Liebe Freunde der Mikroskopie,
ich habe eine technische Frage, die sich auf die Nutzung der Leitz ICT-Objektive im Hellfeld bezieht. Vielleicht können mir ja insbesondere die Leitz-Experten mit ihren Erfahrungen weiterhelfen.
Seit einiger Zeit habe ich die Gelegenheit, ein Leitz Dialux mit Differentialinterferenzkontrast zu nutzen. Hierfür verwende ich den Universalkondensor UK von Leitz mit entsprechenden Wollastonprismen. Die objektivseitigen Wollastonprismen sind fest in den Objektiven verbaut. Wenn ich die ICT-Objektive im Hellfeld nutzen möchte, stelle ich den Kondensorrevolver auf die Position "Hellfeld", schwenke den beleuchtungsseitigen Polarisator aus und ziehe tubusseitig den Analysator aus dem Strahlengang. Dann habe ich ein gutes Hellfeldbild.
In einer Anleitung der Firma Leitz zu ihrem Interferenzkontrastsystem lese ich jedoch, dass die Hellfeld-Objektive einerseits und die DIK- (ICT-)Objektive andererseits in verschiedenen Revolvern sitzen sollen. Es wird geraten, beim Wechsel von Hellfeld zu DIK den gesamten Objektivrevolver zu tauschen. Kann ich daraus schließen, dass eine Nutzung der ICT-Objektive im Hellfeld eventuell schädlich für die im Objektiv verbauten Wollastonprismen ist und täte ich für eine lange Lebenszeit der ICT-Objektive gut daran, sie nur im DIK zu nutzen?
Besten Dank im voraus und freundliche Grüße
Ole Riemann
Hallo Ole,
keine Sorge, den Prismen ist es egal ob Licht durchscheint oder nicht. Ich habe Jahrelang an einem Zeiss-Axioskop den Revolver mit den DIC-Prismen dauernd benutzt (entspricht der Anordnung bei dir - die ICT-Prismen sind mit dem Objektiv verschraubt, also nicht so schnell aus den Strahlengang zu entfernen; bei Zeiss wäre das einfacher, weil es kleine Schieber sind. Die DIC-Prismen stören nur, wenn man Pol machen möchte. Der Wechselrevolver ist was für Großgrundbesitzer (einen für DIC, einen für Hellfeld, einen für Phasenkontrast, einen für Pol einen für Auflicht und Luxus pur einen für Auflicht Dunkelfeld. ;D)
Claro empfiehlt der Mikroskop-Hersteller solche Lösungen, aber es geht auch so! ;)
Auf jeden Fall : deine DIC Prismen werden nicht geschädigt. Schädlich ist eher feuchtes Mikroklima in der Schublade!
Um Deinen Leitz Durchlicht DIC werden dich jetzt garantiert 100 Foristen beneiden! Ein seltenes Teil!
Lieber Klaus,
Du hast bei Deiner Auflistung (einen für DIC, einen für Hellfeld, einen für Phasenkontrast, einen für Pol einen für Auflicht und Luxus pur einen für Auflicht Dunkelfeld) noch den Auflicht-DIC vergessen ;D !
Für Phasenkontrast und DIC-Durchlicht reicht ein Revolver, 2 Positionen Ph und 3 Positionen DIC. Die Ph-Objektive gehen auch für Pol, also zwei Revolver gespart :D :D :D
Herzliche Grüße
Harald
Hallo Klaus,
dann bin ich ja beruhigt - in der Tat, es macht viel Spaß, mit dem Gerät zu arbeiten. Zumal wirklich alles bestens erhalten ist.
Viele Grüße
Ole
Hallo,
auch auf die Gefahr hin falsch zu liegen, aber ich glaube dass sich Leitz dabei was gedacht hat. Leider besitze ich kein solches Objektiv um das testen zu können, deshalb hier nur mein theoretischer Senf dazu.
Das Wollaston-Prisma ist ja bekanntlich fest verbaut. Bei meinem ICR Objektiv lässt es sich aber abschrauben. Was übrig bleibt ist ein normales Unendlich-Objektiv. Vermutlich ist es bei den ICT-Objektiven ähnlich gelöst. Das Abschrauben könnte aber die Justierung verändern, kann also deshalb nicht uneingeschränkt empfohlen werden. Nun nehmen wir mal an das Prisma bleibt dran/drinn. Was passiert dann?
Der abbildende Strahlengang wird durch das Prisma in zwei Teilstrahlen geteilt. Die ursprüngliche Funktion ist zwei Teilstrahlen zusammenzuführen, wenn es aber keine zwei Teilstrahlen gibt werden durch das Prisma welche erzeugt, analog zur Beleuchtung beim ICT. Ohne weitere Maßnahmen sollte dann ein Doppelbild entstehen. Die beiden Bilder liegen sehr nahe zusammen, so dass das u.U. auf den ersten Blick gar nicht auffällt, tatsächlich wird aber das Bild verschlechtert.
Zu prüfen wäre das z.B. über kontrastreiche Strukturen. Diese müssten in einer Richtung etwas verbreitert und leicht unscharf erscheinen. Besser werden sollte es wenn zur Beleuchtung polarisiertes Licht verwendet wird. Die Polarisationsrichtung muss aber korrekt zum Prisma ausgerichtet werden. Durch drehen des Polarisators lässt sich zwischen den beiden Teilbildern "umschalten". Das ist dann natürlich kein astreines Hellfeld mehr und man könnte Probleme mit Proben bekommen welche die Polarisation verändern. Aus diesem Grunde würde man vielleicht zwei separate Revolver empfehlen.
Alles Mutmaßung - sollte ich falsch liegen, wäre ich um eine Erklärung wo mein Denkfehler liegt dankbar.
Viele Grüße,
Raphael
Zitat von: Läpplappen in Mai 06, 2014, 10:29:38 VORMITTAG
Ohne weitere Maßnahmen sollte dann ein Doppelbild entstehen. Die beiden Bilder liegen sehr nahe zusammen, so dass das u.U. auf den ersten Blick gar nicht auffällt, tatsächlich wird aber das Bild verschlechtert. [...]
Alles Mutmaßung - sollte ich falsch liegen, wäre ich um eine Erklärung wo mein Denkfehler liegt dankbar.
Hallo Raphael,
Sie liegen ganz richtig. Aus dem Grund empfehlen die Hersteller, die Prismen fuer kritische Hellfeldbeobachtungen aus dem Strahlengang zu nehmen. In den meisten Faellen ist das einfach; der Schieber wird aus dem Stahlengang gezogen. Weil das ICT Prisma fest verbaut ist, muss hier der ganze Revolver gewechselt werden.
Solange man aber mit dem Hellfeld zufrieden ist (so wie Ole), empfiehlt es sich einfach alles so zu lassen. Jeder Revolverwechsel riskiert einen Totalschaden, wenn man ihn fallen laesst.
Hallo Ole,
Die ICT Prismen bestehen aus kristallinem Quarz. Sie sollten die langlebigste Komponente an diesem Mikroskop sein (wenn in ferner Zukunft Plastik, Metall und Glas an dem Mikroskop nicht mehr existieren sollte es den Quarz immer noch geben :D ). Die Verkittung zwischen den Prismen und die anderen Linsen im Mikroskop ist etwas empfindlicher. Man sollte deshalb immer einen Waermeschutzfilter vor (hinter) die Lichtquelle des Mikroskops setzen, besonders wenn man starke Lichtquellen wie eine 100W Lampe benutzt.
Beste Gruesse,
Jon
Hallo Raphael, Hallo Jon,
vielen Dank für Euer Mitdenken. Ein Wärmeschutzfilter liegt vor - dann kann ja wohl nichts mehr geschehen. Dennoch werde ich einmal testhalber schauen, was ein Vergleich von ICT-Objektiven gegen normale Hellfeldobjektive (bei gleicher Apertur) im Hellfeld ergibt.
Viele Grüße
Ole
Hallo Ole,
ZitatDennoch werde ich einmal testhalber schauen, was ein Vergleich von ICT-Objektiven gegen normale Hellfeldobjektive (bei gleicher Apertur) im Hellfeld ergibt.
Da bin ich auf das Ergebnis gespannt. Ich habe wie gesagt lange so gearbeitet, dass die DIC-Schieber drin blieben bei reiner HF-Anwendung.
Muss ich doch wirklich mal am Olympus BX 50 testen.
Hallo zusammen,
jetzt habe ich es schnell mal getestet. Olympus Unendlichoptik immer das 40er im Durchlicht. Einmal Hellfeld und einmal HF plus dem DIC-Schieber.
Keine Nachbearbeitung. Ohne DIC ist es etwas heller und ein Hauch von mehr Kontrast(?). Der Unterschied ist da, aber er ist nicht riesig.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/149680_8355549.jpg) (http://s106.photobucket.com/user/microklaus/media/Mikropraeparate%202012/Micropaeparate_2013/800_IMG_0001_zps282b0b56.jpg.html)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/149680_40719877.jpg) (http://s106.photobucket.com/user/microklaus/media/Mikropraeparate%202012/Micropaeparate_2013/800_IMG_0002_zps3a8920cb.jpg.html)
Zitat von: Läpplappen in Mai 06, 2014, 10:29:38 VORMITTAG
Ohne weitere Maßnahmen sollte dann ein Doppelbild entstehen. Die beiden Bilder liegen sehr nahe zusammen, so dass das u.U. auf den ersten Blick gar nicht auffällt
Lieber Rafael,
die Aufspaltung der beiden Teilstrahlen liegt unter der Auflösungsgrenze des Objektivs, weshalb man bei richtiger Anwendung keine Doppelbilder sieht.
Die Vereinigung der beiden Teilstrahlen passiert erst im Analysator. Das Prisma bringt sie lediglich geometrisch zusammen so daß sie im Analysator interferieren können. Nun ist das vereinigende Prisma ein brechendes Medium. Somit sollten im Hellfeld manche Strahlen zwar in gewissem Maße abglenkt werden. Diese verirren sich aber im "Äther" und schaffen höchstens etwas Streulicht aber sicher keine zweite Abbildung. Eine Aufspaltung in zwei definierte Teilstrahlen funktioniert ohnehin nur mit polarisiertem Licht.
Soweit mein Verständnis. Bitte um Korrekturen, falls ich falsch liege!
Lieber Klaus,
ich habe Deine beiden Bilder mal mit Histogramm versehen.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/149683_30240450.jpg)
Beim Hellfeld knubbeln sich mehr dunkle Pixel, weshalb das Schwarz auch massiver wirkt. Irgendetwas tut sich also. Vielleicht Streulicht? Eine Densitometerfunktion, welche die Schwärzung entlang einer Linie aufnimmt, wäre noch aussagekräftiger.
'nacht
Wolfgang
That's also my experience with DIC on my inverted (Olympus IMT-2).
I have checked it 1. solely objective DIC prism, 2. DIC prism + analyzer, 3. DIC prism + polarizer (condenser). In all cases the image quality decreased, in the same amount.
Best wishes, René.
Hallo Klaus,
hallo Wolfgang.
Zitatdie Aufspaltung der beiden Teilstrahlen liegt unter der Auflösungsgrenze des Objektivs, weshalb man bei richtiger Anwendung keine Doppelbilder sieht.
Die Vereinigung der beiden Teilstrahlen passiert erst im Analysator. Das Prisma bringt sie lediglich geometrisch zusammen so daß sie im Analysator interferieren können
Die Aufspaltung mag zwar unterhalb der Auflösungsgrenze liegen (was ich so zwar schon oft gelesen habe, aber nicht für alleingültig halte). Trotzdem reduziert sich dadurch die Auflösung. Etwas vereinfacht stelle Dir bitte vor Du zeichnest mit einem dicken Stift eine Linie. Anschließend um die halbe Linienbreite versetzt eine Zweite. Dadurch wird der Strich doch dicker. Man sieht zwar nicht, dass es zwei Linien sind (nicht aufgelöst), trotzdem sind sie aber da.
Bei korrekter (DIC) Anwendung bringt das Prisma im Objektiv die beiden Teilstrahlen geometrisch zusammen - das ist richtig. Damit liegen die beiden Teilbilder wieder übereinander. Beide Teilbilder sind aber unterschiedlich polarisiert (linear, 90° zueinander) und können deshalb nicht interferieren. Dafür sorgt dann der Analysator - der vereinigt aber nichts, sondern selektiert nur die Polarisation entsprechend (Ergebnis linear polarisiert und 45° gedreht). Dass der Analysator zwingend für die Interferenz benötigt wird schreibst Du ja auch - da sind wir also beieinander :)
Im Übrigen sind die beiden Teilbilder ja leicht unterschiedlich - man hat also beim DIC ohnehin zwei Bilder. Letzteres aber nur bei der Verwendung eines Wollaston-Prismas im Beleuchtungsstrahlengang.
ZitatNun ist das vereinigende Prisma ein brechendes Medium. Somit sollten im Hellfeld manche Strahlen zwar in gewissem Maße abgelenkt werden. Diese verirren sich aber im "Äther" und schaffen höchstens etwas Streulicht aber sicher keine zweite Abbildung. Eine Aufspaltung in zwei definierte Teilstrahlen funktioniert ohnehin nur mit polarisiertem Licht.
Da bin ich noch nicht ganz bei Dir. Das Prisma bricht das Licht - soweit unstrittig ;) Auch dass "manche" Strahlen im Hellfeld abgelenkt werden stimmt natürlich. Die Frage ist nun welche das sind und was mit denen passiert. Sie "verschwinden" nämlich nicht einfach so. Das Wollaston-Prisma teilt ein Strahlenbündel (nennen wir es "Bild", auch wenn es streng genommen an dieser Stelle noch kein Bild ist) in Mehrere auf. Das geschieht durch unterschiedliche "Behandlung" der Polarisationsrichtungen. Jedes Teilbild für sich betrachtet ist linear polarisiert, aber die Polarisationsrichtung ist um 90° gedreht. Diese definierte Aufspaltung funktioniert unabhängig von der Art des zur Beleuchtung eingesetzten Lichtes. Beide Strahlenbündel haben eine Brennebene und können so zum Bild werden. Die Bündel nehmen nur leicht unterschiedliche Wege, verursachen aber weder Streulicht noch verschwindet eines davon. Bei der Beleuchtung mit "natürlichem" Licht, also zufällig orientierter Polarisation, sind die beiden entstehenden Bilder gleich hell und es geht nichts verloren was der Versuch mit den Testbildern ja auch zeigt. Der leichte Lichtverlust ist imho einfach durch die zusätzlichen Flächen und die Kittschicht bedingt. Auch bei der Verwendung von zirkular polarisiertem Licht oder linear polarisiertem Licht mit einer Orientierung 45° zum Prisma bekommt man das selbe Ergebnis. Lediglich wenn man eine Polarisationsrichtung (vor oder nach dem Prisma ist erstmal egal) durch einen Polfilter weit genug abschwächt hat man es wieder mit EINEM Bild in der Bildebene zu tun das nichts an Kontrast und Schärfe verloren hat.
Die Bilder von Klaus sind vermutlich nicht "groß" genug. Das mache ich daran fest, dass ich noch keine Beugungsunschärfe an den Kanten sehe und deshalb die Verbreiterung der Linien durch das Doppelbild noch nicht sichtbar ist.
Klaus, kannst Du bitte nochmal folgendes versuchen:
1) "Übervergrößern" - also die Auflösung der Kamera über der Auflösung vom Mikroskop
2) Vier Bilder mit DIC-Objektiv, aber ohne DIC-Kondensor.
A) Ohne Polarisator
B) Mit Polarisator-Stellung parallel zum Prisma
C) Mit Polarisator-Stellung 90° zum Prisma
D) Mit Polarisator-Stellung 45° zum Prisma
Ich erwarte folgendes:
A und D sollten sich nur in ihrer Helligkeit unterscheiden
B und C sollten scharf sein, aber leicht zueinander versetzt. Sonst aber identich.
Viele Grüße,
Raphael
Zitat von: Läpplappen in Mai 07, 2014, 11:00:43 VORMITTAG
Zitatdie Aufspaltung der beiden Teilstrahlen liegt unter der Auflösungsgrenze des Objektivs, weshalb man bei richtiger Anwendung keine Doppelbilder sieht.
Die Vereinigung der beiden Teilstrahlen passiert erst im Analysator. Das Prisma bringt sie lediglich geometrisch zusammen so daß sie im Analysator interferieren können
Die Aufspaltung mag zwar unterhalb der Auflösungsgrenze liegen (was ich so zwar schon oft gelesen habe, aber nicht für alleingültig halte).
Hallo Raphael,
Von PZO gibt es ein Interferenzkontrastset mit stufenlos einstellbarer Bildaufspaltung (differential interference contrast microscopy with continuously variable wavefront shear; Pluta (1988) Adv. Light Microsc. Vol. 2). Dabei kann man sehen, dass die Bildaufspaltung (in der Objektebene) tatsaechlich kleiner als die Aufloesung des Objektivs sein muss, um DIK zu erhalten und Doppelbilder zu vermeiden. Nur als Beispiel, bei Zeiss INKO (alt) betraegt die Aufspaltung fuer das Objektiv Plan 100/1,25 220 nm.
Bei der Stahlenvereinigung war mein Verstaendnis bisher ein anderes. Die Strahlenvereinigung findet entweder
im objektivseitigen Prisma statt (Wollaston-Prisma), oder
davor (Nomarski-Prisma; der Regelfall) oder auch
dahinter (Nomarski; Objektive mit niedriger Vergroesserung = hoch liegender Austrittspupille). Der Analysator hat daran keinen Anteil.
Soweit ich weiss ist deshalb auch die Lages des Analysators in erster Naeherung unerheblich. Er kann an allen Stellen hinter dem Prisma liegen, sogar vor dem Okular, auch wenn das aus anderen Gruenden unguenstig ist.
Mit Bitte um Aufklaerung,
Jon
Zitat von: JB in Mai 07, 2014, 13:21:18 NACHMITTAGS
Mit Bitte um Aufklaerung,
Jon
Guten Tag Jon!
Die übersichtlichste Darstellung bietet derzeit Gerhard Göke in: Moderne Methoden der Lichtmikroskopie. Kosmos, Stuttgart 1988. Kapitel 8.3 Interferenzmikroskopische Methoden. und 8.4 Interferenzanordnungen. Dort sind die Methoden nach Pluta, nach Jamin und Lebedeff, nach Francon, Smith, Nomarski, Beyer und Schöppe abgebildet und beschrieben.
Gruß
KH
Hallo Jon,
ZitatBei der Stahlenvereinigung war mein Verstaendnis bisher ein anderes. Die Strahlenvereinigung findet entweder im objektivseitigen Prisma statt (Wollaston-Prisma), oder davor (Nomarski-Prisma; der Regelfall) oder auch dahinter (Nomarski; Objektive mit niedriger Vergroesserung = hoch liegender Austrittspupille). Der Analysator hat daran keinen Anteil.
Vollkommen richtig! Das Prisma, welcher Bauart auch immer, sorgt für die geometrische Vereinigung - der Polfilter dafür, dass die beiden Strahlbündel gleich polarisiert sind. Genau das habe ich ja oben geschrieben.
ABER in der Anordnung nach Ole ist das ja etwas anders gelagert.
Das klärt sich bestimmt und ich bin sehr auf Versuche gespannt die ich selbst leider nicht durchführen kann. Aber um mißverständnissen vorzubeugen. Solange die abbildung OK ist spielt es ja auch nur eine untergeordnete Rolle. Ich wollte ursprünglich nur beschreiben weshalb das vom Hersteller so nicht empfohlen wird.
Viele Grüße,
Raphael
Liebe Kollegen,
die Vereinigung der beiden Strahlen findet im Analysator statt.
Was sehen wir im DIK? Ein reliefartiges Bild. Dieser Eindruck kommt zustande indem an der einen Seite des Objektes ein heller Streifen auf der anderen ein dunkler Streifen erscheint.
Wie kommen diese Streifen zustande? Durch Interferenz. Auf der einen Seite geht z.B. der linke Strahl durchs Medium auf der anderen Seite der rechte. Es wird also einmal der linke, einmal der rechte Strahl - oder besser Wellenzug - abgebremst. Das führt in der Interferenz im besten Fall zu einer Amplitudenverstärkung auf der anderen zu einer Abschwächung (hell, dunkel)
Interferieren können aber nur Wellenzüge, die gleich polarisiert sind. Und das sind sie im Prisma noch nicht. Erst im Analysator werden die beide Wellenzüge vektormäßig zerlegt, wodurch die gleich orientierten Anteile interferieren können.
Raphael,
natürlich verschwindet Licht nicht einfach so im Äther. Es wird an der Tubuswand absorbiert oder vagabundiert als Streulicht darin herum.
Zitat von: Läpplappen in Mai 07, 2014, 11:00:43 VORMITTAG
Diese definierte Aufspaltung funktioniert unabhängig von der Art des zur Beleuchtung eingesetzten Lichtes.
Das stimmt so pauschal nicht. Nur wenn das beleuchtende Licht polarisiert ist und die Schwingenungsrichtung 45° zu den Schwingungsrichtungen des Prismas orientiert ist, gibt es eine definierte Aufspaltung in zwei Teilstrahlen. Und auch nur dann, wenn der beleuchtende Wellenzug parallel zur optischen Achse verläuft.
All das bietet die Hellfeldbeleuchtung nicht. Deshalb mag es wohl irgendeine Ablenkung geben, und wenn die Probe anisotrop ist, sogar eine gewisse (undefinierte) Aufspaltung, aber nie zwei Bilder.
Verbesserungen erwünscht!
Wolfgang
Hallo,
noch mal kurz zurück zur ursprünglich gestellten Frage.
Werksseitig wuden die vom Kunden ausgewählten ICT-Objektive für die Interferenzkontrast-Eirichtung T zusammen mit dem zugehörigen Kondensor als "Set" ausgeliefert, wobei die Objektive vorzentriert und im zugehörigen Wechslrevolver so fest verschraubt waren, dass sie nicht ohne größeren Aufwand abgeschraubt werden konnten.
Gängig waren Kombinationen von 16, 40, 100x oder 25,40, 100x, auf Kundenwunsch auch 16, 25, 40, 100x.
Folglich waren am zugehörigen Fünffach-Objektivrevover noch ein oder zwei Stellen frei, die man mit Phasenkontrast- oder Hellfeldobjektiven bestücken konnte.
Die werksseitige Empfehlung, die ICT-Objektive am Revolver zu belassen und eine Serie von Hellfeld-Objektiven an einem anderen Revolöver zu verwenden, ist m.W. nur dadurch begründet, dass man dem Kunden im Falle eines Demontierens eine ggf. aufwendige Neuzentrierung der ICT-Objektive ersparen wollte. Wer also neben den ICT Objektiven weitere Objektive benutzen wollte, z.B. für Hellfeld oder spannungsfreie für Polarisation, oder mit Irisblende für Dunkelfeld, der sollte möglichst einen separaten Objektivrevolver verwenden, damit die ICT-Objektive ihre Zentrierung behalten.
M.W. hat diese Empfehlung nichts damit zu tun, dass man mit den ICT-Objektiven kein gutes Hellfeldbild erzeugen könnte. Für Hellfeld empfielt Leitz gemäß Anleitung eine Stellung des Analysator-Schiebers in Position des schrägen Doppelpfeils, zusätzlich natürlich am Kondensor die Position "H". Das so erhältliche Hellfeldbild ist einwandfrei und steht den mit Standard-Hellfeldobjektiven erzeugten Bildern m.E. in nichts nach, zumindest unter Aspekten der praktischen Anwendung.
Viel Freude an der schönen ICT-Einrichtung!
Jörg Piper
Hallo,
Die Empfehlung, DIC Prismen fuer Hellfeldbenutzung zu entfernen, glaube ich in Bedienungsanleitungen gelesen zu haben, kann sie aber derzeit nicht wiederfinden.
In der Literatur finden sich hauptsaechlich Angaben zur Vereinbarkeit von DIC und Fluoreszenz. Auch da sind die Doppelbilder nachweisbar. Da in der Konfokalmikroskopie PSFs experimentell bestimmt werden, sind die Doppelbilder den Nutzern nicht entgangen. Aus diesem Grund wird auch die Kombination Phasenkontrast+Fluoreszenz statt DIC bevorzugt.
Hier finden sich harte Daten:
Zucker, R.M. (2005) Evaluation of Confocal Microscopy System Performance. Cell Imaging Techniques. Douglas Targets ed. Humana Press Chapter 5 77-135
4.23. Interference Contrast and Confocal
Interference contrast is a very useful parameter in microscopy and it can be
combined with fluorescence. However, because the microscope system was
designed for light to traverse through two interference filters, when this optical
system is applied to a confocal microscope there is distortion in the fluorescence
signals. The fluorescent light traverses the interference contrast filter and
excites the sample, and then the emitted fluorescence travels back down
through the same interference contrast filter and back through the scan head.
The resulting image shows a duplication of very small particles (0.17 μm, PSF
beads) and a distortion of larger particles. PSF beads show two spots and 0.5 μm
beads show an egg shaped image instead of a round image. The same distortion
that is observed on beads will occur on biological structures in cells (see Fig.
15). For optimum resolution of data that will be deconvoluted later, it is recommended
to remove the interference filters when acquiring an image.
Die Fluoreszenz-Emission ist unpolarisiert; verhaelt sich also genau so wie ein Hellfeldbild.
An motorisierten Fluoreszenzmikroskopen wird das DIC Prisma im Fluoreszenzmodus automatisch entfernt:
"Matching DIC prisms are moved into the light path when changing objectives; in fluorescence mode the DIC prisms are automatically removed from the light path to obtain best image quality."
http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-af6000/news/
Und noch eine Diskussion zu dem Thema:
http://confocal-microscopy-list.588098.n2.nabble.com/PSF-with-DIC-td3781952.html
Jon
Lieber Jon,
du zitierst "LEICA"-Quellen. Bei Leitz war es damals nicht möglich, die Prismen zu entfernen (Smith im Gegensatz zu Nomarski).
Auch wenn es sogar eine handvoll Nomarskis von Leitz gab.
Wolfgang
Zitat von: ortholux in Mai 09, 2014, 10:58:50 VORMITTAG
Lieber Jon,
du zitierst "LEICA"-Quellen. Bei Leitz war es damals nicht möglich, die Prismen zu entfernen (Smith im Gegensatz zu Nomarski).
Auch wenn es sogar eine handvoll Nomarskis von Leitz gab.
Wolfgang
Hallo Wolfgang,
Ich versuche eine Antowrt auf die Frage zu finden, ob der Verbleib der objektivseitigen Prismen im Hellfeld zu einer (wenn auch geringfuegigen) Verschlechterung der Bildqualitaet fuehrt.
Leider habe ich dazu bei Leitz keine direkten Angaben gefunden (die Litertur ist schwer zugaenglich). Es sollte aber unerheblich sein, ob Wollaston-Prismen oder Nomarski-Prismen verwendet wurden, denn entscheidend ist das Ausmass der Bildaufspaltung in der Objektebene.
Ich habe eine Literaturstelle gefunden, die echte Messwerte zeigt (Zucker, 2005). Ausserdem ist das Entfernen der Prismen gaengige Praxis (die beiden anderen Links). Natuerlich handelt es sich dabei um Nomarski-Prismen, denn die sind heutzutage gaengig.
Beim Leitz Smith-T waren die Prismen fest im Objektiv verbaut, vermutlich weil dort ein Wollaston-Prisma direkt in die hintere Brennebene des Objektivs eingebracht wurde (um das Nomarski-Patent zu umgehen??). Dementsprechend kann es fuer Hellfeldbeobachtung hier nicht herausgezogen werden. Also belaesst man es wo es ist (der Effekt auf das Hellfeldbild ist ohnehin gering), oder man tauscht die Objektive durch Revolverwechsel ganz aus.
Beste Gruesse,
Jon
P.S.: Gibt es in den "Leitz Mitteilungen für Wissenschaft und Technik" genauere Angaben zu den verschiedenen Interferenzkontrastsystemen von Leitz? Das wuerde mich sehr interessieren.
Hallo,
noch ein kleiner Nachtrag zu den "Doppelbildern" im Hellfeld, bezogen auf den Interferenzkontrast nach Smith (= Leitz Interferenzkontrast T). Tatsächlich gibt es bei korrekter Anwendung im Hellfeld keine Doppelbilder, weil nur eines der beiden Bilder in den Beobachtungsstrahlengang gelangt und das andere Bild oberhalb des Objektivs durch den dort befindlichen "Hellfeld-Analysator" geblockt wird.
Im ICT-Kondensor befindet sich in der Position "H" natürlich kein DIC- (=Wollaston)-Prisma im Strahlengang.
Anders verhält es sich beim ICT-Objektiv, weil ja dieses ein fest eingebautes Wollaston-Prisma in dessen hinteren Brennebene beinhaltet.
Die Strahlen, welche innerhalb des ICT-Objektivs zum dortigen Wollaston-Prisma gelangen, werden dort bei Hellfeldbeleuchtung in zwei separierte und leicht zueinander verschobene Teilstrahlenbündel aufgespalten., welche zwei Teilbilder generieren, deren Verschiebung, zumindest in der Theorie, unterhalb der Auflösungsgrenze des jeweiligen Objektivs liegen soll. Entscheidend ist für die Hellfeld-Beobachtung, dass die beiden Teilstrahlenbündel, welche durch Aufspaltung im objektivseitigen Wollaston-Prisma entstehen, senkrecht zueinander polarisiert sind.
Der originale ICT-Schieber, der anstelle eines herkömmlichen Analysators oberhalb des Objektivs in den Strahlengang eingeschoben wird, beinhaltet zwei separate, paarig nebeneinander angeordnete Analysatoren, welche unterschiedlich ausgerichtet sind, d.h. verschiedene Schwingungsebenen polarisierten Lichts passieren lassen. Für Hellfeld-Beobachtungen soll, abweichend von der Einstellung für Interferenzkontrast, der anders orientierte Analysator verwendet werden, der mit einem schrägen Pfeil markiert ist. Dieser Analysator ist so orientiert, dass er senkrecht zur Schwingungsebene eines der Teilstrahlenbündel steht und somit eines der beiden Teilbilder ausblendet. Daher gibt es bei korrekter Anwendung im Hellfeld kein Doppelbild-Problem, wenn die Interferenzkontrast-Einrichtung komplett ist und der originale Schieber mit beiden Analysatoren zur Verfügung steht. Nur ein Bild wird zur Zwischenbildebene "durchgelassen".
Wenn man vor dem Mikroskop steht, mit Blick auf den Objektivrevolver, dann verläuft der Doppelpfeil des "Hellfeld-Analysators", welcher die hindurch gelassene Schwingungsebene markiert, in 45 Grad von links unten nach rechts oben. Der daneben befindliche Analysator für Interferenzkontrast (ICT) ist hingegen mit einem Doppelpfeil markiert, der von vorne nach hinten zeigt. Wer also keinen originalen Doppelschieber mit zwei unterschiedlich orientierten Analysatoren hat, könnte sich mit etwas handwerklichem Geschick auch aus zwei einfachen Analysator-Schiebern entsprechende Analysatoren bauen, einen für ICT und einen für Hellfeld, wenn er den jeweiligen einzelnen Analysator in seiner Fassung so verdreht, dass dessen Orientierung "stimmt".
Ergänzender Hinweis zur Historie bzw. zur Erfindungsreihenfolge:
Das Wollaston-Prisma wurde m.W. zuerst erfunden, und Smith beschrieb sein Verfahren in 1947. In den fünfziger Jahren, d.h. etwas später, entwickelte Nomarski das Wollaston-Prisma zum Nomarski-Prisma weiter und baute hierauf seine Version des Interferenzkontrasts auf. Smith war also vor Nomarski. Zeiss hat das Nomarski-Verfahren zur Marktreife gebracht und Leitz die Smith-Variante.
Schöne interferierende Grüße
Jörg Piper
Hello all,
Just to add a practical touch to this discussion, I've made some comparison images. Normal Nomarski DIC though, unfortunately I do not have access to the Smith system. Someone might be willing to repeat this with the Leitz stuff though.
These images are made on an Olympus inverted IMT-2. Objective: 20x splanapo NA 0.7; condenser NA 0.55. Test specimen: Pleurosigma angulatum (Z-Rax; Klaus Kemp slide), Camera: 2.5" 5Mp cmos TIS, via 0.75x relay. Image 'resolution' 70 pixels/10um, straight from the camera (jpg), no post processing. Focussed 'live', trying to capture the striae structure on the valve with maximum detail.
The DIC system consist of 4 parts, coded here: Wobj (objective Wollaston prism) or Wcond (condenser prism), Ana (polarizer above the objective) and Pol (polarizer before the condenser entrance). Additionally, the Analyzer can be adjusted to 45 degrees from the normal position, denoted as Ana45o. Following combinations are shown:
1 BF
2 DIC
3 Wobj+Ana+Wcond
4 Wobj+Wcond+Pol
5 Wobj
6 Wobj+Pol
7 Wobj+Ana
8 Wobj+Ana45o
9 Wobj+Ana45o+Wcond
10 Wobj+Ana45o+Wcond+Pol
1. Golden standard: Brightfield:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/149857_44064014.jpg)
2. Full DIC, not as great as BF, but still ok:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/149857_19755795.jpg)
3. Removing the Polarizer only:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/149857_59875786.jpg)
4. Removing the Analyzer only:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/149857_811591.jpg)
5. Only the objective Wollaston in place:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/149857_30028882.jpg)
6. objective Wollaston + condenser polarizer only:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/149857_37326811.jpg)
7. Objective Wollaston + analyzer only:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/149857_38914754.jpg)
8. Objective Wollaston + analyzer, turned 45 degrees:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/149857_30559782.jpg)
9. Objective Wollaston + analyzer turned 45o + condenser polarizer:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/149857_56970122.jpg)
10. All DIC components but with analyzer turned 45o:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/149857_27519757.jpg)
Theoretical discussion appreciated, best wishes,
René
Hallo René,
sehr schöner systematischer Vergleich mit einem - wie ich finde immer schwierigen Testobjekt.
Ergebnisse sind doch ganz ok. Nur eines kann ich nicht verstehen Das DIC-Ergebnis hätte ich deutlich besser erwartet. Die sieht hier ja richtig matschig aus.
Hi Rene,
Thanks, that was a lot of work. However, I can barely see anything of the striations; everything is plain grey on my screen. What is your interpretation of what you see, since you have the original images? Or could you increase the contrast a bit and show small snippets side-by-side? At the moment it's hard compare across 10 large images.
Jon
Zitat von: Piper in Mai 10, 2014, 18:21:14 NACHMITTAGS
Für Hellfeld-Beobachtungen soll, abweichend von der Einstellung für Interferenzkontrast, der anders orientierte Analysator verwendet werden, der mit einem schrägen Pfeil markiert ist. Dieser Analysator ist so orientiert, dass er senkrecht zur Schwingungsebene eines der Teilstrahlenbündel steht und somit eines der beiden Teilbilder ausblendet. Daher gibt es bei korrekter Anwendung im Hellfeld kein Doppelbild-Problem, wenn die Interferenzkontrast-Einrichtung komplett ist und der originale Schieber mit beiden Analysatoren zur Verfügung steht. Nur ein Bild wird zur Zwischenbildebene "durchgelassen".
Hallo Jörg,
Danke fuer die ausfuehliche Beschreibung. Da erschliesst sich auch der Sinn des doppelten Analysatorschiebers!
Jon
Hi John, as long as you see some structure in the BF image, you get the conclusion. The Wollaston prism for the objective has a directional blurring effect in brighfield. For correct brighrfield it can be neutralized with an analyzer in the pathway, which needs however to be shifted 45 degrees from the normal direction, highly impractical and it takes that last edge of the contrast of the lens in any case. Adjust contrast on the first and last image, and you'll see what I mean.
Klaus, thanks. This is an inverted DIC system, the shearing might be larger than for an upright. So the DIC image probably looks better in an upright scope with 40x lens. I will see if I can find out more about the shearing characteristics for this system.
Best wishes, René