Hallo,
ich möchte euch heute Bilder zeigen bei denen ich mir nicht sicher bin ob es sich überhaupt um Fluoreszenz, oder vielleicht um etwas ganz anderes handelt.
Dazu später mehr, wenn ich ein paar feedbacks von euch erhalten habe, um eure Meinung nicht zu beeinflussen.
Da diese Bilder mit einer Frage in Verbindung stehen, bin ich mir zwar nicht sicher ob ich hier Richtig bin, allerdings finde ich die Bilder ganz nett, deshalb hier.
Hahnenfuß, Objektiv Plan 25x:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/101325_4828372.jpg)
Jetzt mit Anregungsfilter/Sperrfilter, Objektiv Plan 25x:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/101325_63745557.jpg)
Belichtungszeit 2 Sekunden.
Queerschnitt von Schwarzkiefer, Präparat von David15, Objektiv Plan 10x:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/101325_63431044.jpg)
Belichtungszeit 1,6 Sekunden
Anregungsfilter/Sperrfilter Objektiv Plan 10x:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/101325_50536002.jpg)
Anregungsfilter/Sperrfilter, Objektiv Plan 25x:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/101325_58710167.jpg)
Belichtungszeit 4 Sekunden
Anregungsfilter/Sperrfilter, Objektiv Plan 25x, jedoch Weißpunkt in einem schwarzen Bereich gesetzt:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/101325_58306612.jpg)
Belichtungszeit 30 Sekunden !
Alle fluoreszenz(?) Aufnahmen wurden mit einer CREE XM-L U2 LED bei 0,74 Ampere gefertigt.
Bei dieser Gelegenheit möchte ich mich nochmals für die wunderbare LED-Adaption bedanken die von einem Forumsmitglied gefertigt wurde.
Da ich mir jedoch nicht sicher bin ob er in diesem Fall beim Namen genannt werden möchte, unterlasse ich es vorerst vorsichtshalber.
DANKE
Herzliche Grüße,
Johannes
Edit: Präparat der Schwarzkiefer wurde mit einem Namen versehen, danke David für den Hinweis.
Lieber Johannes,
Bei Bild 3 handelt es sich um einen Längsschnitt der Schwarzkiefer. Ich kenne mich mit Fluoreszenz nicht aus aber soweit ich weiß, sollte zumindest bei diesem Längsschnitt keine richtige Fluoreszenz sichtbar sein. Der Schnitt müsste mit einem Fluoreszenz Farbstoff gefärbt sein damit man etwas sieht. Oder man nimmt vom selben Objekt einen frischen, nicht fixierten Schnitt da bei Chlorophyll fluoreszenz sichtbar ist.
Viele Grüße
David
Hallo Johannes,
es sieht zumindest ganz danach aus, daß echte Fluoreszenz vorliegt. Was für Filter hast du denn verwendet?
Und was bedeutet Weißpunkt in den schwarzen Bereich versetzen?
Viele Grüße
Bernd
Hallo Johannes,
was Du zeigst ist Sekundärfluoreszenz.
Mir kommt nur die Belichtungszeit recht lang vor, bei Dir ja deutlich länger als eine Sekunde.
Optimal abgestimmt sollten bei dieser Färbung ca. 1/10 bis 1/25 Sekunde (ASA 200) reichen.
Das ist natürlich abhänging von Anregungslicht-Intensität, numerische Apertur Deiner Objektive und der verwendeten Filter.
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter
Hallo Johannes et al. -
die Ausdrücke "echte" und "falsche" Fluoreszenz sollte man vermeiden!
Hier dreht es sich - wie Rolf-Dieter schon angemerkt hat um Sekundärfluoreszenz, das heißt, was fluoresziert sind überwiegend Farbstoffe, welche zur Anfärbung des Schnittes verwendet wurden und nicht die Primärfloreszenz von Bestandteilen des frischen Schnittes. Letztere leuchten bei UV/Blau-Anregung überwiegend gelb z.B. bei verholzten Teilen (u.a. durch Flavonoid-Bausteine), oder hellblau (Stilbene - wir kennen einige als optische Aufheller in Waschmitteln) oder rot bei Chlorophyll.
Sekundärfluoreszenz kann sehr schön sein, aber man kann daraus keine Schlüsse auf Inhaltsstoffe ziehen.
Ich rate mal, weil du deine Filterkombinationen nicht angegeben hast:
Natürlich überlagern sich Fluoreszenzfarben bei gefärbten Schnitten. Die Rotfluoreszenz des Farbstoffs, der an die verholzten Teile geht ist bei dir so intensiv, dass die gelbe Primärfluoreszenz davon überlagert wird. Wenn du das Rot aber wegfilterst, wird das Gelb wieder sichtbar - allerdings musst du viel länger belichten, weil es eben nur schwach ist.
Kann aber auch sein, dass der Farbstoff selbst noch einen schwachen Gelbanteil hat und andere Farbstoffe haben eh eine gelbe Fluoreszenz.
Beim Chlorophyll gibt es neben der prompten Fluoreszenz, die sofort erlischt, wenn du das Anregungslicht ausschaltest, auch noch eine verzögerte Fluoreszenz, die minutenlang nachleuchten kann. Diese tritt aber nur in Frischmaterial auf, wobei der Photosyntheseapparat intakt, jedoch irgendwo gehemmt sein muss. Im Mikroskop ist diese jedoch nur durch großen Aufwand sichtbar zu machen weil sie sehr schwach ist.
Hier deshalb nochmals die öfter wiederholte Anregung: Falls man an Fluroreszenz interessiert ist, bitte vor der Färbung immer auch ein Foto der Primärfluoreszenz machen!
Viele Grüße
Rolf
Hallo,
zuerst einmal Danke für eure Antworten.
Hier ist ein Satz gefallen der sich in meinem Hinterkopf eingenistet hatte.
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=13119.msg98771#msg98771
Genau genommen dieser von Ewald:
ZitatBeide Filter hintereinander sollten kein Licht mehr durchlassen
Wie Praktisch ! ;D
Dank dieses Satzes habe ich scheinbar
Sekundärfluoreszenz um 60 Cent verwirklichen können.
Achtung: Bei dieser Methode kann es durch die benötigte hohe Lichtleistung zu Augenschädigungen kommen, ich verwende ausschließlich das Live View meiner Kamera dafür !!!!!!!!!Dieses Bild erklärt sicher viele der hier aufgeworfenen Fragen und auch warum ich nicht gleich damit herausgerückt bin wie ich es gemacht hatte.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/101351_27712089.jpg)
Lichtaustritt Phototubus
Insgesamt sind 4 Folien übereinandergelegt, um sicher zu gehen das der oben zitierte Satz zutrifft, was eventuell etwas übertrieben ist, jedenfalls erklärt es die langen Belichtungszeiten (ISO 100).
Dafür das mich das ganze nur 2 Stück billige 3D-Brillen gekostet hat, geht es doch ganz ordentlich.
Vielleicht konnte ich damit ja Sekundärfluoreszenz für die breite Masse zugänglich machen ?
ZitatUnd was bedeutet Weißpunkt in den schwarzen Bereich versetzen?
Die Stelle für den Weißabgleich wurde im dunklen Bereich des Bildes gesetzt.
LG
Johannes
Hallo Johannes -
ja denken statt zahlen ;D -
es bestätigt sich wieder mal, dass man in optischen Randgebieten (3D-Brillen, ob farbig ob POL, Handyfolien usw.) Dinge zu einem Bruchteil des Preises findet, den man zahlen muss, wenn auf der Schachtel was von Mikroskop oder Foto steht. Vielleicht findest du noch eine billige Quelle für Gelb/Blau, dass du den Farbbereich der Fluoreszenzen erweitern kannst.
Viel Erfolg
Rolf
Hallo,
gelbe und blaue Folien gibt es im Musikfachgeschäft (auch Rot und Grün und andere Farben) oder hier:
http://farbfiltershop.de/
Die werden normalerweise für farbige Scheinwerfer gebraucht, eignen sich aber auch sehr gut für Filterbastelleien in der Mikroskopie.
Natürlich ist es etwas anderes, wenn man "Plastefilter" verwendet, als die teuren Glasfilter, die für professionelle Anwendungen entwickelt wurden, wo der Preis eine untergeordnete Rolle spielt, die Ergebnisse aber überprüfbar und wiederholbar sein müssen. Mit den Billiglösungen lässt sich im Hobby-Bereich aber gut leben und arbeiten. Es ist nur immer etwas problematisch, die Dinger nicht zu zerkratzen.
Grüße
Gerd
Hallo Johannes,
so werden deine 60-Cent Filter wohl die Eigenschaften eines Kurzpass-Filters und eines Langpassfilters aufweisen, die man für die Fluoreszenzmikroskopie benötigt. Sind die Transmissionskurven eigentlich auch im Preis dabei?
ZitatVielleicht konnte ich damit ja Sekundärfluoreszenz für die breite Masse zugänglich machen ?
Ich hoffe aber nicht, daß dabei welche auf die Idee kommen, eine HBO XBO dahinterzuklemmen. Da sollte man sich doch besser etwas kundig machen.
Was die "echte" und "falsche" Fluoreszenz anbelangt, so lassen sich mit bestimmten Rheinberg-Blenden teilweise ähnliche Effekte erzielen.
Viele Grüße
Bernd
Zitat von: Nomarski in August 18, 2012, 19:04:36 NACHMITTAGS
...
ZitatVielleicht konnte ich damit ja Sekundärfluoreszenz für die breite Masse zugänglich machen ?
Ich hoffe aber nicht, daß dabei welche auf die Idee kommen, eine HBO XBO dahinterzuklemmen. Da sollte man sich doch besser etwas kundig machen.
...
Bernd, da kann ich Dir nur zustimmen. Für die schädigende Wirkung reicht nicht nur die HBO. Erst vor kurzem musste ich die Erfahrung machen, das sichtbares blaues Licht innerhalb von Sekunden Algen-Chlorophyll zerstört. Und das bei bestimmungsgemäßer Anwendung. Das gibt dann doch zu denken und umso vorsichtiger muß man mit solchen Versuchen sein. Eine Schädigung der Augen ist nicht mehr reparabel.
Dabei kann man den Sekundärfluoreszenzeffekt auch ohne Geldinvestition studieren. Indirektes Tageslicht im Streiflicht reicht bei geeigneten Präparaten vollkommen aus.
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter
Hallo,
die Warnung ist sicher ernst zu nehmen !
Ich werde deshalb einen fetten Warnhinweis in meinem obigen Beitrag einbauen.
Da ich aber ausschließlich mit dem Live View meiner Canon am PC-Monitor arbeite, habe ich dieses Problem nicht.
LG
Johannes
Hallo Johannes,
die gefährlichen Strahlen kommen aber schon eher aus dem Lichtaustritt, der bei dir so schön offen ist. Aus dem Fototubus sollte nur Licht oberhalb 500nm durchkommen, sofern deine Low-Cost-Sperrfilter was taugen.
Deswegen oftmals dieser orange Sichtschutz.
Viele Grüße
Bernd
Hallo Bernd,
da ich nur eine normale weiße LED benütze, sehe ich da jetzt nicht so eine große Gefahr durch Streulicht.
Bei z.B Dunkelfeld, vielleicht sogar in Kombination mit Pol, muss man auch ganz schön Saft auf die LED geben.
Ein wenig Hausverstand gehört natürlich schon dazu!
Du schreibst ja auch nicht bei deinen hervorragenden Beiträgen, die das Thema verharzte Triebe haben, einen Warnhinweis hinzu.
Bei diesen Arbeiten kann einen das Mikroskop auf die Zehen fallen und einige Knochen brechen. ;D
LG
Johannes
Hallo Johannes,
Zitatda ich nur eine normale weiße LED benütze, sehe ich da jetzt nicht so eine große Gefahr durch Streulicht.
in dem Fall gebe ich dir recht, Warnhinweis ist in dem Fall etwas übertrieben. ;D
Aber der Wirkungsgrad ist eben auch nicht der beste, wenn du die LED auf 0,74 Ampere hochdrehen mußt und dabei noch teilweise 30 Sekunden belichten. Mit einer Royal Blue-LED, die hauptsächlich Wellenlängen von etwa 460nm emittiert, wäre es schon günstiger. Denn schließlich nutzt du letztendlich nur den Blauanteil aus deiner weißen LED, das Grün und Rot wird je nach Güte des Anregungsfilters mehr oder weniger weggebügelt. Die Durchlasskurve vom Anregungsfilter sollte schon einigermaßen auf die Lichtquelle abgestimmt sein, denn wo nichts ist, kann auch nichts durchkommen.
ZitatDu schreibst ja auch nicht bei deinen hervorragenden Beiträgen, die das Thema verharzte Triebe haben, einen Warnhinweis hinzu.
Bei diesen Arbeiten kann einen das Mikroskop auf die Zehen fallen und einige Knochen brechen. Grinsend
Oh, ist dir das schon etwa passiert? :o Dann werde ich künftig darauf hinweisen müssen. :-\
Viele Grüße
Bernd