Liebe Kollegen,
ich sehe im Forum mehr und mehr Fluoreszenzaufnahmen, was mich sehr freut.
Man kommt durch die Verfügbarkeit von genügend energiereichen LEDs ja heute zunehmens auch ohne die teuren Entladungslampen aus, damit wird das schöne Verfahren auch für viele erschwinglich.
Die folgenden Beispiele gehen querbeet durch die "Landschaft" und mögen dem einen oder anderen im Forum als Anregung für eigene Experimente dienen.
Für Fragen, z.B. zu den verwendeten Filtern stehe ich gern zur Verfügung.
Viel Spass & herzliche Grüsse
Holger
Alle Fotos mit Leitz Orthoplan, Auflicht Fluoreszenz, Lampe HBO 50 W, weitere Angaben zu den Bildern.
Chromosom aus der Speicheldrüse der Zuckmückenlarve, Durchlicht Phaco mit simultaner Auflicht Fluoreszenz, Farbstoff: DAPI, UV-Anregung
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_2901871.jpg)
Das gleiche Präparat, nur im Phaco, Auflicht-Strahlengang blockiert
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_51867854.jpg)
Die folgenden 2 Bilder zeigen Meiosestadien aus dem Hoden der Heuschrecke, Essigsäure-Quetschpräparat, Farbstoff: Acridinorange, Blau-Anregung
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_46207258.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_15449420.jpg)
Die folgenden 2 Bilder zeigen Meiosestadien aus dem Hoden der Heuschrecke, Essigsäure-Quetschpräparat, Farbstoff: DAPI, UV-Anregung
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_29446469.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_66454541.jpg)
Die folgenden 2 Bilder zeigen eingedeckte, gefärbte Pflanzenschnitte, UV-Anregung (erstes Bild), Blau-Anregung (zweites Bild)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_40281621.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_40933751.jpg)
Die folgenden 3 Bilder zeigen eingedeckte, gefärbte Pflanzenschnitte von Robin Wacker, UV-Anregung (erstes und drittes Bild), Blau-Anregung (zweites Bild)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_562228.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_23051381.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_5582538.jpg)
Die folgenden 2 Bilder zeigen Amöben im Lebendpräparat, Farbstoff: Acridinorange, Blau-Anregung
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_27557485.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_56115070.jpg)
Das folgende Bild zeigt eine Kieselalge mit aufsitzenden Bakterien im Lebendpräparat, Farbstoff: Acridinorange, Blau-Anregung
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_19016519.jpg)
Die folgenden 3 Bilder zeigen Pilzhypen im Lebendpräparat, Farbstoff: Acridinorange, Blau-Anregung
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_41479801.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_22950252.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_1436258.jpg)
Die folgenden 3 Bilder zeigen Ciliaten im Lebendpräparat, Durchlicht Phaco mit simultaner Auflicht Fluoreszenz.
Farbstoffe: DAPI (Bilder 1 und 2), Acridinorange (Bild 3), UV-Anredung (Bilder 1 und 2), Blau-Anregung (Bild 3)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_58886595.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_65540194.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_2793397.jpg)
Zwei Individuen von Stephanosphaera pluvialis Cohn, Durchlicht Phaco mit simultaner Auflicht Fluoreszenz, Eigenfluoreszenz des Chlorophylls, Blau-Anregung
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_47420448.jpg)
Die folgenden 2 Bilder zeigen Glockentierchen im Lebendpräparat, Farbstoff: Acridinorange, Blau-Anregung
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_65190186.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/84046_59305721.jpg)
Die folgenden beiden Bilder zeigen Bindegewebszellen der Maus in der Zellkultur, Durchlicht DIC mit simultaner Auflicht Fluoreszenz, Farbstoff: DAPI, UV-Anregung.
Wie man sieht kann man auch den differentiellen Interferenzkontrast mit Auflicht-Fluoreszenz kombinieren und erhält schöne Bilder.
Allerdings sollte man die Strahlenbelastung der empfindlichen Wollastonprismen im Objektiv möglichst gering halten
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_55551940.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84046_63037065.jpg)
Hallo Holger,
vielen Dank für diese phantastische Bilderserie, wirklich sehr eindrucksvoll!
Mich interessieren die emissionsseitigen Filter. Die scheinen - wenn die Beleuchtung simultan war - ja wesenlich breitbandiger gewesen zu sein, als das beispielsweise bei vielen derzeitigen Filterkombinationen von Zeiss der Fall ist. Da werden heutzutage oft sehr schmalbandige Filter eingesetzt, offenbar um hohe Trennschärfen zu erzielen, das Durchlicht kommt da nie so durch wie bei Deinen Bildern. Hast Du statt dessen Tiefpassfilter verwendet?
Schöne Grüße
Bernd
Danke für die Blumen, Bernd ;)
Zu den Filtern habe ich Dir ein paar Transmissionskurven und Daten angehängt.
Herzliche Grüsse
Holger
Es bedeuten: BP = Bandpass-Filter, RKP = Reflektionskurzpass-Filter, LP = Langpass-Filter
UV
Leitz Filterblock A
Anregungsfilter: BP 340-380
DichroitischerTeilerspiegel: RKP 400
Sperrfilter LP 430
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84055_34382840.jpg)
Blau
Leitz Filterblock H3
Anregungsfilter: BP 420-490
DichroitischerTeilerspiegel: RKP 510
Sperrfilter LP 515
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84055_410298.jpg)
Hallo Holger,
vielen Dank, damit ist alles klar! Insbesondere bei DAPI bleibt hier natürlich noch viel vom Durchlichtspektrum übrig.
Und entschuldige, dass ich Tiefpass geschrieben habe - natürlich heißt es in der Optik Langpass, auch wenn es beidesmal um die längeren Wellen geht ...
Herzliche Grüße
Bernd
Hallo Holger,
ich bin wirklich beeindruckt!
Je weiter ich nach unten scrolle, desto stärker leuchten nicht nur Deine Bilder.
Kannst Du mir bitte kurz den Färbevorgang mit Acridinorange an den Lebendpräparaten erklären?
Das würde mich interessieren.
Danke für die Fotos!
Herzliche Grüße
Frank
Holger,
An meinen Orthoplan habe ich keine Fluoreszenz aber wie ich deine Bilder beobachte muss das auch noch mal dran.
Die Chromosomen mag ich am meisten, klasse!
Grüße Ronald
Hallo Holger,
sehr schöne Bilder ! Eine Frage dazu : Wie lange leben Deine Tierchen bei der Acridinorangefärbung? Mit der UV-LED @ 365nm waren die schneller im Jenseits, als ich Aufnahmen machen konnte.
Schönes Wochenende und Grüße
Peter
Wunderbare Bilder lieber Holger und eine schöne Anregung!
Acridiorange kann ich kleinster Verdünnung 1:10.000 und kleiner schöne Vitalfärbungen machen.
Vor 2 jahren hatten wir auf Wohldenberg Fluoreszenzaufnahmen von Zieralgen gemacht, die mit AO angefärbt wurden. Auf die Schnelle habe ich dieses Bild in meinem PB-Album gefunden
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84142_40249471.jpg)
Nochmals allen Danke für das nette Feedback :)
@ Bernd: Der Tiefpass der Elektrotechnik entspricht dem Langpass in der Optik - ist völlig korrekt ;)
@ Frank und Klaus: Ich nehme auch eine Primärverdünnung von 1:10.000, tauche dann die Spitze einer Präpariernadel kurz darin ein und verrühre nur die winzige Menge, die an der Spitze haftet (!) mit dem Wassertropfen und den darin befindlichen Organismen auf dem Objektträger. Dann warte ich etwa 2 Minuten bevor ich das Deckglas auflege. Das führt zu einer schöneren und gleichmässigeren Anfärbung der Organismen. Ausserdem bleibt der Hintergrund dann schön schwarz und bietet so einen schönen Kontrast. Ich habe immer festgestellt dass hier weniger mehr ist.
@ Peter: In der Tat, während die Tierchen das Acridinorange und die Blaulichtanregung bis zu 30 Minuten tolerieren, gehen sie bei DAPI / UV Anregung in der Regel nach etwa 1 Minute kaputt.
@ Ronald: Ja, die Fluoreszenzmikroskkopie lohnt sich auch für die Histologie, man kann auch die Schnitte markieren. Die Quetschpräparate zeigen aber - man muss ja nicht alles schneiden ;D
Schöne Restnacht noch ;D
Holger
Hallo Holger,
könntest Du mir noch etwas zu der DAPI-Lösung sagen. Erzeugst Du hier erst eine Stammlösung und welches Mischungsverhältnis verwendest Du?
Und wie ist dann der Färbevorgang?
Viele Grüße
Frank
Hallo Frank (2), gerne:
DAPI kaufe ich in kleinen Mengen, es ist teuer aber sehr ergiebig. Ich löse 1 mg in 1 ml dest Wasser und fülle das dann 50 µl-weise in kleine Crimp-Flaschen (siehe Bild) ab, die ich dann sofort einfriere (das Rack mit den Fläschchen umwickele ich zum Lichtschutz noch mit Alufolie). Ich habe festgestellt, dass diese Stammlösung jahrelang hält.
Die Färbung von fixierten Zellen (in meinem Beispiel Heuschreckenhoden oder Maus-Fibroblasten) geschieht dann in einer mit Methanol aufgefüllten DAPI Stammlösung mit einer Endkonzentration von 1µg / ml (also 1000-fache Verdünnung der Stammlösung). Betrachtung unter dem Fluoreszenzmikroskop geschieht entweder (als Wegwerfpräparat) nach Einschluss des wieder lufttrockenen Ausstriches unter einem Deckglas in reinem Glycerin oder als Dauerpräparat nach Einschluss des wieder lufttrockenen Ausstriches in DPX, einem fluoreszenzfreien Einschlussmittel. Ich war erstaunt, wie gut meine ersten, in den 90er Jahren gefertigten Dauerpräparate heute noch fluoreszieren.
Als Lebendfarbstoff gehe ich genau so vor wie mit Acridinorange in meinem vorigen Beitrag beschrieben. Ich tauche die Spitze einer Präpariernadel in die DAPI Stammlösung und übertrage nur winzige daran klebende Tröpfchen in die Frischprobe auf dem Objektträger und warte - hier ca 5 min. Man sollte immer bei etwas reduzierter Beleuchtung arbeiten.
Originalarbeit:
Tanious FA, Veal JM, Buczak H, Ratmeyer LS, Wilson WD. DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) binds differently to DNA and RNA:
minorgroove binding at AT sites and intercalation at AU sites. Biochemistry 31 (1992) 3103-3112
Info zur Verwendung von DAPI:
http://www.applichem.com/fileadmin/produktinfo/a1001_de.pdf
Bleibt noch die Warnung, sauber und mit Handschuhen zu arbeiten. Die Substanzen keinesfalls einatmen oder verschlucken. Auch soll die Entsorgung professionell geschehen. Alle Fluoreszenzfarbstoffe, besonders aber die mit starker Bindung an die DNA (z.B. DAPI oder Ethidiumbromid) sind potentiell mutagen und karzinogen!
Herzliche Grüsse
Holger
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/84150_39615605.jpg)
Hallo Holger,
sehr interessant! Hast Du den Filterblock A (oder besser A2) mal mit ein paar Dünnschliffen getestet? Würde mich sehr interessieren.
Gruss,
Stefan
Gute Idee Stefan, ich werde beide Blöcke mal testen. Ich weis allerdings nicht ob der Kleber nicht fürchterlich fluoresziert, aber probieren geht über ...
Viele Grüsse
Holger
Hallo Holger,
ich habe noch eine kleine Menge DAPI und lagere sie trocken im Kühlschrank (schon ca. 2 Jahre).
Denkst du das ist noch zu gebrauchen bzw. würdest Du dazu raten eine Stammlösung zu erzeugen und diese einzufrieren?
Gruss
Frank
Hallo Holger,
vielen Dank, ich bin gespannt. Calcit sollte ein guter Start sein, oder Material aus Sterling Hill, falls Du welches hast. A2 ist die bessere Wahl, je kürzer die Wellenlänge, desto besser. Mir schwebt das schon sein einiger Zeit im Kopf, ich bin aber dank des Kampfes mit und gegen das Spektropmeter noch nicht dazu gekommen, abgesehen davon, das der A2 nicht gerade häufig ist.
Gruss,
Stefan
Ok Stefan, ich schau mal dass ich ich bald dazu komme.
@ Frank: Ja das DAPI sollte nach 2 Jahren im Kühlschrank absolut OK sein. Mach es so wie ich unten beschrieben habe: Stammlösung ansetzen, klein aliquotieren (50 µl) und dann einfrieren.
Grelles Licht beim Verarbeiten vermeiden.
DAPI ist übrigens relativ unempfindlich gegen Photobleaching und so bleibt die Fluoreszenz während der Beobachtung recht stabil und es braucht nicht eines der vielen Photostabilisierer wie z.B. DABCO oder p-Phenylendiamin.
Viele Güsse
Holger
Zitat von: Holger Adelmann in Januar 27, 2012, 10:22:42 VORMITTAG
...
ich sehe im Forum mehr und mehr Fluoreszenzaufnahmen, was mich sehr freut.
Man kommt durch die Verfügbarkeit von genügend energiereichen LEDs ja heute zunehmens auch ohne die teuren Entladungslampen aus, damit wird das schöne Verfahren auch für viele erschwinglich.
...
Holger, das ist mir auch schon aufgefallen.
Vielen Dank, das Du auch noch die Werte Deiner Filter gezeigt hast.
Mit scheint der Leitz Filterblock H3 dürfte in etwa vergleichbar mit dem hier im Forum auch gerne verwendeten Zeiss Filtersatz 09 zu sein. Und falls man Durchlichtlichtfluoreszenz mit Blauanregung betreiben möchte, kommt man mit einer 470 nm-LED, Anregungsfilter BG3 und Sperrfilter OG515 auch zu vorzeigbaren Ergebnissen.
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter
Zitatkleine Crimp-Flaschen
Warum ausgerechnet Crimpflaschen? Die sind doch viel viel teurer als normale Eppies. Hat das irgendeinen besonderen Grund?
Ansonsten super Aufnahmen.
@ Hyperion: Ich hatte die Crimpflaschen noch aus den 90er Jahren, Eppendorf Huetchen könnten auch gehen, aber ich habe damit keine Langzeiterfahrung was die Stabilität von darin eingefrorenen Sunstanzen angeht.
Ich hatte letztens noch eine eingefrorene DAPI Stammlösung aus den 90er Jahren in einer Crimp Flasche aufgetaut - die war tadellos.
@ Rolf-Dieter: So eine ähnliche LED / Filterkombo wie Du beschreibst habe ich auch nun in dem von Wilfried48 umgebauten SM Reisemikroskop verwirklicht. Ich bin noch dabei, die passende Optiken zusammenzustellen, dann werde ich das hier auch mal zum Vergleich zeigen.
Herzliche Gruesse
Holger
Hallo Holger,
ist die Haltbarkeit des DAPI-Farbstoffes in Form einer Stammlösung (nach dem von dir beschriebenen Verfahren eingefroren) besser als wenn der Farbstoff in pulverisierter Form im Kühlschrank aufbewahrt wird? Gibt es da Erfahrungswerte?
Viele Grüße
Frank
Hallo Frank,
die Haltbarkeit ist besser in der trockenen Form, aber die kleinste Menge die ich kaufen konnte war 1 mg und das war viel zu viel, bzw. reicht fuer etwa 100 Experimente - daher musste ich es irgendwie aliquotieren.
Gruss
holger
Nachschlag:
Chromosomen aus der Speicheldrüse der Zuckmückenlarve (gibt's im Winter lebend in Zoogeschäften). Quetschpräparat.
Bild 1 Phasenkontrast
Bild 2 Auflicht-Fluoreszenz, Markierung der DNA mit DAPI (UV-Anregung)
Bild 3 Kombination aus Durchlicht-Phasenkontrast und Auflicht-Fluoreszenz im simultanen Bild (keine Fotomontage).
Viel Spass beim Anschauen.
Holger
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/86599_21473476.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/86599_7997296.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/86599_59453713.jpg)
Hallo Holger,
Ich sehe jetzt nur die schönen Bilder am Anfang dieses thema, wirklich fantastisch! Beste Grüsse,
Rolf
Very impressive shots! :D
Arturo