vorzugsweise per Du

Hobbymikroskope:
Zeiss Axiophot,  AL/DL/Ph/DIC/Epi-Fl
Zeiss Axiovert 35, DL/Ph/DIC/Epi-Fl
Zeiss Universal Pol,  AL/DL
Zeiss Stemi 2000 C
Nikon Labo-/Optiphot mit CF ELWD Objektiven

Sammlung Zeiss Mikroskope
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=107.0

bernd552

Hallo ihr leidenschaftlichen Diatomisten,

erstmal danke ich Euch für so viel Unterstützung und freue mich darüber, dass Ihr (wie auch ich) gerne einige REM Bilder aus dem Mikro-Universum anschaut.
Ich nenne Euch bewußt "leidenschaftliche Diatomisten", da ich nun einen kurzen Einblick in die Vorarbeit der Reinigung hatte, die in meinen Augen "Leiden schaft".

Ich ziehe den Hut vor jedem, der einen leindenschaftlichen Zeit- und Arbeitseinsatz zeigt, um ein Ziel zu erreichen!!!
Aber wie heißt es immer bei Eltern mit schwierigen Kindern, ".... aber wenn er mich dann anlächelt, dann ist das die Belohnung für all die Mühe". Ich hoffe dass Ihr viel lächeln auf Euren Objektträgern sieht. ;)

@ Bob
das ist ja witzig, ich habe aktuell über eine Pepsin und Papain Verdaung der Diatomeenorganik nachgedacht, ohne jedoch zu wissen, wie gut das praktisch auch geht. Kann man da mehr erfahren? Ich hatte früherPhotogelatine mit Enzymen mikrostrukturiert, das ging sehr gut.

@Carlos
danke für den Pelose Vorschlag, wenn man eine erfolgreiche Reinigung damit hinbekommt, kann man diese Prozedur dann auf alle anderen Diatomeen anwenden / hoch interpolieren? Wenn ja, dann muß ich um Anne eine Probe davon zum "üben" erbitten. 

@Wilfried
Du bist bestimmt kein Biologe, Dein technisches Verständnis verrät Dich ;)
Die Richtigkeit der MAG Angabe habe ich eigentlich nie überprüft (meine Intention ist ja die Ästhetik), ich halte mich immer an den Maßbalken.
Alle Bilder sind mit 4096x3072 Pixeln (4:3) aufgenommen also liegst Du mit Deiner Berechnung richtig. Aber gegen einen 1 Meter breiten Bildschirm am REM hätte nichts einzuwenden, das wäre ja fast Kino.

LG
Bernd

wilfried48

Zitat von: bernd552 in Mai 20, 2017, 14:47:00 NACHMITTAGS
......
Die Richtigkeit der MAG Angabe habe ich eigentlich nie überprüft (meine Intention ist ja die Ästhetik), ich halte mich immer an den Maßbalken.
......

Hallo Bernd,

aber bei den Superbildern hier
http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=28819.0
hast du nicht den Massbalken sondern die MAG angegeben.
Das hat bei uns im Institut dazu geführt zu diskutieren ob unsere REMs noch auf dem modernsten Stand sind.
Wenn der MAG Wert von 480 Kx natürlich nach unten korrigiert werden muss sieht das natürlich wieder etwas anders aus.

Was das "Leiden" bei der "Leiden"schaft, saubere Diatomeen zu präparieren, anbelangt bin ich sicher, dass du viele "Leider" finden wirst, die dir Superpräparate liefern, wenn du im Gegenzug gute REM Bilder davon machst.

viele Grüsse
Wilfried

vorzugsweise per Du

Hobbymikroskope:
Zeiss Axiophot,  AL/DL/Ph/DIC/Epi-Fl
Zeiss Axiovert 35, DL/Ph/DIC/Epi-Fl
Zeiss Universal Pol,  AL/DL
Zeiss Stemi 2000 C
Nikon Labo-/Optiphot mit CF ELWD Objektiven

Sammlung Zeiss Mikroskope
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=107.0

Bob

Hallo Bernd,

Diatomeen zählen für mich zu den interessantesten Mikro-Objekten und so kam ich dazu, mich auch mit der Beschaffung des Materials zu befassen. Nun wohne ich hier in einem turbulentem Haushalt mit Frau, Kindern und Haustieren, und ein aufgeräumtes Chemie-Labor ist weit und breit nicht in Sicht. So habe ich angefangen, mich mit alternativen Methoden zur Reinigung von Diatomeen zu befassen. Ich bekam den Hinweis auf Pankreatin, dass wohl zuerst 1960 als Mittel zur Reinigung von Diatomeen zum Einsatz kam, und das später auch Bestandteil des Präparations-Kits von Firma Safeline war. Pankreatin gibt es als Medikament in Kapselform zu kaufen, und es reinigt Diatomeen. Bei meiner Beschäftigung mit Amphipleura Pellucida kam der Eindruck auf, dass es zwar gut reinigt, aber die Schalen nicht so gut trennt. Da musste ich gleich ans REM denken.
Grundsätzlich gibt es wohl kein Patentrezept, für die Reinigung aller Diatomeen aus allen Quellen gleichermaßend passend. Spätestens wenn Sand in der Probe ist, kommen auch die starken Säuren an ihre Grenze. Ich schreibe morgen mal, wie ich bei der Reinigung mit Pankreatin vorgegangen bin. Es dauert sein Zeit, erfordert aber keine Zentrifuge. Man kann jede Sache ja auch mit unterschiedlich hohen und unterschiedlich gearteten Zielen betreiben. Da finde ich es immer gut, zu wissen, was mit meinen Möglichkeiten so geht.

Viele Grüße,

Bob

Bob

Hallo zusammen,

ich beschreibe hier mal kurz, wie ich beim Reinigen von Diatomeen mittels Pankreatin vorgegangen bin. Ich habe versucht, mich auf einfachst und günstig zu beschaffende Mittel zu beschränken.
Es handelte sich dabei um einen Teil der Kraterquellen-Probe aus Bad Nenndorf, die ich netterweise geschickt bekommen habe.
Foto folgt später.

Folgende Geräte und Substanzen kamen zum Einsatz:
-Kurbelzentrifuge + 15 ml-Röhrchen
-Wärmebank
-Pipette

- EDTA-Lösung (20g in 100ml dem. Wasser warm gelöst, das meist ist später wieder ausgefallen. Es löst sich wohl besser in leicht alkalischen Millieu)
EDTA ist ein Komplexbildner, der anders schwer lösliche Stoffe in Lösung bringen kann, z.B. Eisen und Kalk. Bei dieser Probe vermutlich verzichtbar.

- Pufferlösung (Microbe-Lift PH 7 Buffer fürs Aquarium, 10g in 200ml dem. Wasser)
Das Pankreatin fühlt sich wohl im neutralen Bereich am wohlsten, dafür der Puffer.

- Pankreatin-Stada 20000 Magensaftresistente Hartkapseln zum Einwerfen für den Menschen. Nicht über 25°C lagern. 0,2g pulverisierte Bauchspeicheldrüse vom Schwein pro Kapsel. In den Kapseln sind ca. 1mm große Pellets, die man zerstoßen und in etwas Wasser auslösen muss.

1. Probe mittels Kurbelzentrifuge weitgehend vom Wasser befreit. Probenmenge geschätzt 0,5 cm³
2.  EDTA- Lösung dazu, etwa eine Stunde unter wiederholtem Schütteln einwirken lassen, gerne etwas warm,z.B. im Flachmann in der Hosentasche. Danach zentrifugieren und ein paar mal mit dem. Wasser waschen.
3. Pankreatin aus 1-2 Kapseln, also 0,2-0,4 g, mit 10-15 ml Pufferlösung mischen. Pankreatin arbeitet am besten bei Körpertemperatur, also Wärmebank oder Flachmann in der Hosentasche. Die Reinigung erfolgt langsam, mit der Zeit fängt die Brühe aber auch an zu muffeln. Also ein ein bis maximal 4 Stunden einwirken lassen, Prozess lieber nochmal wiederholen.
4. Zentrifugieren und mehrmals mit dem. Wasser gründlich waschen, Pankreatin ist Schweinkram.
5. Diatomeen trocknen und in Medium passend zum Eindeckmittel überführen.

Je nach Probe kann man den Prozess verändern oder ergänzen. Öltröpfchen kann man mit Aceton auswaschen. Sand kann man durch Sedimentieren oder Waschen im Uhrglas abtrennen. Hat man keine Zentrifuge, kann man auch sedimentieren lassen, es ist hier ja keine Eile geboten.

Wie gut funktioniert das ganze? Die andere Hälfte der Wasserprobe habe ich mit Clorix gereinigt. Das geht viel schneller und brachte eine bessere Trennung der Schalen. Clorix ist aber für den Erhalt feinster Diatomeen sicherlich nicht ideal. Die Reinigung mit Pankreatin ist aus meiner Sicht für moderate Ansprüche gut einsetzbar, und könnte gerade für feinste Diatomeen die optimale Methode sein.

Das wäre also mal eine lohnende Versuchsreihe: Eine fixierte Wasserprobe, die feinste Diatomeen enthält, Reinigung jeweils durch Säure, H2O2, Glühen, Clorix und Pankreatin. Dann Prüfung der Reinigungswirkung und Schädigung mit dem REM. Ich könnte da im Rahmen meiner Möglichkeiten gerne mitwirken.

Ich zeige nachher mal ein Foto der nach dieser Methode gereinigten Diatomeen.

Viele Grüße,

Bob

Bob

Hallo zusammen,

hier ein paar schnell gemachte Fotos, überwiegend mit dem 40er Objektiv gemacht.
Die Diatomeen sind in Pleurax eingeschlossen.
Ich vermute, dass ich bei der Aufteilung der Probe in zwei Hälften oder der weiteren Verarbeitung etwas verkehrt gemacht habe, denn in dem Material, dass ich mit EDTA und Pankreatin gereinigt habe, ist mehr Sand und weniger Diatomeen. Gut zu erkennen ist, dass die Diatomeen so gereinigt werden, dass die Porenstruktur gut erkennbar ist. Für ein erstes Experiment finde ich die Ergebnisse ganz vielversprechend.
Der Schmutz im Bild steckt eher im Strahlengang als im Präparat selbst.
Viele Grüße,

Bob







bernd552

Hallo Bob,

danke für die Rezeptur, die so überaus einfach (auch gefahrlos für Kinder) in jeder "Küche" durchführbar ist.

Da wäre es (für mich) interessant zu sehen, ob die Enzymverdaung auch im Innern der Kieselalge erfolgt ist.

Die Lichtmikroskopiker sind hier deutlich Im Vorteil, die stören Kieselalgen-Eingeweide weniger.

LG
Bernd

Bob

Hallo Bernd,
auf meinen Fotos ist teilweise zu erkennen, dass sich die Schalen getrennt haben. Aber auch bei den anderen Diatomeen gehe ich davon aus, dass das Innere gereinigt ist. Die Fotos sind im reinen Durchlicht entstanden teilweise leicht schiefe Beleuchtung. Da müsste man die Inhaltsstoffe sehen, wenn sie da wären. Ich vermute aber, dass noch Teile der Gurtelbänder vorhanden sind.

Viele Grüße,

Bob