Liebe Auflöser oder die es werden wollen ;D
Ein kleiner Versuch zeigt, dass es nicht immer der Griff zu einer noch höheren Apertur sein muß. Diatomeen lassen sich ohne Informationsverluste in SW Darstellung abbilden. Erkennt man bestimmte Details nicht, so schwenkt man auf ein Objektiv mit einer höheren nummerischen Apertur was aber oft mit dem Übergang zur Ölimmersion verbunden ist. Geht es auch ohne Öl ?
Als kleines Beispiel soll die Nitzschia obtusa aus einem alten Testpräparat dienen. Laut Göke liegt die Gitterkonstante bei 0,33µm. Eigene Messungen zeigen 0,31 - 0,34µm, also gute Übereinstimmung.
Ein Objektiv mit einer NA von 0,95 sollte also die Auflösung bringen. Rechnung : d = λ / (NA Obj. + NA Kond.) ~ 0,29µm für weißes Licht.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/150204_10187156.jpg)
Mit gutem Willen geht das auch. Besser wird es aber erst bei höherer Apertur des Objektivs. Da stellt sich die Frage ob nicht eine kürzere Wellenlänge auch zum Erfolg führt.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/150204_41380462.jpg)
Bereits das Blaufilter BG12 hilft schon recht schön und übertrifft sogar die Ölimmersion im Kontrast. Greift man zur UV-Quelle so steigert man noch einmal die Auflösung und übertrifft auch rein theoretisch die Grenze der verwendeten Ölimmersion (Kondensor nicht immergiert).
Viel Spass bei eigenen Experimenten und blau-violette Grüße
Peter (H)
Hallo Peter
Vielen Dank für die eindrucksvollen Bilder bzw dem Vergleich: NA vs Wellenlänge des Lichts. Ich stelle immer wieder fest, daß sich Kondensor und Lichtquelle sehr stark auf das Ergebnis auswirken. Da hilft auch kein superteures Apo-Objektiv, ... "Ohne gutes Licht" bringt der Rest nicht viel.
Liebe Grüße Jorrit.
Guten Abend Herr Höbel,
ein paar Fragen zu meinem Verständniss:
• wie ist das Testpräp eingebettet, ist das bekannt?
• welchen Kondensor, welcher Ap haben sie verwendet (bei allen Aufnahmen nicht immergiert soweit ich es verstanden habe)
• wie sind die Aufnahmen der oberen Reihe beleuchtet (Glühlampe+Filter? LED?) , geschätzte Wellenlänge?
• welche ungefähre Wellenlänge nehmen sie an hat die weiße LED mit dem BG12?
Schon einmal besten Dank
Hallo Peter,
Zitatder verwendeten Ölimmersion (Kondensor nicht immergiert)
das verstehe ich nicht! Was bringt die Ölimmersion, wenn man beleuchtungsseitig die notwendige Apertur nicht anbietet ???
Herzliche Grüße,
Olaf
zu den Fragen
@ Stefan
• wie ist das Testpräp eingebettet, ist das bekannt?
nur mit Balsam beschriftet. Stammt um 1980-1985 vermutlich Microthek Hamburg
• welchen Kondensor, welcher Ap haben sie verwendet (bei allen Aufnahmen nicht immergiert soweit ich es verstanden habe)
apl.achr. Kondensor mit NA 1,4 nicht immergiert
• wie sind die Aufnahmen der oberen Reihe beleuchtet (Glühlampe+Filter? LED?) , geschätzte Wellenlänge?
LED Cree XM-L mit 5000K
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/150219_9971840.jpg)
• welche ungefähre Wellenlänge nehmen sie an hat die weiße LED mit dem BG12?
Maximum bei 420 - 430nm
@ Olaf
streng nach Köhler soll die Aperturblende ca. 2/3 der Objektiv-Apertur ausleuchten. Für das PL Apo 40/1,0 reicht also in jedem Fall ein trockener Kondensor. Bei dem CZJ Apo 100/1,32 wäre vermutlich noch etwas mehr an Auflösung möglich. Den Versuch habe ich versäumt. >:(
Grüße
Peter
Hallo Peter,
Zitatstreng nach Köhler soll die Aperturblende ca. 2/3 der Objektiv-Apertur ausleuchten.
Gilt das nicht nur für einen Kompromiß zwischen Auflösung und Kontrast? Nach meinem Verständnis hat man die maximale Auflösung nur, wenn man die Objektivapertur auch wirklich voll nutzt. Das können aber evtl. die Theoretiker in unserem Kreise mal erklären.
Herzliche Grüße,
Olaf
Hallo Olaf,
leider habe ich den Versuch abgebaut und finde so einfach nicht wieder diese Nitzschia im Streupräparat. Vielleicht schaffe ich es nochmal ?
Ich ging von der üblichen Formel aus : d = λ / (NA Obj. + NA Kond.) , d.h.:
1. Objektiv NA 1,32 , Kondensor nicht immergiert ~ 0,95 , weißes Licht (stimmt nicht ganz -> LED)
0,55 µm / (1,32 + 0,95) = 0,24 µm
2. Objektiv NA 1,32 , Kondensor immergiert 1,32 , weißes Licht (stimmt nicht ganz -> LED)
0,55 µm / (1,32 + 1,32) = 0,21 µm
3. Objektiv NA 0,95 , Kondensor nicht immergiert ~ 0,95 , UV-LED @ 365nm
0,365 µm / (0,95 + 0,95) = 0,19 µm
Nach dieser Überlegung bringt die kurze Wellenlänge selbst bei immergiertem Kondensor Vorteile. Zusätzlich verschafft man sich mit der kürzeren Wellenlänge noch einen anderen Vorteil. Nach mehreren Messungen fand ich, dass der Brechwert des Einbettmediums zu kurzen Wellenlängen steigt. http://www.mikroskopie-ph.de/Einbettung.html
Für Zrax können die RI Werte > 1,75 werden. Damit nimmt der Bildkontrast zu.
Schönes Wochenende
Peter
Zitat:
A)
ZitatNach meinem Verständnis hat man die maximale Auflösung nur, wenn man die Objektivapertur auch wirklich voll nutzt.
B)
ZitatDas verstehe ich nicht! Was bringt die Ölimmersion, wenn man beleuchtungsseitig die notwendige Apertur nicht anbietet
Lieber Olaf,
zu Deinen Fragen:
A) Richtig, aber: Die sichtbare Auflösung (also das, was wir als
"Strukturerkennung" wahrnehmen) ist eine
Funktion vor tatsächlicher Auflösung und Bildkontrast. Daher können Verfahren wie AVEC [Allen video enhanced contrast] noch Strukturen sichtbar machen, die das unbewaffnete Auge am Okular nicht wahrnehmen kann, die aber aufgelöst sind (nur uuuunglaublich schwach im Kontrast -
siehe Bild: Der AVEC Effekt ist im roten Kreis dargestellt).
B) Auch bei ziemlich orthogonalem Strahlengang (also bei sehr
kleiner Kondensorapertur) wird am Objekt Licht abgebeugt, also entsteht selbst dann ein Beugungsbild und somit eine gewisse Auflösung.
Welche abbildungsseitigen Beugungs-Maxima in das Objektiv eindringen können um somit zur Auflösung beizutragen hängt also zunächst einmal von der Apertur des Objektives ab!
Bei
hoher Kondensorapertur (und somit einem höheren Anteil schiefer Beleuchtung) erzeugt man noch stärkere Abbeugungen, also Maxima noch höherer Ordnung, dabei tragen diese dann (so sie dann doch noch ins Objektiv gelangen) zu einer entsprechend gesteigerten Auflösung als Folge einer gesteigerten Beleuchtungsapertur bei.
Die Ölimmersion bringt also auch etwas, selbst wenn man kondensorseitig eine gute (z.B. 0.9 ) aber nicht einmal die maximal mögliche Beleuchtungsapertur anbietet.
Herzliche Grüsse,
Holger
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/150243_49954328.jpg)
Danke, Holger!
ZitatDie Ölimmersion bringt also auch etwas, selbst wenn man kondensorseitig eine gute (z.B. 0.9 ) aber nicht einmal die maximal mögliche Beleuchtungsapertur anbietet.
Darf ich das so verstehen, dass es schon etwas bringt, aber dass der Gewinn an Auflösung mit Immersion des Kondensors noch besser wäre? Wenn ja, dann sollte Peter seine Versuche aber unter optimalen Bedingungen - also mit beidseitiger Immersion - machen.
Herzliche Grüße,
Olaf
Darf ich auch noch anmerken, dass bereits eine schmalbandige Lichtquelle eine bessere Auflösung bringt, da dadurch quasi alle chromatischen Fehler der Optik beseitgt werden. Ich sehe immer wieder, dass ich mit den 6 nm breiten Interferenzfiltern viel schärfere Aufnahmen bekomme als mit weissem Licht, egal bei welcher Filter-Wellenlänge. (Es ist erstaunlich, wieviel man Kurbeln muss, um beim Wechsel von 400 nm nach 560 nm wieder scharf zu stellen).
Die UV LED von Peter ist schmalbandiger als die BG12 Kombination. Um zu sehen, obe es wirklich an der Wellenlänge liegt oder an der Bandbreite, bräuchte es eigentlich einen Vergleich mit geicher Bandbreite aber anderer Wellenlänge. (Nein, ist keine Aufforderung zur Beschäftungungstherapie.... :))
Gruss,
Stefan
Hallo Olaf,
ja natürlich, mit immergiertem Kondensor UND immergiertem Objektiv erreicht man das optimale auf der Beleuchtungs- und Abbildungsseite.
Und wie auch völlig richtig von Peter(_h) und Stefan angemerkt wurde, verbessert sich die Auflösung weiter bei Anwendung von möglichst kurzwelligem Licht, bzw. zusätzlich auch sehr schmalbandigen Filtern,
da bei letzteren die Abbildungsfehler der Linsensysteme weiter verringert werden.
Stefan und ich haben beide schon multispektrale Aufnahmen gemacht und dann zu einem quasi Farbbild zusammengesetzt.
Übrigens - Peter, Du hast ja auch eine hochwertige s/w Kamera. Wenn Du mit den drei RGB-Farbfiltern Kodak Wratten No. 58, No. 25 und No 47B je ein s/w Bild aufnimmst
(wie Stefan schon anmerkte mit Schärfekorrektur nach den Filterwechseln !!) und dann die 3 Kanäle zu einem RGB-Farbbild kombinierst, bekommst Du hervorragende, sehr scharfe Farbbilder.
Bei unbewegten Objekten ist dies m. E. die erste Wahl gegenüber einer Farbkamera mit Bayer Filter und einer auch bei hochkorrigierten Objektiven nicht 100%iger Schärfekorrektur bei den verschiedenen Farben.
Herzliche Grüsse
Holger
Ein Hallo in die Runde.
Bevor ich das Wochenende mit weiteren unzulänglichen Versuchen verbringe, wäre eine genaue Definition der Versuchsbedingungen sinnvoll.
1. Halogenleuchte / weiße LED ?
2. Kondensor trocken / immergiert ?
3. Testobjekt ? Diatomeen ? Nitzschia sigma / Nitzschia obtusa / Frustulie rhomboides / Surirella gemma ? (das ideale Testgitter besitze ich nicht)
4. Objektiv ? Zeiss Planapo 100/1,3 / CZJ Apo 100/1,32 / Leitz Apo 90/1,40 oder ?
5. monochrome Kamera DMK72 Pixel 2,2 x 2,2µm / Farbkamera DFK72 / CCD-Kamera DBK41 (ohne IR-Sperrfilter) ?
6. Filter ?
7. wie die Daten aufbereiten ?
So kann diese Liste noch in vielen Punkten vervollständigt werden.
@ Holger
ich könnte einen Filtersatz von Astronomik nehmen.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/150254_19497381.jpg)
und mit welchem Objekt und welcher Beleuchtung ?
Frohes nachdenken
Peter
Hallo Peter,
ja prima, diese Filter sollten auch gehen, evt. musst Du am fertigen Farbbild noch einen Weissabgleich machen.
Ich würde div. Objektive mit versch. Farbkorrektur testen, weisse LED vs Halogenlampe.
Objekte - nun, wie Stefan schon angemerkt hat sind ja Diatomeenschalen am besten monochromatisch zu beleuchten und aufzunehmen, die sind ja nicht bunt.
Also hier geht es ja dann um die Schärfe / Auflösung bei FArbaufnahmen bzw. Vergl. Farbkamerabild vs. Monokamera-RGB-Komposit.
Also Objekt würde sich ein bunter Pflanzenschnitt sowie ein bunter Histoschnitt eignen - beide mit mit vielen Details.
Bilder nicht geschärft. Du kannst ja die Bilder der Farbkamera mal in die RGB Kanäle zerlegen und staunen welcher Kanal am schärften oder am verrauschtesten ist - ist wirklich interessant !
LG
Holger
Zitat von: peter-h in Mai 17, 2014, 10:26:29 VORMITTAG
Ich ging von der üblichen Formel aus : d = λ / (NA Obj. + NA Kond.)
mal eine frage von einem nicht-physiker:
stimmt die gleichung überhaupt?
die summe der beiden NA im nenner kommt mir etwas dubios vor
Zitat von: smashIt in Mai 17, 2014, 17:32:15 NACHMITTAGS
Zitat von: peter-h in Mai 17, 2014, 10:26:29 VORMITTAG
Ich ging von der üblichen Formel aus : d = λ / (NA Obj. + NA Kond.)
mal eine frage von einem nicht-physiker:
stimmt die gleichung überhaupt?
die summe der beiden NA im nenner kommt mir etwas dubios vor
Hallo Chris,
das "+ nA(Kond.)" steht für die möglichen Werte zwischen 0 (der einfachen geraden Beleuchtung) und 2 (einer schiefen Beleuchtung, bei der Beleuchtungsapertur und Objektivapertur identisch sind). Für diese beiden Extremfälle steht dann in der Formel vor der nA(Obj.) entweder gar nichts, oder eben eine 2.
Herzliche Grüße
Frank
Guten Morgen in die Runde!
Wie ist am Sonntag Morgen der Appetit auf noch etwas mehr Theorie? ;D
Nachdem Abbe 1882 die durch seine Arbeiten an der Auflösung von Linien empirisch bestätigte Formel d = λ / (NA Obj. + NA Kond.) publiziert hatte,
hat der Engländer Lord Rayleigh später in den 1880er Jahren ein nach ihm benanntes Auflösungskriterium (Rayleigh-Kriterium) publiziert ,
welches auf die Arbeiten von Airy zurückgeht, und für selbstleuchtende oder inkohärent beleuchtete Objekte gilt.
Airy hatte gefunden, dass ein Punkt durch das Mikroskop-Objektiv als ein Scheibchen abgebildet wird (das nach ihm benannte Airy-Scheibchen),
welches ein helles Zentrum und einen Rand mit abfallender Intensität hat.
Rayleigh hat nun gefolgert, dass zwei Punkte, die vom Beobachter am Okular noch als zwei getrennte Punkte erkennbar sein sollen,
mindestens durch den Radius der Airy-Scheibchen separiert sein müssen (Bild 1 unten soll das verdeutlichen).
Modellrechnung: Bei einem Objektiv 100/1,30 und einem Airy-Scheibchen Radius von 0,26 µm beträgt nach dem Rayleigh-Kriterium die max. mögliche sichtbar aufgelöste Distanz zwischen zwei Punkten
(bei der Annahme von grünem Licht von 0,55 µm):
1,22λ / (NA Obj. + NA Kond.)
[1,22x0,55 / (1,3+1,3)]
Die vom Rayleigh-Kriterium, basierend auf den Airy-Scheibchen, angegebene max. Auflösung ist also 1,22x kleiner als die nach der Abbe Formel zu erwartende.
Das Beugungsbild eines Punktes ist ein konzentrisches Airy-Pattern (s. Bild1 und Bild2 unten), und nur das innere Maximum nennt man Airy-Scheibchen.
Der Intensitätsverlauf des Beugungsbildes wird mathematisch durch eine Bessel-Funktion beschrieben, damit hat man den Radius des Airy-Scheibchen auf die Distanz 0 bis zur 1. Nullstelle festgelegt
(Mittelpunkt bis zur roten Linie in Bild 2).
Da Objektive mit kleinerer Gesamtvergrösserung auch kleinere Airy Scheibchen liefern (was sich nach dem Gesagten ja positiv auf die zu erzielende Auflösung auswirkt),
haben die Mikroskophersteller versucht, einen möglichst guten Kompromiss zwischen einer etwas niedrigeren Gesamtvergrösserung als 100x bei max. Auflösung (meist 1,3 - 1,4) zu entwickeln.
Dies ist der Grund warum heute das beliebte Objektiv 63:1/1,4 existiert, bei dem diese Bedingungen offenbar optimal erfüllt sind.
Aufgrund der in Bild3 zu sehenden Intensitätsverteilung konnte das AVEC-Videokontrast Verfahren nach Allen durch eine weitergehende Kontrastseparierung benachbarter Maxima
die praktisch erzielbare Auflösung unter Verwendung einer s/w Kamera mit hoher Dynamik im hellen Bereich nochmals um den Faktor 2 steigern.
Herzliche Grüsse,
Holger
Bild 1
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/150292_52879767.jpg)
Bild2
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/150292_10394329.jpg)
Bild 3
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/150292_49045866.jpg)
Guten Morgen Holger,
das war eine sehr schöne Vorlage für mich, denn so kann man ganz sicher den Einfluß von Kondensor-Apertur und Beleutungswellenlänge zeigen. Mein Objekt ist ein kleines versilbertes Plättchen mit vielen Minilöchern.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/150297_45311050.jpg)
Schönen Sonntag und Grüße
Peter
Lieber Holger, lieber Peter,
in zwei ausgezeichneten Beiträgen habt ihr kurz und knackig das vermittelt, wofür ich damals, zu "Astronomischen Zeiten", auch astronomische Zeiten gebraucht habe, das "Auflösungsvermögen optischer Systeme" halbwegs zu verstehen.
Eine Frage hätte ich noch: Welche Parameter sind warum für den Faktor 1,22 verantwortlich?
Da er z.B. in dem Sterne & Weltraum Buch "Tips & Tricks für Sternfreunde" nur am Rande erwähnt wurde (... Praktische Beobachtungen zeigen, dass die so ermittelten Werte mit dem Faktor 1,22 multipliziert bzw. dividiert werden müssen, um praktisch brauchbare Werte zu erhalten ...), hatte ich diesen Wert einfach so hingenommen.
Er ist also nicht variabel und hat auch nichts mit den Objektivdaten zu tun?
Herzliche Grüße
Frank
Danke für die Blumen, lieber Frank.
ZitatWelche Parameter sind warum für den Faktor 1,22 verantwortlich?
Der Faktor 1,22 ist nicht allzuschwer herzuleiten, er ergibt sich aus der mathematischen Modellierung des Airy-Patterns mittels einer 2D-Bessel-Funktion, wie ich zuvor kurz angemerkt hatte.
Die erste Nullstelle der rotationssymmetrischen 2-dimensionalen Besselfunktion J1(x)/x ist ja als Rand des Airy-Scheibchens definiert, sie liegt bei X = 3,83
In Polarkoordinaten heisst das: sin(theta) = 3,83λ/2piR
Nach Rauskürzen von pi ergibt das 1,22λ/(2R)
@Peter: Schöne direkte Umsetzung der Theorie - ganz herzlichen Dank! ;)
Herzliche Grüsse,
Holger
Eine passende Grafik dazu gibt es hier: http://books.google.ch/books?id=e2PNx8w1MqQC&lpg=PP1&dq=fundamentals%20of%20light%20microscopy&pg=PA83#v=onepage&q&f=false
oder hier, falls google .ch und .de sich weigern:
http://books.google.com/books?id=e2PNx8w1MqQC&lpg=PP1&dq=fundamentals+of+light+microscopy&pg=PA83&redir_esc=y#v=onepage&q&f=false
Gruss,
Stefan
Yep - danke Stefan, schöne Abbildung!
Das war wieder ein schönes Forum Teamwork ;)
H.