Liebe Forumsmitglieder,
für mich gab es einmal einen guten Grund zumindest einen Sommer lang aromatische Pflanzen auf meinem Balkon zu halten. Das war sehr lange her, und irgendwie ist der mit dem Thymian bepflanzte Balkonkasten nicht erneuert worden und hielt sich so über die Jahre ohne besondere Pflege, gestresst durch Sommer/Winter, ständiger Austrocknung und sicherlich ausgelaugter Erde.
Trotzdem treibt der Thymian im Frühsommer, zwischenzeitlich aber immer weniger. Wieso eigentlich, denn nach jedem Winter sieht der Kasten irgendwie nicht gut aus. Um diese Frage zu beantworten, habe ich heute Abend mit dem Rasierklingenmikrotom einen alten Spross aus dem junge Triebe kommen geschnitten und als Wasserpräparat mikroskopiert.
Der Schnitt sieht doch ganz gut aus, besonders die Fluoreszenzaufnahme (Bild 1) zeigt widererwarten vieles an lebendem Chlorophyll. Ausgenommen das was um den Spross herum zu sehen ist. Das ist kein aus dem Schnitt verschlepptes Chlorophyll, das dürfte eher Chlorophyll von Algen sein die sich an dem überalterten Thymian angesiedelt haben.
Damit man einen ersten Eindruck von dem vergessenen Thymian, es dürfte der Kriechende Thymian (Thymus polytrichus) sein, bekommt, zeigt Bild 3 einen Spross mit neuen Trieben (links), daneben ein Überblick vom Balkonkasten mit Streichholz zum Größenvergleich (rechts).
Bild 2 ist eine Hellfeldaufnahme (Halogenlicht) des Sprossquerschnitts zur allgemeinen Orientierung.
Beide Mikrobilder sind aus je zwei Einzelbildern zusammengesetzt, aufgenommen mit dem 10x/0,3 PlanNeofluar.
Bild 1 - Primärfluoreszenz (470 nm LED-Auflicht, Zeiss Filtersatz 09).
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/95895_45523402.jpg)
Bild 2 - Hellfeld
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/95895_35287174.jpg)
Bild 3 - Habitus
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/95895_44419000.jpg)
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter Müller
Lieber Rolf-Dieter,
Deine Primärfluoreszenz, wie immer 1A..
Gruß
Hans-Jürgen
Hallo Rolf-Dieter,
tolle Panoramen und ich freu mich schon auf die Bilder der gefärbten Schnitte!
Liebe Grüße aus dem verregneten Wienerwald
Franz
Hallo Rolf-Dieter
Du zeigst da wieder ein spannendes Thema, ich hatte auch Thymian auf der Terrasse, der hat über Jahre das gleiche erleben dürfen und war auch nicht unter zu kriegen ...
Liebe Grüße aus Wien
Gerhard
Lieber Rolf-Dieter,
danke für die schönen Bilder!
Dein altes Thymianstämmchen scheint eine gut besiedelte Borke zu haben, zumindest lässt das kräftige Rot an dieser Stelle auf Algen oder Moose schließen.
Herzliche Grüße
Jörg
Toll, die Fluoreszenzaufnahme.
Wie Jörg finde ich auch die intensive rote Fluoreszenz in der Borke spannend, bitte schau doch mal nach Algen, lieber Rolf-Dieter.
Herzliche Grüsse
Holger
Lieber Rolf-Dieter,
eine spannende Sache hast Du da mit der Primärfluoreszenz ausgegraben. Gibt es ausser Chlorophyll noch einen Inhaltsstoff, der rot fluoresziert, oder ist Chlorophyll in den Markstrahlen vorhanden?
Herzliche Grüsse
Eckhard
Heute möchte ich zu dem Thymian-Beitrag noch einen Ausschnitt ergänzen.
Vorher aber noch meinen Dank zu Euren Kommentaren.
@Hans-Jürgen, ja ich finde die Primärfluoreszenz als Ergänzung zu nativen und vielmehr aber zu gefärbten äußerst interessant.
@Franz, wenn ich schneide werden üblicherweise Schnitte gleich als Wasserpräparat (wie die im Eröffnungsbeitrag gezeigten beiden Bilder) verarbeitet. Darüber hinaus lege ich Schnitte unfixiert und ungefärbt in Glycerin ein und natürlich kommen die meisten in AFE für Färbungen, die ich in der Regel einen Tag später mache. Die Darstellung eines gefärbten Schnittes ist also in Vorbereitung.
@Gerhard, interessant Deine Bestätigung. Der Thymian scheint wirklich robust zu sein. Meiner ist ca. 15 Jahre im Kasten, ab sofort bekommt er aber von mir mehr Aufmerksamkeit.
@Jörg, es sind sicherlich Algen und wäre der Spross dicker, könnten sich eventuell auch Flechten daran ansiedeln. Jedenfalls gibt es im Umkreis von wenigen Metern an anderen Stellen kleine Flechtenansiedlungen. Als Mikroskopiker stehen sie bei mir natürlich unter absoluten Schutz und werden nicht entfernt.
@Holger, Deinen Hinweis folgend habe ich nachgeschaut, ein guter Anlass mal wieder mein 63x PlanNeofluar zu ölen (siehe unten).
@Eckhard, in den Markstrahlen ist offensichtlich Chlorophyll enthalten, was anderes in Rot fluoreszierend kenne ich (noch) nicht. Vielen Dank übrigens, das Du es an eigenen Schnitten einer anderen Pflanze gezeigt hast und mir davon ein Bild zeigen konntest.
Jetzt zu Holger's Anregung, genauer in die Borke zu schauen.
Ich hatte ja Schnitte in Glycerin eingelegt, und einen besonders dünnen habe ich mit dem 63/1,25 PlanNeofluar im Ausschnitt aufgenommen. Gut ist hier die Besiedelung zu sehen.
Bild 4 – Hellfeld, der Schnitt ist nicht fixiert und nicht gefärbt. Glycerinpräparat
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/96100_59408853.jpg)
Bild 5 – Primärfluoreszenz (Autofluoreszenz), Anregungslicht 470 nm-LED / 700 mA, Auflicht, Zeiss Filtersatz 09 = Anregung 450 -490 nm, Emission 515 nm. Präparat wie Bild 4.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/96100_56152722.jpg)
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter
Lieber Rolf-Dierter,
einen schöneren und überzeugenderen Beweis könnte man sich nicht denken. Super Bilder! Gehört ins Lehrbuch!
Jetzt fehlt eigentlich nur noch der selbe Beweis bei den rot fluoreszierenden Pünktchen im Markstrahl - sind das nicht auch Algen?
Lieber Klaus,
Algen in den Strahlen? Das passt nicht in mein Weltbild. Aber Plastiden sollten es sein, die eigentlich nur Stärke enthalten, aber in dem Fall vielleicht doch etwas Chlorophyll.
Herzliche Grüße
Detlef
Lieber Detlef,
ZitatAlgen in den Strahlen? Das passt nicht in mein Weltbild
In meines ja auch nicht, aber Chlorophyll in den Markstrahlen ist auch ungewöhnlich ???
Warten wir auf R-D.´s Beweis!
Mir scheint auch, dass die Rotfluoreszenz in den Markstrahlen nicht so intensiv ist, wie die der Algen in der Borke, was ein Indiz sein könnte, dass es etwas anderes ist.
Lieber Rolf-Dieter,
die Aufnahmen mit dem 63x finde ich einfach grandios. Vor allem bei der Primärfluoreszenz kommt der Begriff "Photonensammler" in den Sinn :)
Erstaunlich ist für mich, dass das Chlorophyll der Algen immer noch intakt ist - trotz der Aufbewahrung in Glyzerin.
Lieber Klaus,
ZitatWarten wir auf R-D.´s Beweis!
da Rolf-Dieter sich auf meinen Kastanienschnitt bezogen hat, liefere ich hier den
Corpus delicti: http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=12844.msg96181#msg96181
Ob es sich bei der Primärfluoreszenz in den Markstrahlen um Chlorophyll handelt, weiss ich nicht. Aber auffällig ist das schon.
Herzliche Grüsse
Eckhard
Bevor ich der Anregung von Klaus Herrmann nachkomme und den Hinweis von Eckhard unterstütze Detailaufnahmen in Primärfluoreszenz nachzureichen, möchte ich erst einmal die versprochene Färbung zeigen.
Präparation:
- Frischer Stängel mit dem Haga-Rasierklingenmikrotom geschnitten
- Schnitte für 24 Stunden in AFE(50) fixiert
- Fixierlösung über 50% Ethanol und 30% Ethanol in Wasser ausgewaschen
- Färben für 10 Minuten mit W3Asim II (Wacker simultan, enthält Acridinrot, Acriflavin und Alcianblau). Zum Anfang Farblösung mit dem darin enthaltenen Schnitt auf ca. 60° Celsius erwärmt
- Gefärbten Schnitt in Wasser ausgewaschen
- Differenzierung in 30% Ethanol bis keine Farbe mehr abgeht, dafür das Ethanol mehrmals gewechselt.
- Entwässerung in 96% Ethanol, dafür 3x gewechselt
- Einschluss in Euparal
- Präparat wurde danach 8 Tage auf Wärmebank bei ca. 45° Celsius gehärtet (mangels Wärmeschrank erfolgte die Härtung auf meiner improvisierten Wärmebank. Das ist ein kleiner Zettelkasten aus Metall in dem von unten eine Heizfolie für Autorückspiegel eingeklebt ist).
Bitte beachten: Üblicherweise wird mit 100% Isopropylalkohol entwässert, was auch weiterhin gemacht werden sollte. Das gilt besonders für die Etzold-Färbung. Die hier vorgestellte Präparation ist eine Probe um zu testen, ob man bei der Wackerfärbung ggfs. mit einer Reagenz weniger auskommt.
Das nachstehende Übersichtsbild ist mit Photoshop Elements 10 aus 15 Einzelaufnahmen zusammengerechnet, aufgenommen mit dem 16x/0,5 PlanNeofluar, immergiert mit Wasser. Mit Wasser kann ich aber nicht die volle Auflösung nutzen, denn sie gilt nur für Öl.
Dafür habe ich aber RAW-Bilder verarbeitet. Von der zusammengerechneten Originaldatei könnte ich ein Poster 100 x 100 cm bei 240 dpi ohne Auflösungsverlust ausbelichten lassen.
Bild 6
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/96730_62703914.jpg)
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter
Sehr schick, lieber Rolf-Dieter !
Kann man bei dieser Färbung sagen, welcher Farbstoff an welche (chemischen) Zielstrukturen bindet um somit einen Eindruck über den Aufbau der einzelnen Gewebe zu bekommen?
Die Algen kommen übrigens im Fluoreszenz-Bild mit dem hochauflösenden Objektiv ebenfalls toll heraus.
Herzliche Grüsse
Holger
Zitat von: Holger Adelmann in Juli 03, 2012, 23:56:05 NACHMITTAGS
...
Kann man bei dieser Färbung sagen, welcher Farbstoff an welche (chemischen) Zielstrukturen bindet um somit einen Eindruck über den Aufbau der einzelnen Gewebe zu bekommen?
...
Lieber Holger,
für die Wackerfärbung hat Robin Wacker dieses u.a. in seinem Mikrokosmos-Beitrag beschrieben: ,,Eine neue und einfache Methode zur polychromatischen Anfärbung von Paraffinschnitten pflanzlicher Gewebe für Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie. Mikrokosmos Heft 4/2006, Seite 210-212.
Für meine hier gezeigte Färbung habe ich das in der Originalvorschrift enthaltene Astrablau durch Alcianblau ersetzt und verwende sie als auszudifferenzierende Simultanfärbung.
Es kann somit im Detail Abweichungen von der Originalschrift geben. Deshalb möchte ich mich bei der Beschreibung nur auf die Hauptmerkmale beschränken.
Acridinrot (=roter Farbstoff) färbt indifferent, jedoch nach Differenzierung in mit Wasser verdünntem Alkohol typisch lignifizierte (verholzte) Zellwände.
Alcianblau (= blauer Farbstoff) färbt typisch nicht-lignifizierte (unverholzte) Zellwände.
Acriflavin (=gelber Farbstoff) färbt lignifizierte und nicht-lignifizierte Zellwände indifferent, doch nach Differenzierung innerhalb der genannten Zellwandgruppen wiederum typisch. Es ergibt in Kombination mit Alcianblau ein Grün und in Kombination mit Acridinrot ein Tiefrot bis Orange. Bei jüngerem lignifizierten Gewebe zieht es nicht auf, dann färbt nur Acridinrot mit einem Magentaton (hier im Forum als Frühjahrsüberraschung bekannt, wenn in den Schnitten das Rot vermisst und gesucht wird). Bei nicht-lignifiziertem Gewebe kann man oft beobachten, das Kambium und/oder Phloem nicht angefärbt wird, es färbt dann nur Alcianblau mit einem Blauton.
Emig schreibt in seinem hervorragenden Buch ,,Stain technique", das Acridinrot für Färbungen genommen werden kann, die mit Safranin gute Resultate ergeben, jedoch heller aufzieht. Mit nachstehender Färbung kann ich das ganz gut zeigen. Auf Basis der Wackersimultanfärbung var. Alcianblau (W3Asim II) habe ich Acridinrot durch Safranin ersetzt und den Schnitt simultan gefärbt.
Jetzt ist dieser Schnitt etwas dicker und somit zieht die Färbung kräftiger auf. Aber ich denke man kann trotzdem ganz gut den Unterschied erkennen.
Eine Aufnahme (keine aus Einzelaufnahmen zusammengesetztes Bild) mit 10x/0,3 PlanNeofluar aufgenommen.
Bild 7: Thymian Spross quer, Simultanfärbung mit Safranin, Acriflavin und Alcianblau
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/97388_62810779.jpg)
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter
Lieber Rolf-Dieter,
eine schöne methodische Gegenüberstellung der Färbungen.
Erstaunlich finde ich, dass das Safranin so intensiv aufzieht.
Eigentlich finde ich die Variante mit dem Saranin noch ansprechender - obwohl die etwas kitschig wirkende Wacker sehr fein differenziert.
Danke lieber Rolf-Dieter, das hast Du sehr gut erklärt !
Herzliche Grüsse
Holger
Lieber Holger,
Lieber Klaus,
vielen Dank für Eure Kommentierungen.
Bevor ich eine Detailaufnahme der Pünktchen im Markstrahl zeige, möchte ich noch auf eine Anmerkung von Klaus eingehen.
Zitat von: Klaus Herrmann in Juli 10, 2012, 08:35:20 VORMITTAG
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Erstaunlich finde ich, dass das Safranin so intensiv aufzieht.
Eigentlich finde ich die Variante mit dem Saranin noch ansprechender - obwohl die etwas kitschig wirkende Wacker sehr fein differenziert.
Klaus, ich finde auch etwas ungewöhnlich, das Safranin so intensiv aufgezogen ist. Es liegt wohl an dem etwas dickeren Schnitt, bei dünneren Schnitten der gleichen Serie wirkt es deutlich blasser. Ich vermute aber das die Färbung mit dem Aushärten doch noch etwas nachlässt. Das kann man aber erst nach einigen Wochen abschließend beurteilen. Aber ich stimme Dir zu, das Safranin wirkt ansprechender und sicherlich werde ich auf dieser Basis noch einiges versuchen, zumal es ja auch ein Sekundärfluoreszenzfarbstoff ist.
Jetzt zu Deinem etwas älteren Auftrag, den ich leider erst jetzt nachkommen konnte:
Zitat von: Klaus Herrmann in Juni 25, 2012, 23:55:56 NACHMITTAGS
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Jetzt fehlt eigentlich nur noch der selbe Beweis bei den rot fluoreszierenden Pünktchen im Markstrahl - sind das nicht auch Algen?
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Das Chlorophyll in den Markstrahlen wurde ja zwischenzeitlich auch von Eckhard im mehrjährigen Kastanienspross gezeigt: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=12844.0, aber Eckhard hat es ja auch nicht auf Algen angelegt.
Algen sind es nun nicht, obwohl man bei unseren Schnitten immer vorsichtig beurteilen muss, inwieweit Zellinhalte und/oder Gewebe von außen und innen in den Schnitt verschleppt und verteilt werden.
Ich habe ein anderes Sprossstück frisch geschnitten, es ist somit nicht mit den bevor gezeigten Färbungen direkt vergleichbar (Die Färbungen aber mit den davor gezeigten Hellfeld- und Fluoreszenzaufnahmen schon = eine Schnittserie). Was wir aber vergleichen können ist die Gegenüberstellung mit den Hellfeldaufnahmen, die zu gleicher Zeit und bei derselben Präparatepositionierung gemacht wurden.
Geschnitten wurde wiederum mit dem Rasierklingenmikrotom, vor jedem Schnitt ist die Sprossoberfläche mit Wasser (Leitungswasser) befeuchtet worden, ein Schnitt wurde als Wasserpräparat mikroskopiert. Somit ist alles ursprünglich.
Aufnahmedaten: Jeweils Einzelbilder. Übersichtsbild mit dem 10x/0,3 PlanNeofluar, Ausschnitt mit dem 63x/1,25 PlanNeofluar.
Primärfluoreszenz (470 nm LED-Auflicht, Zeiss Filtersatz 09), d.h. Blauanregung und Sperrfilter 515 nm.
Bild 8: Thymian, Spross quer. Hellfeld und Primärfluoreszenz (Autofluoreszenz, Eigenfluoreszenz)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/97577_17288077.jpg)
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter
Lieber Rolf-Dieter,
schön, dass du es nochmal aufgegriffen hast. Du hast es auch perfekt gegenüber gestellt!
Aber ich sehe im HF auch im Detail nichts an der Stelle, an der man die orangen Punkte sieht in der Autofluoreszenz.
Siehst du denn bei Direktbeobachtung was? Eventuell in der Polarisation?
Aber ich dneke, du hast Recht Algen sind es nicht, die Fluoreszenzfarbe ist bei den Algen stärker im Rot - hier haben wir Orange!
Hallo,
wenn man z.B. diese Stelle hier vergrößert (was mir mit den mir gerade zur Verfügung stehenden Bordmitteln nicht gelingt), sieht man, daß an der mit dem Pfeil markierten Stelle ein schwachgrüner Fleck ist. Genau dort wos in der Fluoreszenzaufnahme orange leuchtet:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/97582_37722553.jpg)
Grüße
Martin
Hier jetzt nochmal.
Das meine ich:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/97598_60844870.jpg)
Grüße
Martin
Hallo Martin,
ich seh zwar fast nix, aber genau da ist ja ein rotorange fluoreszierender Punkt.
Hast du vielleicht UV-Augen? ;)
Hallo Klaus,
ich hatte ja nur die fürs Forum runtergerechnete Aufnahme zur Verfügung. Vielleicht zeigt uns Rolf-Dieter die Stelle des Präparats in größer... ;-)
Grüße
Martin
Zitatich hatte ja nur die fürs Forum runtergerechnete Aufnahme zur Verfügung
Schade, dass mein Sohn nicht da ist, der hätte einen grünen Punkt im gelben Sack da reingezaubert! ;D
Lieber Klaus,
Lieber Martin,
ich habe ausgehend von den Originalbildern das Fluoreszenzbild (Bild 8 unten rechts) mit 50% Transparenz auf das Hellfeldbild (Bild 8 unten links) gelegt (= Bild 9 oben links).
Bild 9 oben rechts ist davon ein Ausschnitt, Bild 9 unten rechts dieser Ausschnitt ohne Fluoreszenzbildüberlagerung und Bild 9 unten links die betreffende Zelle nochmals vergrößert.
Martin hat Recht, es ist ein leicht grüner Zellinhalt zu sehen der in Rot fluoresziert. Für eine bessere Darstellung hätte ich von vornherein die Fokusebene darauf legen müssen.
Bild 9
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/97635_1453241.jpg)
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter