Probleme mit Technovit 7100 Einbettung

[fegue]

Ein herzliches Hallo an alle hier im Forum,

ich habe ein Problem mit der Einbettung bzw. den Schnitten meines Pflanzenmaterials in Technovit 7100. Die bestehenden Beiträge im Forum habe ich bereits gelesen, jedoch habe ich ein spezielles Problem.
Ich möchte Schnitte von Haftscheiben in verschiedenen Ontogeniestadien einer Kletterpflanze mache. Bei meinen bisherigen Einbettungsversuchen lief es immer darauf hinaus, dass bei älteren, zum Teil verholzten Haftscheiben, die Proben bereits beim schneiden zerbröselt sind. D.h. das große Teile der Proben wie Staub aus dem Technovit herausgebrochen sind, was bei allen Schnittdicken von 3-15 µm passierte. Es hatte den Anschein, als ob die Strukturen nicht richtig infiltriert worden wären. Junge, unverholzte Stadien konnten erfolgreich geschnitten werden. Ich habe die Proben dann mal zum Testen angeschnitten, also etwa ein drittel entfernt, in der Hoffnung dass dies eine bessere Infiltration ermöglicht. Leider ohne Erfolg. Es müsste also am vorgehen liegen.
Ich will das Prozedere mal ausführen:
-   Fixierung in FAA
-   Entwässerung in einer aufsteigenden Isopropanol oder EtOH- Reihe ( 3x50%, 70%, 90%, 2x100%. Jede Stufe entlüftet)
-   Präinfiltration in Technovit/Isopropanol 1:1 für mind.12 h. Im Kühlschrank gelagert
-   Infiltration 24-48h. Technovit + 1g Härter I . Kurz entlüftet und dann im Kühlschrank gelagert
-   Zur Einbettung habe ich die bereits bestehende Infiltrationslösung genommen und noch Härter II dazu gegeben.

Eigentlich meine ich, dass das Vorgehen soweit richtig ist und auch die Zeiten scheinen, mit leichter Abweichung zu anderen Beiträgen, lange genug zu sein. Oder doch nicht?
Woran könnte es den liegen, dass ich keine einzige Probe unbeschadet auf einen Objektträger bekomme?
Die Schnitte sollen danach noch mit FCA gefärbt werden. Ist hierbei irgendwas zu bedenken?

Vielleicht hatte hier ja mal jemand ein ähnliches Problem und kennt Tricks und Kniffe. Ich bin um jeden Vorschlag dankbar!

Viele Grüße,
Felix

PS.: Beiträge die ich hier bereits gefunden habe, ich mir aber nicht sicher bin, ob das mein Problem löst:

http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=9644.0
http://www.mikroskopie.de/mikforum/read.php?1,13905,13905#msg-13905

[Rawfoto]

Lieber Felix

Ich verwende zur Eibettung zwar einen anderen Prozess, aber mir fallen zwei Sachen auf:

1.) meine Prozesstemperatur liegt zwischen 56 und 58 Grad, nur zum Festigen geht es auf 7 Grad und vor dem Schneiden teilweise auf minus 20 ...

2.) Eindringen in ISO bei hartnaeckigen Probanden wird unter Unterdruck im Exi gemacht und ich beginne die Mischung mit dem Einbettmittel bei 10% und erhoehe die Konzentration dann innerhalb von 24 Stunden auf 100% ...

Ob Dir das hilft kann ich aber nicht sagen, ich hoffe es und bin gespannt.

Liebe Gruesse

Gerhard

[David 15]

Hallo Felix,

Ich kenne mich mit dieser Einbettungsmethode nicht aus aber ich habe eventuell eine Vermutung, weshalb das Ganze nicht funktioniert. Du hast geschrieben,dass es bei weichen Stücken keine Probleme gab und es bei verholzten Schnitten nicht ging.

Das könnte an der Einbettungsmethode liegen. Ronald Schulte verwendet es ja für weiches histologisches Gewebe. Die Einbettungsmethode ist vielleicht nur für weiches Gewebe gedacht ? Beim Paraffin ist es nämlich ähnlich. Weiches Gewebe geht wunderbar aber verholztes wird unschneidbar hart.

Möglicherweise wäre eine andere Einbettungsmethode das Richtige ? Die Seifeneinbettung eignet sich beispielsweise gut für verholztes Gewebe.

Viele Grüße
David

[Ronald Schulte]

Felix,

Schön das du auch mit Technovit arbeitest. Ist ein sehr schöne Kunststoff nur hat wohl seine 'Nucken'.
Was ich aus dein Bericht lese Tippe ich auch auf unvollständige infiltration.
Lasst sich mit Paraffin noch wohl etwas (1-2%) Wasser entschuldigen, mit Technovit muss es 100% Wasserfrei sein.
Dafür nehme ich kein Isopropanol 100% sonder Ethanol 100% was einfach her zu stellen ist aus Ethanol 96% in Molsieb. Da habe ich immer eine Flasche von 500ml bereit.
Einmal pro Jahr wird das Molsieb in ein Ofen auf 110Grad Celsius entwässert und mit frisches Ethanol angesetzt. So habe ich das Ganze Histologisches Jahr Wasserfreies Alkohol.

Ich mache die Pre-infiltration bei Zimmertemperatur um es Besser zu Infiltrieren aber bei 4 Grad kann auch laut Kulzer.
Das die Lösung schnell aushärtet brauchst du absolut keine angst zu haben. Ich habe noch Technovit mit Harter 1 die ich letztes Weihnachten gebraucht habeund ist immer noch wie Wasser so dünn. Habe es zufällig vorige Woche nochmal getestet ob es noch härtet und das geht immer noch prima nur nicht in die kalte Garage. Da passierte gar nichts. Erst wenn ich es auf Zimmertemperatur brachte härtete es in 1-2 Stunden aus.
Ich harte die fertige Blocke auch immer nach. Zwei Tagen auf 50 Grad.

Ich lese das du Schnitte machst bis 15 µm. Das finde ich einwenig fremd weil das bei mir absolut nicht geht. 6 oder maximal 7 µm sonst bricht mir das Block aus.
Bin neugierig mit welches Messer du schneidest.

Die Zeiten die Kulzer in die Broschüre schreibt sind auch ein wenig Kommerziell gedacht weil es verkaufen muss. Langer entwässern, Infiltrieren usw. ist da Ratsam.

Grüße Ronald   

[fegue]

Vielen Danke für eure Antworten!

2.) Eindringen in ISO bei hartnaeckigen Probanden wird unter Unterdruck im Exi gemacht und ich beginne die Mischung mit dem Einbettmittel bei 10% und erhoehe die Konzentration dann innerhalb von 24 Stunden auf 100% ...

Leider weiß ich nicht was du mit ISO meinst. Bezieht sich die Erhöhung der Konzentration des Einbettmittels auf die Präinfiltration oder die Infiltration?

Möglicherweise wäre eine andere Einbettungsmethode das Richtige ? Die Seifeneinbettung eignet sich beispielsweise gut für verholztes Gewebe.

Vielen Dank für den Tipp. Ich werde mir die Seifeneinbettung mal genauer ansehen.

Das die Lösung schnell aushärtet brauchst du absolut keine angst zu haben. Ich habe noch Technovit mit Harter 1 die ich letztes Weihnachten gebraucht habeund ist immer noch wie Wasser so dünn. Habe es zufällig vorige Woche nochmal getestet ob es noch härtet und das geht immer noch prima nur nicht in die kalte Garage. Da passierte gar nichts. Erst wenn ich es auf Zimmertemperatur brachte härtete es in 1-2 Stunden aus.

Du meinst das die Infiltrationslösung mit Härter I bei Raumtemperatur aushärtet? Ich hatte den Plan sowohl die Prä- als auch die Infiltration unter leichtem Vakuum und bei Raumtemperatur durchzuführen und dann die Proben evtl. noch 1-2 Tage auf einer Rüttelplatte auch bei 25°C stehen zu lassen. Agitation soll ja hilfreich sein.

@Roland Schulte
Geschnitten habe ich die Proben mit einem Rotationsmikrotom und einem Hartmetallmesser der Klingengeometrie D von Leica. Es ging zwar etwas schwerer, aber das Technovit schien weich genug zu sein. Ich habe die Blöcke auch nicht gehärtet, so wie du es geschrieben hast.

Ich werde definitiv die Lösungen auch mal wechseln und die Infiltrations- als auch die Entwässetrungsdauer verlängern. Da hatte ich noch gelesen, dass Pflanzenmaterial nicht länger als 1h in 100% EtOH belassen werden soll, da sonst Schrumpfungseffekte auftreten. Stimmt das so?
Besteht evtl ei Problem bei der Fixierung mit FAA (Formalin-Aceton-Alkohol-Lösung)?

Und eine Sache noch; Kann ich Technovitschitte ohne sie zu verschließen einige Tage bis zur Färbung aufheben, bis alle Proben geschnitten sind?

Viele Grüße,
Felix 

[Ronald Schulte]

Felix,

Einbetten von Pflanzen weis ich nichts davon, ich bette nur Tierisches Gewebe ein.
Kulzer schreibt eigentlich nur Formalin vor und das geht sicher gut. Habe schon Bouin Probiert und das Bettet und schneidet prima nur färbt sich sehr schlecht. FAA habe ich noch nicht probiert. Kaliumdichromat Funktioniert auch sicher nicht.
Nachharten muss auch nicht aber damit werden die Blocke harter und wenn du mit ein Leica Hartmetall schneidest können Schnitte bis zu 0,5um geschnitten werden. Ein Video von mein Schneidearbeit mit ein Kulzer Messer habe ich in youtube eingestellt: Mikrotomschneiden Technovit 7100
Schnitte aufgezogen und getrocknet können problemlos wochenlang aufbewahrt werden, das mache ich öfters. Meist schneide ich so fünfzig Schnitte und dann dauert es einwenig vor alles gefärbt ist.
Vielleicht noch ein Tipp: Wenn du die Schnitte aufgezogen hast und wenn es getrocknet ist bleibt meist ein Schleier von Kunststoff auf das OT (ich kenne das richtige Deutsch dafür nicht). Wenn du die Schnitte 48 Stunden in 100% Isopropanol Vertikal stehen lasst ist den 'Schleier' Gans aufgelost und ist das OT mit Schnitt klar wie Glas. Kein Ethanol mit niedrige werten (70% oder so) nehme weil die Schnitte sonst Schrumpfen.

Grüße Ronald