Hallo,
die Binse ist schon lange eines meiner Lieblingsobjekte und wird von mir immer mal wieder präpariert. Dieses mal habe ich die Wacker simultan II Färbung von Rolf-Dieter-Müller getestet. Hier die Vorgehensweise:
- kleine Stengel in AFE eine Woche fixiert
- in Wasser gewaschen
- in 20% PEG 1500 gelegt und das Wasser verdunsten lassen
- In einen PEG Block gegossen
- mit dem Jung Studentmikrotom 25, 30 und 40 µm Schnitte angefertigt
- wasserfeuchte Schnitte im Färbenapf mit WSII versetzt
- nach 5 Minuten mit Aqua dest. verdünnt
- 2 mal mit 100% Isopropanol entwässert
- 2 mal mit Xylol entwässert
- in Malinol eingeschlossen
Hier einige Fotos:
- Übersicht
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/94376_25209742.jpg)
-Übersicht Durchlichtfluoreszenz, Filter: LP 519,6 IF
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/94376_26966483.jpg)
- Nahansicht Leitbündel
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/94376_31884011.jpg)
- Nahansicht Leitbündel, Durchlictfluoreszenz
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/94376_32176063.jpg)
- Schließzellen und Leitbündel
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/94376_44150175.jpg)
- Nahansicht Schließzelle
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/94376_65326725.jpg)
Anmerkung zu den Fluoreszenzaufnahmen: Hier https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=12287.0 ist deutlich geworden, dass meine Fluoreszenzeinrichtung ohne einen gescheiten Filter nicht optimal ist. Die Lösung war nach längerem pröbeln ein LP 519,6 Interferenzfilter, der endlich den unerwünschten Blauanteil aus meinen Bildern wegfiltern konnte. Man muss allerdings immer noch die Belichtungszeiten optimieren. Zu lange Belichtungszeiten ergeben hier wieder den blaustichigen Untergrund.
Die WSII Färbemethode von Rolf-Dieter Müller finde ich super einfach in der Handhabung. Eine wirklich tolle Neuentwicklung.
Fragen an die Histologieexperten:
- Welchen Typ Stoma hat die Binse?
- Welches Leitbündel hat die Binse? (Habe ich leider in meiner Literatur nicht explizit gefunden)
Lieber Ralf,
danke für Deine schöne und interessante Dokumentation! Die Binse hatte ich vor zwei Jahren mal unter dem Messer - gefärbt habe ich seinerzeit mit Etzold FCA, aber die W3Asim II Färbung von Rolf-Dieter ist da schon eindrucksvoller - da muss ich wohl auch noch mal ran.
Zu den Stomata kann ich Dir leider nichts Konkretes sagen, man müsste dazu auch die Aufsicht sehen. Bei Gräsern (die Binse gehört allerdings zu den Süßgrasartigen - Poales) ist der Gramineentyp recht häufig. Ansonsten käme noch der Helleborus-Typ in Frage, der auch bei Monocotylen zu finden ist.
Die Leitbündel sind geschlossen kollateral, also ohne Cambium. Wächst der Binsenhalm, wachsen die Leitbündel nicht mit (können sie ohne Cambium auch nicht) sondern es werden einfach zusätzliche Leitbündel gebildet.
Herzliche Grüße
Jörg
Lieber Ralf,
Jörg hat Deine Fragen völlig korrekt beantwortet.
Herzliche Grüße
Detlef
Lieber Ralf,
herzlichen Dank für Dein Lob, das ich aber gerne für Deinen Schnitt erwidern möchte.
Es ist immer wieder beeindruckend wie dünn und gleichmäßig Du Deine Schnitte hinbekommst.
Ein Tipp noch zur Färbung. Sie ist von mir auf die Präparation und Einschluss in Euparal eingestellt, hierbei wird noch etwas beim Aushärten nachdifferenziert, da die Farblösung einen Überschuss an Acridinrot und Acriflavin enthält. Das ist von mir auch so gewollt.
Du führst interessanterweise eine neue Variante ein, in dem Du über Xylol in Malinol einschließt.
Für diesen Fall würde ich einmal probieren, den Schnitt in Ethanolstufen aufsteigender Konzentration (30%, 50%, 70%, 96%) und dann 100% Isopropylalkohol zu entwässern. Hierbei wird besonders bei der 30%-Ethanolstufe das Arcridinrot und das Acriflavin differenziert. Im Ergebnis würden die Schnitte etwas klarer aussehen.
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter
Zitat von: Rolf-Dieter Müller in Juni 03, 2012, 23:07:58 NACHMITTAGS
[...]
Du führst interessanterweise eine neue Variante ein, in dem Du über Xylol in Malinol einschließt.
Für diesen Fall würde ich einmal probieren, den Schnitt in Ethanolstufen aufsteigender Konzentration (30%, 50%, 70%, 96%) und dann 100% Isopropylalkohol zu entwässern. Hierbei wird besonders bei der 30%-Ethanolstufe das Arcridinrot und das Acriflavin differenziert. Im Ergebnis würden die Schnitte etwas klarer aussehen.
Guten Tag Herr Müller!
Haben Sie schon einmal versucht, aus einer niedrigen Alk.stufe direkt in 100% Iso zu gehen? Bei mir hat das ausgezeichnet funktioniert.
Ich zitiere aus:
http://www.klaus-henkel.de/isomethode.pdf
"Eine außerordentliche Arbeitsvereinfachung läßt Isopropylalkohol als Auswasch- und Entwässerungsmittel
zu. Wir müssen nicht stufenweise bis zum absoluten Alkohol ,,hochführen", es ist sogar besser, das nicht zu tun,
sondern aus 70-, 50- oder gar 40% Alkohol bzw. entsprechender alkoholischer Fixierlösung die Objekte direkt in
absoluten Isopropylalkohol zu bringen. Die dabei entstehenden unvermeidlichen Schrumpfungen der Zellen und
ihres Inhalts sind geringer als bei stufenweiser Anwendung von Isopropylalkohol. Zu diesem überraschenden
Ergebnis kam Dr. Dieter Krauter, der langjährige Herausgeber des Mikrokosmos (Krauter, D.: Methylglykol als
Entwässerungsmittel für biologische Objekte. In: Mikrokosmos 43, 1953/54, 92-94)."
Wenn Sie das schon probiert haben: Sahen Sie Nachteile?
Schönen Gruß
KH
Zitat von: Klaus Henkel in Juni 03, 2012, 23:41:17 NACHMITTAGS
...
Haben Sie schon einmal versucht, aus einer niedrigen Alk.stufe direkt in 100% Iso zu gehen? Bei mir hat das ausgezeichnet funktioniert.
...
Guten Abend Herr Henkel,
vielen Dank für Ihre Anmerkung, aber gerade das ist ja auch unser Standard-Arbeitsablauf wie Sie es in der von Ihnen verfassten Mikrofibel beschrieben haben. Auf den Arbeitsplänen zu den Färbungen verweise ich immer darauf hin.
Bei Schnitten von "krautigem" Pflanzenmaterial funktioniert die Entwässerung direkt in 100% Isopropylalkohol immer, bei der Etzold-Färbung ist das sogar zwingend, ansonsten wird das Chrysoidin vom mit Wasser verdünntem Alkohol gnadenlos ausgezogen.
Meine Erfahrung ist aber, das bei Moosen und Farnen die Überfärbung von Farben wie Acridinriot, Fuchsin und ggf. auch Chrysoidin hält und somit das Entwässern in Zwischenstufen von verdünntem Alkohol vorteilhaft ist.
Oder man macht es wie Anatol und differenziert gezielt und entwässert dann in 100% Isopropylalkohol.
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter Müller
Hallo,
@Jörg und Detlef: Danke für Info zum Leitbündel und der Stomata.
@Rolf-Dieter: Es war mir nicht bewusst, dass die Farblösung für einen Einschluss in Euparal optimiert war. Danke für den Hinweis. Die nächste WSII Färbung kommt bestimmt und dann werde ich vorher in Alkolstufen differenzieren. Ich möchte nämlich unbedingt in Malinol einschließen, weil dieses im Gegensatz zu Euparal keine Eigenfluoreszenz zeigt.