Mikro-Forum

Abgebildet ein Tiyoda Dunkelfeldkondensor 1.2-1.4 UV fuer Fluoreszenzkontrast mit Zeissmontage.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/87690_15379165.jpg)

So weit ich heraus finden konnte handelt es sich hierbei um einen Kondensor für ein nicht mehr gebräuchliches Fluoreszensverfahren.

Ausgenutzt wurde die Tatsache, dass die durch das Anregungslichtes ausgehende Fluoreszenzstrahlung in jeder Richtung abstrahlt - also auch Richtung Objektiv - während die direkte Anregungstrahlung wie beim normalen Dunkelfeld nicht beim Objektiv ankommt.

Nun habe ich noch folgende Fragen:

- Muss resp. sollte nach dem Objektiv und vor den Okularen ein Filter verwendet werden um das Streulicht in der Anregungsfrequenz eliminieren zu
  können ?

- Von der Bezeichung her - "Darkfield UV Kondensor" wir suggeriert, dass der Kondensor für UV Licht durchlässig ist - weiss jemand
  wo für diesen Kondensor die Grenze liegt - kann hier Anregungslicht im UV Bereich verwendet werden welches von normalen Glassorten nicht
  mehr abgebildet wird ?

- Hat jemand mal mit diesem oder einem ähnlichen Teil gearbeitet und eine Anleitung oder weitere Tipps auf lager ?

                              Gruß,

                                     Rory

Hallo!

"UV-Licht" beschreibt in meinem Verständnis zumindest den Wellenlängenbereich von etwas über 400 nm bis noch deutlich unter 200 nm. Für Fluoreszenzanwendungen (Sekundär- und Immunfluoreszenz) ist sehr grob gesprochen der Wellenlängenbereich von ca. 350 nm bis ca. 400 nm von Bedeutung - DAPI und Mykoval/Fungiqual/Uvitex werden z. B. hervorragend mit 365 nm-LEDs angeregt. Dort sind selbst Optiken, die nicht für kurzwelliges Licht optimiert sind, noch durchlässig genug. Eng wird's erst unterhalb ca. 210 nm, dann werden Quarz-Optiken benötigt.

Gruß,

Jörg (Haus@Hund)

Hallo Rory,
als Ergänzung noch ein paar Hinweise:

ZitatSo weit ich heraus finden konnte handelt es sich hierbei um einen Kondensor für ein nicht mehr gebräuchliches Fluoreszensverfahren.

Dieses Fluoreszensverfahren ist zwar kommerziell inzwischen unbedeutend/ungebräuchlich, wird aber weiterhin praktiziert - auch von Leuten aus diesem Forum (z.B. Rolf-Dieter Müller, Nomarski, ich, ...)

ZitatAusgenutzt wurde die Tatsache, dass die durch das Anregungslichtes ausgehende Fluoreszenzstrahlung in jeder Richtung abstrahlt - also auch Richtung Objektiv - während die direkte Anregungstrahlung wie beim normalen Dunkelfeld nicht beim Objektiv ankommt.

Das ist in einem wichtigen Punkt nicht ganz korrekt: beim "normalen Dunkelfeld" (hier also im Durchlicht) kommt das beleuchtende Licht durchaus beim Objekt an. Was aber viel wichtiger ist: es gelangt auch hinter das Objekt in Richtung des Beobachters, denn sonst würde man nichts sehen. Nur ist dieses Licht an den Objektstrukturen gebeugt (diffacted). Das Gleiche gilt natürlich auch für kurzwelliges Anregungslicht: der gebeugte Teil davon ist auch hinter dem Objekt noch vorhanden. Außerdem gibt es in aller Regel noch Streulicht, das ebenfalls in Richtung Auge gelangen kann.

Zitat- Muss resp. sollte nach dem Objektiv und vor den Okularen ein Filter verwendet werden um das Streulicht in der Anregungsfrequenz eliminieren zu können ?

Ja, auf jeden Fall! Abgesehen davon, dass durch die oben genannten Effekte immer eine geringe Menge gebeugtes und diffus gestreutes Anregungslicht an das dann auf Dunkelheit adaptierte (und deshalb weit geöffnete!) Auge gelangen kann, besteht außerdem die Gefahr, durch einen Bedienfehler den Kondensor in einer Position zu nutzen, in der das Anregungslicht nicht überwiegend ausgeblendet wird. Da UV-Barrierefilter farblos sein können/dürfen, bieten sie für all diese Fälle Sicherheit und schränken die Beobachtung nicht durch ihre Eigenfarbe ein.

Zitat- Von der Bezeichung her - "Darkfield UV Kondensor" wir suggeriert, dass der Kondensor für UV Licht durchlässig ist - weiss jemand wo für diesen Kondensor die Grenze liegt - kann hier Anregungslicht im UV Bereich verwendet werden welches von normalen Glassorten nicht mehr abgebildet wird ?

Damit kann es zu tun haben, allerdings hat Jörg (Haus@Hund) ja schon geschrieben, dass auch konventionelle Optiken im langwelligen UV-Bereich ganz ordentlich durchlässig sind.

Zitat- Hat jemand mal mit diesem oder einem ähnlichen Teil gearbeitet und eine Anleitung oder weitere Tipps auf lager ?

Nicht von Tiyoda oder mit einer Gravur, die eine spezielle UV-Tauglichkeit suggeriert, sondern mit den herkömmlichen Kardioid-Dunkelfeld-Kondensoren von Zeiss-West und Zeiss-Jena. Ich habe diese Kondensoren in Kombination mit einer 365 nm-Nichia-LED verwendet, aber vorher sorgfältig darauf geachtet, dass im Beobachtungsstrahlengang ein guter UV-Barrierefilter saß.

Beste Grüße,
Thomas

Hallo,

es handelt sich offenbar um einen Dunkelfeld-Kondensor von sehr hoher Apertur, der wohl wegen dieser hohen Apertur speziell für Fluoreszenz in Dunkelfeld-Anregung herstellerseitig propagiert wurde. Ich gehe davon aus, dass man mit diesem Kondensor auch normale Dunkelfeld-Mikroskopie betreiben kann, ebenso, wie man grundsätzlich auch mit jedem sonstige Dunkelfeld-Kondensor Fluoreszenzanregung im Durchlicht-Dunkelfeld realisieren kann.

Neben UV-Filtern kann man auch Blaufilter (z.B. BG 12) u.a. zur Anregung verwenden. Der betreffende Erregerfilter kann einfach auf den Lichtdurchlass des Mikroskopes gelegt oder ggf. unter den Kondesnor geklemmt werden. Bei UV-Anregung müssen zum Augenschutz UV-Filter in die Okulare gelegt werden, bei Anregung mit langwelligerem Licht geeignete Sperrfilter (Langpass-Filter), welche das Erregerlicht blocken und das langwelligere Fluoreszenzlicht passieren lassen.

Wenn man keine Fluoreszenzfilter hat, kann man mit gutem Erfolg auch bei Dunkelfeld-Anregung monochromatische Astro-Filter einsetzen (meinerseits getestet von Baader Planetarium). Sperrfilter zum Einlegen in bzw. auf die Okulare gibt es z.B. bei Edmund-Optics. Auf diese Weise kann man für den "Hausgebrauch" Durchlicht-Fluoreszenz an einem üblichen Labormikroskop betreiben, ohne sich ein spezielles Auflicht-Fluoreszenzmikroskop kaufen zu müssen.

Die erwähnten Astro-Filter sind so konzipiert, dass man schon mit einer 50 Watt Halogenleuchte brauchbare Fluoreszenzbilder erzeugen kann. Bei Interese kann ich eine PDF-Datei mit näheren Angaben gerne via Email versenden.

Schöne fluoreszierende Grüße

Jörg Piper

Hallo Rory,

auf Yahoo gabs mal eine Diskussion zu Tiyoda:

http://tech.groups.yahoo.com/group/Microscope/message/48005

Angeblich von Reichert entwickelt. Gläser sollen aus Quarz sein, d.h. Transmission wäre dann bis unter 200nm mit Spiegelobjektiv oder den ganz seltenen 193nm Ultrafluaren für Arf-Excimer Laser. Normale Ultrafluare, wie Du sie hast, reichen "nur" bis 220 oder 240nm glaube ich. Mit einem 100er Objektiv NA 1.25 hat man ringförmige Beleuchtung, sofern das Objektiv nicht abgeblendet werden kann. Eine passende UV Lichtquelle, UV Projektiv und Kamera braucht man natürlich auch noch, wenn es unter 350nm sein soll. Meines Wissens kannst Du zur Abbildung auch einen panchromatischen SW Film verwenden, weil die auch im UV empfindlich sind.

Gruß

Thomas

Hallo Namensvetter,
ich habe die Yahoo-Groups-Lektüre nicht komplett durchgestanden, denn es geht da gleich mit ein paar schrillen Aussagen los.

Zunächst einmal ist Quarz (-glas) ein ungünstiger Begriff für den Stoff, aus dem die Linsen sind. Die Linsen sind mit tödlicher Sicherheit nicht aus Quarz, sondern aus einem Glas, das (wie Quarz) zu fast 100% aus SiO₂ besteht. Der Unterschied? chemisch gar keiner, aber Quarz ist ein kristalliner Stoff und besitzt Eigenschaften, die ihn für den Einsatz als optische Linse ziemlich ungeeignet erscheinen lassen: er ist doppelbrechend und hat eine große Härte. Kieselglas wäre ein sinnvollerer Ausdruck...

Für Fluoreszenzkontrast braucht man kein UV-Projektiv und auch keine spezielle Kamera, denn abgebildet wird ja i.a. sichtbares Licht. Etwas Anderes wäre die Anregung mit extrem kurzer Wellenlänge. Meinstest Du das? Ich gebe gern zu, dass ich mich mit diesem Bereich (Emission im UV) kein bisschen auskenne. Umso mehr würde mich interessieren, was es da für Anwendungen gibt (ernsthaft!).

Was es mit der Sensibilisierung des Films auf sich hat, ist mir nicht klar: egal ob panchromatisch, orthochromatisch oder gar nicht sensibilisiert: UV-empfindlich sind sie alle! So sehr, dass in der Fotografie der UV-Filter fast zur Grundausstattung gehört. Problematisch war es ja eher, die Silberhalogenide dazu zu bringen, auf längerwelliges Licht gleicher Intensität mit gleicher Schwärzung zu reagieren. Die UV-Empfindlichkeit ist ansonsten eher eine Plage als ein spezieller Nutzen. Oder habe ich etwas falsch verstanden?

Wahrscheinlich ist das aber gar nicht so sonderlich relevant, denn Filme (zumal schwarz/weiß) wird heute wohl kaum jemand ausgerechnet bei solch einem "ausschussträchtigen" Verfahren wie der Fluoreszenzmikroskopie einsetzen wollen (solch ein Satz fordert Widerspruch heraus und ich lasse mich da auch wirklich gern eines Besseren belehren ;)).

Tiefblau fluoreszierende Grüße,
Thomas

Hi Thomas,

ja, ist halt so, daß auch bei synthetischem Quarzglas meist nur von Quarz gesprochen wird, auch bei Quarz Deckgläsern. Von Rory gibts hier im Forum schon mehrere Anfragen, und er hat ein recht komplettes Ultrafluar Equipment mit UV Projektiv und seinerzeit auch nach Deep UV gefragt. Ok, nicht in diesem Thread, da gehts um Fluoreszenz, also zugegeben etwas off topic geantwortet. Weil beim Tiyoda nun Ringförmige Beleuchtung möglich ist bei Objektiven mit NA > 1.2 unter Verwendung von Glycerin, also direkter Abbildung, und Rory seinerzeit Interesse daran hatte, bin ich darauf eingegangen und habe auch noch mal den Tip mit dem Film gegeben.

Gruß
Thomas

Hoppla, Thomas, da habe ich wohl Einiges verpasst.

Bitte haltet mich / uns auf dem Laufenden, denn ich bin an solchen experimentellen Fluo-Anwendungen sehr interessiert (Hintergrund: rezentes und fossiles organisches Material, also der Grundstoff für Erdöl und Erdgas, fluoresziert bei sehr unterschiedlicher Anregung primär, also ohne irgenwelches Farbstoff-Gedöns 8)).

Direkte, ringförmige UV-Beleuchtung liest sich auch ganz interessant für hohe Auflösung mit einem interessanten Kontrast. Könnt Ihr das ein bisschen ausführen...?

Schönen Gruß,
Thomas

Hallo Thomas.

ZitatIch gebe gern zu, dass ich mich mit diesem Bereich (Emission im UV) kein bisschen auskenne. Umso mehr würde mich interessieren, was es da für Anwendungen gibt (ernsthaft!).

Bitte such hier im Forum mal nach 'Peter-h' und UV. Er zeigt an Diatomeen recht eindrucksvoll, wie sich das kurzwellige UV-Licht im Vergleich zu VIS-Beleuchtung auf die Qualität der Auflösung auswirkt - aber: das ist Physik und damit kenne ich mich kein bisschen aus  ;D
Eine andere nicht ganz unwichtige Anwendung von UV (< 260nm) ist ein Mikrospuren-Nachweis von Blut nach Behandlung mit (mir nicht bekannten) Chemikalien - geringste Mengen (< 1 µl) geben eine intesive Fluoreszenz, die dann im Vis-Bereich gezeigt und dokumentiert werden kann. Hierzu notwendig sind auf der Objektseite (DF-)Kondensor, OT und DG aus SiO₂-Glas, wie Du ja schon sagtest.
Viele Grüße
Joachim

Lieber Joachim,
Peters Beiträge sauge ich regelmäßig auf wie ... ja wie denn? Muttermilch ist wohl nicht der passende Begriff - eher Nektar ;D.
Die Auflösungssteigerung mit UV-Licht finde ich faszinierend, wenn ich auch immer ein bisschen schmunzeln muss, weil ja bei manchen Verfahren (insbesondere Dunkelfeld!) die Objektähnlichkeit verloren geht. Ich denke, das sollte man sich auch ganz bewusst machen: im Grenzbereich der Auflösung "sieht" man mit Dunkelfeld-Kontrast Strukturen, die mit höher auflösenden Methoden/Geräten, also z.B. Elektronenmikroskopie, anders aussehen. Mir ist bewusst, dass auch die Elektronenmikroskopie nicht frei von Artefakten und irreführenden Pseudo-Strukturen ist, aber an den Grenzen des jeweiliegen Verfahrens wütet leider das Chaos.

Einen DF-Kondensor für höchste und objektähnliche Auflösung einzusetzen ist mir dennoch neu. Das muss aber nichts heißen.

Hochauflösende Grüße,
Thomas