Verehrtes Forum,
meine Pflanzenschnitte färbe ich mit Etzold-grün {nach Brügmann}, gemäß der Anleitung des MBK: http://www.mikroskopie-bonn.de/_downloads/Faerbeanleitung_Etzold_gruen_100624.pdf .
Die Schnitte hat es mir immer bei der letzten Alkoholstufe zerrissen, so dass ich erst mit ca. 50%igem Isopropylalkohol mit der Entwässerung begonnen habe und danach mit 100%igem Isopropylalkohol weiter mache. Nur noch wenige Schnitte zerreißt es. Jetzt habe ich ein neues Problem, das ich Euch am Beispiel eines frisch eingedeckten Schnittes zeigen möchte:
Objekt: Stängel-Querschnitt der Dipladenia {Trichterblüte}, Schnittdicke: ca. 30µm, Färbung: Etzold-grün, Eindeckmittel: Euparal
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/136741_35194006.jpg)
Das Foto ist ca. 30 Minuten nach dem Eindecken gemacht worden, daher ist es ein bisschen flau (liegt am Euparal, gibt sich aber nach ein paar Tagen wieder).
Jetzt zerreißt es mir den Schnitt im Euparal.
Hat jemand von Euch dafür eine Erklärung? Gibt es einen ein Fehler im Prozessablauf?
Ich bin sehr an Eurer Meinung interessiert.
Herzliche Grüße
Winfried
Hallo Winfried,
ein ähnliches Problem brachte mich beinahe einmal zur Verzweiflung. ;) Die Schnitte kringelten sich und zerrissen, sobald sie mit Euparal in Berührung kamen. Eine aufsteigende Alkoholreihe half nichts, ich war ratlos, bis ich entdeckte, dass es am Euparal lag. Ich vermute, dass es schlicht zu alt war, nämlich schon 9 Jahre. Frisches Euparal hat diese Wirkung nicht. Warum das so ist, wissen nur die Chemiker. Vielleicht ist dein Euparal ja auch zu alt.
Zwischenzeitlich habe ich dann andere Mittel benutzt.
Grüße
Jürgen
Hallo Winfried,
ich hab da ein ähnliches Problem mit Euparal.
Obwohl mit 100% total entwässert, bilden sich Bläschen im gesamten Euparal, die auch durch erwärmen nicht wegzukriegen sind.
Interessanterweise zeigt reines Euparal diesen Effekt nicht.
Ich bin jetzt dazu übergegangen, über Xylol entweder in Malinol oder Eukitt einzubetten. Hier tritt der Effekt nicht mehr auf.
Viele Grüße
Wolfgang
Lieber Winfried,
Gott sei Dank kenne ich keines der von Dir geschilderten Probleme mit der Euparaleindeckung über Isopropanol. Daher auch danke an Jürgen für den Hinweis, dass das Harz offenbar altert.
Mit der Zeit verdunstet aber auch das Isopropanol aus dem Gemisch und dass schon bei wenigen Monaten im Schliffglas. Das ergänze ich dann wieder, um die ursprüngliche Konsistenz zu erhalten. Eventuell ist auch das ein Ursache für die Risse: enthält das Harz zu wenig Isopropanol, könnte es sein, dass es beim Konzentrationsausgleich unter dem Deckglas zu Rissen im Schnitt kommt.
Nach meiner persönlichen Erfahrung ist der Übergang aus Wasser in reines Isopropanol unkritisch. Da hatte ich bei vielen hundert Präparaten noch nie ein Problem. Nur wenn ich ein wenig differenzieren muss, lasse ich beim ersten "Guss" noch etwas Wasser auf den Schnitten.
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo zusammen,
auch ich habe hin und wieder das Problem, es gibt Material das starke Spannung bekommt beim Entwässern und reist oder sich verzieht:-(
Da ich das Problem besonders bei der Mistel habe hatte ich einen Versuch mit wasserlöslichem Einschlussmittel von B. Heim gemacht dies schrumpft aber so stark
das sich das Deckglas zu einer Beule über dem Schnitt verzieht. Bin dann bei Glyzeringelatine gelandet.
Euparal verdünne ich wenn es zu dickflüssig wird mit der von Waldeck erhältlichen Euparal-Essenz, die riecht wie Euparal, ich habe Schnitte auch schon mal
nach der "Schockentwässerung" darin für 5 Minuten eingelegt was aber am verziehen nicht geholfen hat.
Ich werde weiter nach einem brauchbaren wasserlöslichem Eindeckmittel suchen das sich an sonst wie Euparal verhält.
Viele Grüsse
Joachim
Hallo,
bei meinen Pilzpräparaten mit Euparal hatte ich (Gottseidank) nie derartige Probleme.
Als wasserlösliche Eindeckmittel kann ich Hydromatrix (ich weiß, was das kostet...) und auch Glyceringelatine empfehlen.
Freundliche Grüße
Peter R.
Hallo erstmal,
wenns denn wasserlöslich sein muss nehme ich Magnacol (Polyvenylchlorid-Basierend).
Bei Sporen hats immer hingehauen.
Grüße
Wolfgang
Hallo Jürgen,
mein Euparal habe ich vor ca. zwei Jahren gekauft, an dem Alter kann es da wohl nicht liegen.
Hallo Wolfgang,
bei mir bilden sich kurz nach dem Eindecken mikroskopisch kleine Bläschen, die das Präparat mit einem Schleier einhüllen. Nach ca. 1-2 Wochen verschwinden sie dann meistens vollständig. Ich habe die Präparate auch schon direkt nach dem Eindecken für ca. 1 Stunde im Exsikkator unter Vakuum gesetzt, aber die mikroskopischen Bläschen sind trotzdem entstanden.
Hallo Jörg,
mein Isopropanol kaufe ich immer im 2,5l Gebinde (99,9%ig), und das ist ein Kunststoffbehälter, dann fülle ich es für den Gebrauch in eine 25ml Pipettenflasche. Ich vermute hier keinen nennenswerten Konzentrationsverlust durch Verdunstung.
Hallo Joachim,
bitte berichte mir (uns) wenn Du ein brauchbares Mittel gefunden hast.
Hallo Peter,
danke für den Hinweis auf das Hydro-Matrix, das scheint ja für Schulen geeignet zu sein.
Danke an Euch alle,
mein Résumé aus Euren Hinweisen ergibt sich wie folgt:
- zwei von Euch haben ähnliche Probleme wie ich,
- einer hat hin und wieder Probleme,
- zwei von Euch haben diese Probleme bisher nicht gehabt,
hieraus folgere ich, dass mein Prozess noch nicht ausgereift bzw. noch fehlerhaft ist.
Ferner gehe ich davon aus, dass zumindest Jörg, bei seinen unzähligen Schnibbeleien, über eine hinreichende Erfahrung verfügt, um beurteilen zu können ob Euparal die beschriebenen Probleme bereitet.
Die einzige unbekannte Größe, die ich momentan ausmachen kann ist das wirkliche Alter meines Euparals. Auf der 100g Flasche der Firma ROTH ist nur die Nr. der Charge angegeben, ein Datum fehlt.
Herzliche Grüße
Winfried
Lieber Winfried,
ich glaube, wir haben da ein kleines Missverständnis: das Intermedium und Lösungsmittel für Euparal ist Isopropanol. Wenn Euparal in nicht 100%tig dicht schließenden Gefäßen aufbewahrt wird, verdunstet das Isopropanol. Langsam, aber sicher. ;-)
Da fülle ich halt immer etwas nach und rühre vorsichtig um. Da ich das Problem selbst nicht kenne, habe ich vermutet, dass vielleicht ein zu "zähes" Euparal, also eines mit zu wenig Isopropanol, zu den von Dir beobachteten Rissen in den Schnitten führen könnte.
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo Jörg,
was sage ich da zu mir, wer lesen kann ist klar im Vorteil. Danke für die Aufklärung, ist mir einfach durch die Lappen gegangen.
Meine Argumentation sollte aber sonst schon schlüssig sein?
Herzliche Grüße
Winfried
Hallo Jörg,
bei mir tritt außer bei der Mistel das Problem auf wenn sich der Schnitt beim Entwässern verzieht durch verschiedene Schrumpfung
der unterschiedlichen Zellarten und dann der Druck des Deckglases beim Beschweren den Schnitt platt drückt.
Irgendwann reist dann der Zellverband. Passiert selten, dann weiche ich auf die Glyzeringelatine aus wobei
mir da in der Vergangenheit die Färbungen verblichen sind.
Hallo Winfried, "Includal PVP" war nicht die Lösung :-(
Herzliche Grüsse
Joachim
Lieber Joachim,
ich gestehe: das Problem kenne ich nicht. ???
Mistel habe ich auch hier, die Präparate sind 3 Jahre alt und völlig in Ordnung. Eines haben wir noch nicht bedacht: ich schneide mit 50 µm relativ dick. Da ist das Material auch stabiler. Ob das den Ausschlag gibt?
Lieber Winfried,
ganz sicher bin ich mir nicht, aber ich würde beim Euparal anfangen. Aus meiner Sicht ist das Entwässern unkritisch - siehe oben.
Euch beiden herzliche Grüße
Jörg
Hallo Winfried,
Deine Beobachtung
Hallo Wolfgang,
bei mir bilden sich kurz nach dem Eindecken mikroskopisch kleine Bläschen, die das Präparat mit einem Schleier einhüllen. Nach ca. 1-2 Wochen verschwinden sie dann meistens vollständig. Ich habe die Präparate auch schon direkt nach dem Eindecken für ca. 1 Stunde im Exsikkator unter Vakuum gesetzt, aber die mikroskopischen Bläschen sind trotzdem entstanden.
spricht meiner Meinung nach dafür, daß der Schnitt noch nicht vollständig entwässert gewesen sein könnte, mit zuviel Wasser trübt sich Euparal.
Mit der Zeit verdunstet das Wasser und die Tübung verschwindet.
Viele Grüße
Rainer
Hallo Joerg
Wenn ich richtig informiert bin schneidest Du deutich dicker, ich gehe nach der Faerbung bei "duennen" Schnitten zuerst kurz in 30%igen Alkohol um die Risse zu verhindern ...
Dabei wird sofort wieder abgesaugt sobald der 30%ige eingefuellt ist, sonst zieht zu viel Farbe aus! Dann geht es ab in den ISO (unverduennt) ...
Bei den 50er Schnitten brauche ich den Zwischenschritt nicht, wende ihn aber der Differenzierung willen dort jetzt auch an ...
Liebe Gruesse
Gerhard
Lieber Rainer,
oh, das habe ich überlesen. Aber da hast Du recht: das wird Wasser sein.
Man kann die Blasen übrigens unterscheiden. Mir ist das auch ein mal passiert, als ich einen Schnitt mit dem falschen, wasserfeuchten Pinsel übertragen und eingedeckt habe. Da haben sich sofort Wassertröpfchen abgeschieden und es war auch eine kleine Luftblase mit drin: Luft hat einen geringeren Brechungsindex und die Luftblasen haben daher einen markanteren dunklen Rand. Außerdem verschwinden kleine Luftblasen im Euparal schon in den ersten 5 Minuten - man kann also zuschauen - und sie "schweben" frei im Euparal oder dem Zellverband der Probe. Das Wasser lagert auf dem OT oder der Probe und bleibt deutlich länger erhalten.
Mein seinerzeit "klatschnasser" Schnitt war nach gut 6 Monaten wasserfrei - allerdings auch weitestgehend entfärbt.
Lieber Gerhard,
ja, die 50 µm Schnitte sind so robust, die überstehen das Entwässern klaglos.
Demnächst bekomme ich wieder dünnere Längsschnitte von Bodo. Ich werde dann einmal explizit darauf achten, wie die sich beim Entwässern und Eindecken verhalten.
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo in die Runde,
Zitatmein Isopropanol kaufe ich immer im 2,5l Gebinde (99,9%ig), und das ist ein Kunststoffbehälter, dann fülle ich es für den Gebrauch in eine 25ml Pipettenflasche. Ich vermute hier keinen nennenswerten Konzentrationsverlust durch Verdunstung.
Verdunstung ist nicht das Problem. Isopropanol ist hygroskopisch. Du verdünnst Dein Isopropanol und schleppst dadurch Wasser in die Probe. Ich würde einen Test machen:
Etwas Isopropanol mit Kupfersulfat oder Zeolith entwässern. Einen Tropfen davon auf einen Objektträger geben und Euparal drauf geben. Die selbe Prozedur mit einem Tropfen Wasser wiederholen. Deckgläser drauf und unter das Mikroskop legen.
Herzliche Grüsse
Eckhard
Zitat von: RainerTeubner in Oktober 31, 2013, 23:38:26 NACHMITTAGS
Hallo Winfried,
Deine Beobachtung
Hallo Wolfgang,
bei mir bilden sich kurz nach dem Eindecken mikroskopisch kleine Bläschen, die das Präparat mit einem Schleier einhüllen. Nach ca. 1-2 Wochen verschwinden sie dann meistens vollständig. Ich habe die Präparate auch schon direkt nach dem Eindecken für ca. 1 Stunde im Exsikkator unter Vakuum gesetzt, aber die mikroskopischen Bläschen sind trotzdem entstanden.
spricht meiner Meinung nach dafür, daß der Schnitt noch nicht vollständig entwässert gewesen sein könnte, mit zuviel Wasser trübt sich Euparal.
Mit der Zeit verdunstet das Wasser und die Tübung verschwindet.
Viele Grüße
Rainer
...aber dieses Zitat war die Antwort auf Wolfgangs Hinweis auf Magnacol als wasserlösliches Einschlussmittel! Das hat also mit dem einreißen nichts zu tun. Die Erfahrung mit den (sehr vielen!) Bläschen habe ich beim Einschluß von Kleininsekten in Magnacol auch gerade gemacht. Hier wird man wohl vakuumieren müssen.
Viele Mikrogrüße
Bernhard
Tante Edit: oh sorry, Winfried hatte ja vakuunmiert. Dann muss es am Magnacol liegen. Um aber vom Hauptanliegen des Threads nicht abzukommen, müssen wir das hier nicht weiter diskutieren. Ich mache weitere Versuche.
Hallo Winfried,
zuerst, Deine Färbung ist sehr gut ausgefallen. Die Farben sind schön differenziert aufgezogen.
Für mich stellt sich jetzt aber bei dem von Dir geschilderten Problem die Frage, wie die Vorbehandlung war.
Wenn Du frisches Material geschnitten hast, war die Fixierung ausreichend lang, wurde die Fixierlösung auch mehrmals gewechselt? Wenn Du nur mit 70% Ethanol fixiert hast, würde ich es mit AFE (90 Teile 70% Ethanol + 5 Teile 37% Formalin + 5 Teile 100% Essigsäure) versuchen. Wenn Du kein AFE nehmen möchtest, belass die Schnitte über Stunden in 70%igem Ethanol und wechsele es mindestens 3x.
Die Trübung in Deinem Schnitt kommt mir etwas ungewöhnlich vor, was auf nicht vollständig mit Alkohol und/oder Wasser vorhandene Inhaltsstoffe verweist oder der Schnitt war noch nicht vollständig entwässert.
Euparal ist nämlich wasserverträglich. Ich selbst habe es noch nicht versucht, aber eine Einbettung sollte auch mit wasserverdünntem Alkohol (70%- bis 80%igem Ethanol) gelingen.
Bei einer Stückfixierung (ca. 5 mm lange Stücke 24 Stunden fixieren und dann schneiden) dürfte das Material genügend gehärtet sein und die Schnitte nicht mehr einreißen. Sollte es immer noch der Fall sein, dann könntest Du zwischen Entwässerung mit 100% Isopropylalkohol und Einschluss in Euparal noch eine Zwischenstufe mit einer Lösung aus 2/3 Isopropylalkohol und 1/3 Euparal einschieben.
Das von Dir gezeigte Einreißen der Schnitte passiert mir auch schon, aber nur bei schnittfixierten Proben.
Noch zu ungewöhnlichen und unerklärlichen Lufteinschlüssen: Wenn ich im Sommer abends auf dem Balkon Dauerpräparate mache, sind sie in der Regel verdorben, weil voller Lufteinschlüsse (Nein, es regnet nicht. Schönster Sonnenuntergang bei wolkenfreiem Himmel). Mit gleichem Prozess, gleichen Reagenzien und am selben Abend gelingen sie in der Wohnung einwandfrei.
Viele Grüße
Rolf-Dieter
Lieber Rolf-Dieter,
ich würde vermuten, dass draussen auf dem Balkon z.B. durch den immer vorhandenen leichten Luftzug das isopropanol schneller verdunstet und Du so weniger Zeit zum Auftropfen des Euparals hast. Hier könnte Deine eigene Medizin helfen: eine Zwischenstufe aus Isopropanol und Euparal. Damit dürfte das Übertragen auf den OT und das anschließende Auftropfen des Euparals unkritisch werden.
Das von Dir geschilderte Phänomen kenne ich auch von "Drinnen": ich hatte es auch, als ich mir einmal zu viel Zeit gelassen hatte. :-[
Herzliche Grüße
Jörg
Lieber Freunde,
hier kurz nachgelegt: Bilder von dem von mir feucht eingedeckten Präparat und einem Vergleichspräparat aus der selben Serie. Es handelt sich um einen Lavendel-Spross in Wacker-Färbung, die Schnitte stammten seinerzeit von Rolf-Dieter und haben eine Dicke von 30 µm. Die Präparation habe ich im September 2009 gemacht und das Eindeckmittel ist Euparal.
Bild 1: So sah ein "gutes" Präparat 2009 aus:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/136855_4078141.jpg) (http://www.fotos-hochladen.net)
Bild 2: Hier das feucht eingedeckte Präparat einige Tage nach dem Eindecken, Anfang Oktober 2009:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/136855_16673504.jpg) (http://www.fotos-hochladen.net)
Die Wassertropfen sind gut zu erkennen, sie liegen auf dem OT auf. Ob die deutlich andere Farbwirkung etwas mit dem Wassergehalt zu tun hat, oder auf einer anderen Belichtung beruht, kann ich heute leider nicht mehr nach vollziehen.
Bild 3: So sieht das feucht eingedeckte Präparat heute aus (sorry, schnelles Bild ...):
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/136855_12939895.jpg) (http://www.fotos-hochladen.net)
Das Wasser ist weg und ein Großteil des Acridinrots auch.
Bild 4: Und hier ebenso auf die Schnelle das Vergleichspräparat nach 4 Jahren:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/136855_9014072.jpg) (http://www.fotos-hochladen.net)
Herzliche Grüße
Jörg
Lieber Jörg,
schöne Dokumentation!
Kleine Anmerkung zur Farbveränderung der wasser-feucht eingedeckten Probe: das ist sicher der Effekt, dass die Rotkomponente (Acridinrot) von wässrigen Alkoholen leicht ausgezogen wird.
Lieber Klaus,
Du hast natürlich Recht, eine Dauerdifferenzierung unter dem Deckglas.
:)
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo in die Runde,
ich denke, dass ich den ersten Ansatzpunkt gefunden habe, nachdem Jörg uns seine Bilder vom Lavendel gezeigt hat. Bild Nr. 2 (feucht eingedecktes Präparat) zeigt in etwa die Bläschenbildung wie sie bei meinen Präparaten auch zu sehen ist. Die Bläschen- oder Tropfenbildung verschwindet zwar bei mir wieder, zeigt mir jetzt aber, dass die Probe wohl nicht richtig entwässert wurde. Hier werde ich zuerst den Prozess verbessern und Euch von den Ergebnissen berichten. Danke für die vielen Hinweise.
Herzliche Grüße
Winfried
Verehrtes Forum,
ich habe den Prozess des Färbens und Einbettens penibel genau, gemäß der Anleitung des MBK ausgeführt { http://www.mikroskopie-bonn.de/_downloads/Faerbeanleitung_Etzold_gruen_100624.pdf }.
Da ich ein "Beute-Lipper" bin, also ein Zugereister, und die sind noch sparsamer als die echten Lipper, habe ich für die Entwässerung der Schnitte, die Färbung mit Etzold-grün und die anschließenden Alkoholphasen meine Tüpfelplatte benutzt. Die Ergebnisse besserten sich zwar ein wenig, waren aber für mich nicht überzeugend genug, erst als die Dosis erhöhte, wurden die Ergebnisse besser. Es kam jetzt mehr Alkohol zum Einsatz.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/137975_4357697.jpg)
Schnittdicke ca. 15-20µm mit dem Handzylindermikrotom
Die beschriebene Bläschenbildung direkt nach dem Einbetten, war nach den Alkoholschritten mit mehr Alkohol nach dem Färben vorbei. Ich würde jetzt nach vielen Versuchen behaupten: "Wer beim Einbetten mit Euparal eine Bläschenbildung hat, der hat zu wenig Alkohol benutzt."
Danke für Eure vielen Anregungen und Hinweise.
Herzliche Grüße
Winfried
Lieber Winfried,
ja, das schaut doch schon mal ganz gut aus und wenn das Euparal erst mal wirklich trocken ist (das kann gut 6 Monate dauern ... ;)), dann wird der Schnitt auch noch klarer.
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo Winfried,
wie Jörg schon angemerkt hat, es sieht besser aus.
Trotzdem, auch nach dem Einbetten sollte der Schnitt klarer wirken. Versuch es doch einmal nach dieser Anleitung: http://www.mikroskopie-bonn.de/_downloads/Arbeitsplan_Etzold_FCA.pdf .
Wenn Du mehr über die Färbung wissen möchtest, kann ich nur auf die Mikrofibel verweisen. Klaus Henkel hat darin die Etzold-Färbung aufgrund einer persönlichen Korrespondenz mit Prof. Etzold beschrieben. Den Verweis findest Du im Arbeitsplan.
Wenn die Färbung nicht deutlich besser wird, dann misstraue Deinem Isopropylalkohol und besorg Dir eine neue Charge. Der muss wirklich 100%ig sein.
Ein Tipp zur Beschaffung. Isopropylalkohol bekommt man üblicherweise in einer Apotheke. Es könnte sein, das ggf. nur 70%iger vorrätig ist, deshalb ausdrücklich 100% Isopropylakohol verlangen.
Viele Grüße
Rolf-Dieter
Ein Gruß in die Runde der Schippelexperten,
Ich habe das Problem der zerrisenen Schnitte.
Hier ein Foto mit einem Datum meines Euparal.
das symbolische Gläschen kann ich nicht interpretieren.
Ich vermute, daß es das Haltb.-Datum ist.
das Abfülldatum kann es m.E. nicht sein, denn dieses EU habe ich schon wesentlich länger
Gruß Peter
Addwndum: ich bitte um eine Adresse, wo ich Eup. erwerben kann
Gruß Peter
Hallo Peter,
ich habe noch kein unbrauchbares Euparal gehabt. Ist es etwas zu zäh, dann mit wenig Isopropanol mischen.
Euparal bekommst du z. B. hier: https://www.bioform.de/shop.php?action=tree&wg=1&pid=707&treeid=141
Gruß
Peter
Hallo Peter,
das Symbol der Sanduhr, die unten gefüllt ist, spricht sehr dafür, dass es sich um das Ablaufdatum handelt.
Ich bin kein Schnippler, aber das Euparal dürfte wohl kaum die Ursache eines zerrissenen Schnittes zu sein.
Herzliche Grüße
Peter