Mikro-Forum

Hallo,
suche eine schonende Methode zur Fixierung von Pantoffeltieren Paramecium caudatum.
Kann mir da jemand weiterhelfen?

Mit freundlichen Grüssen!

Hans Wilhelm

Hallo Hans Wilhelm,

Du kannst versuchen, Hühnereiweiß dünn auf einen Objektträger zu geben und darauf einen Tropfen mit vielen Paramecien zu geben. Funktioniert gut mit einem Tag alten Eiweiß. Den Tropfen eintrocknen lassen, dann
halten die Organismen in etwa die Form und Du kannst sie weiter bearbeiten.

Die übliche Fixierung mit Formaldehyd zerstört die Form.

Gruß

Klaus

Hallo Hans Wilhelm,

ich hatte das mal versucht, in dem ich den OT mit den P in einer Petrischale mit Deckel neben einen OT mit Formaldehyd gelegt habe. Kann mich aber nicht erinnern, ob das hinsichtlich Formerhaltung funktioniert hat.

Vlg
Timm

Hallo Miteinander,

irgendwann möchte ich das auch mal mit verschiedenen Protozoen versuchen (für die Elektronenmikroskopie habe ich das vor laaanger Zeit mal im Studium gemacht, müsste aber erst das Rezept rauskramen, falls ich es überhaupt noch finde). Daher ein interessantes Thema.

Das Eiweiß kann man ja noch nicht gerade als "Fixiermittel" bezeichnen, es klebt die Einzeller nur fest. Vorher kann/sollte man übrigens zentrifugieren (wenn man denn eine Zentrifuge hat). Man kann wohl auch ausstreichen, auch direkt auf einem Deckglas (welches man dann auf ein Fixiermittel werfen kann - so verhindert man u.U. auch das Abspülen der Tierchen).

Einfach ist das richtige Fixieren wahrscheinlich nie und evtl. muss man immer ein paar Abstriche bei der Erhaltung einer bestimmten Struktur zugunsten einer anderen machen. In Max Mayer's "Kultur und Präparation der Protozoen" sind einige Fixiermittel aufgelistet, aber das Büchlein ist älter und die Chemikalien dort sind nicht ohne und wohl kaum zu bekommen. Schonend soll wohl z.B. eine Vorfixierung mit Osmiumtetroxid-Dämpfen sein, danach kann "normal" weiterfixiert werden.

Genauere Rezepte aus dem Büchlein kann ich evtl. bei Bedarf und Zeit hier nachreichen - aber wie gesagt: Das wird man heute nicht alles so einfach im Hobbybereich nachmachen können. Mehrere Mittel enthalten z.B. auch Sublimat = Quecksilberchlorid. Über Quecksilber hatten wir ja neulich eine Diskussion im "Mikro-Café"... Aber auch ein paar heute noch gebräuchliche Substanzen sind genannt.

Viele Grüße

Sebastian

Zitat von: Oecoprotonucli in Juni 03, 2014, 09:39:20 VORMITTAG

Einfach ist das richtige Fixieren wahrscheinlich nie und evtl. muss man immer ein paar Abstriche bei der Erhaltung einer bestimmten Struktur zugunsten einer anderen machen. In Max Mayer's "Kultur und Präparation der Protozoen" sind einige Fixiermittel aufgelistet, aber das Büchlein ist älter und die Chemikalien dort sind nicht ohne und wohl kaum zu bekommen. Schonend soll wohl z.B. eine Vorfixierung mit Osmiumtetroxid-Dämpfen sein, danach kann "normal" weiterfixiert werden.

Sebastian

Ergänzung.
Osmiumtetroxid-Dämpfe sind gefährlich, führen leicht zu dauernden Augen- und Lungenschäden, greifen alle Schleimhäute an. Es genügen bereits die Dämpfe, die von wenigen Tropfen aufsteigen. Die Anwendung unter einem Abzug oder im Freien ist sehr empfehlenswert.
KH

Hallo Herr Henkel,

Danke für die Ergänzung. Und damit das auch noch mal für die Personen deutlich wird, die weder im Mikro-Café gelesen haben, noch sonst schon mal etwas von Quecksilbersalzen gehört haben, also noch einmal: Das ist giftig!

Ich habe noch weitere Literatur zu professionellen Fixier-Rezepten. Die Fixantien sind ja meistens und generell nicht besonders gesund. Also Glutaraldehyd, Formalin und weitere übliche spielen da neben einigen anderen Chemikalien z.B. auch eine Rolle.

Wenn man kein allzu dauerhaftes Dauerpräparat machen muss, reicht ja als erster Versuch vielleicht tatsächlich die Trocknungsmethode. Man kann wohl auch ein wenig mit dem Fön dabei nachhelfen.

Viele Grüße

Sebastian

Hallo,

es kommt darauf man, wofür man fixieren will. Fixieren im Sinne von "festlegen" oder fixieren im Sinne von "töten und haltbar machen"?

Für das "Festlegen" kann man die Viskosität des Wassers mit Quittenschleim, Ultraschallgel und auch Methylzellulose erhöhen. Man kann auch etwas Zahnarztwachs mit den Ecken eines Deckglases abkratzen. Dann kann man das Deckglas andrücken und dadurch die Ciliaten "festlegen".

Wenn man fixieren (im Sinne von töten) will, dann sind sehr giftige Chemikalien wie Osmiumtetroxid und Quecksilber(II)-clorid nur nötig, wenn z.B. für die Elektronenmikroskopie die Gestalt erhalten bzw. der Cilienschlag eingefroren werden soll. Das ist alles sehr aufwendig und nur in einem entsprechend ausgestatteten Labor machbar.

Ansonsten ist 2.5% Glutaraldehyd in 50-100 mM Phosphat- oder Natriumkakodylat-Puffer das Mittel der Wahl.

Herzliche Grüsse,
Eckhard

Zitat von: Eckhard in Juni 03, 2014, 16:07:39 NACHMITTAGS
Wenn man fixieren (im Sinne von töten) will, dann sind sehr giftige Chemikalien wie Osmiumtetroxid und Quecksilber(II)-clorid nur nötig, wenn z.B. für die Elektronenmikroskopie die Gestalt erhalten bzw. der Cilienschlag eingefroren werden soll. Das ist alles sehr aufwendig und nur in einem entsprechend ausgestatteten Labor machbar.

Hallo Eckhard,

naja, wenn wir also die Unterschiede jetzt schon herausarbeiten, dann müsste man wohl noch einmal klarstellen, dass es bei diesem Fixieren ja nicht primär ums Töten geht, sondern darum, die Strukturen möglichst gut zu konservieren (Proteine quervernetzen etc.). (Dummerweise ist das eher selten mit dem Leben vereinbar.) Und dabei geht es ja auch um innere Strukturen insgesamt, nicht nur um die Cilien. Aber wenn Dein einfaches Fixans mit Glutaraldehyd diesen Zweck schon erfüllt, ist es natürlich ausreichend. Das scheint sich gut mal ausprobieren zu lassen.

Viele Grüße

Sebastian

Hallo Sebastian,

alle Standardfixierungen für die Elektronenmikroskopie für Protisten benutzen als ersten Fixierungsschritt Glutaraldehyd (tötet und vernetzt Proteine). Als zweiter Schritt wird Osmiumtetroxid eingesetzt, denn das verklebt die Membranen und diffundiert in die Zelle. Dadurch wird die Gestalt etwas gehärtet und durch die hohe Ordnungszahl des Osmiums gibt es einen besseren Kontrast. Quecksilber(II)-clorid ist nur notwendig, wenn der Zelltot so schnell eintreten soll, dass keine Trichocysten abgefeuert werden und der Cilienschlag "eingefroren" wird.

Herzliche Grüsse,
Eckhard

Hallo Eckhard,

in meiner durchaus auf Protozoen spezialisierten Literatur finden sich aber schon Beispiele, wo eben OsO₄ auch schon im ersten Schritt dabei ist, sowohl als Dampf oder in der Lösung (zur "Erhöhung der Stabilität der Zellen" durch Proteinquervernetzung) und es um lichtmikroskopische Methoden geht (so etwas wie Silbernitratfärbung u.a.). So eben auch in oben genanntem Mayer. Ebenfalls im Mayer wird eben auch das HgCl₂ benutzt, ebenfalls für lichtmikroskopische Methoden. Ob das wegen der Trichocysten so ist, kann ich im Moment nicht beurteilen.

Jedenfalls kommen auch Carnoy's und Bouin's Fixans und auch Formalin als Fixiermittel vor, je nach Methode und Ziel. In Foissner's (et. al. 1991) "Taxonomische und ökologische Revision der Ciliaten des Saprobiensystems" wird gesagt, dass die "Trockenen Versilberungsmethoden" (siehe obige "Luft- oder Föntrockung") nicht gut geeignet für Ciliaten sind, dagegen eben die "nassen" besser.

Bei dieser Methode gibt es sehr kurzgefasst und unter anderem diese Schritte:

- Eine Fixierung in Champy's Gemisch (enthält u.a. OsO₄)
- Postfixierung in da Fano's Gemisch
- Aufbringen der Zellen auf Objektträger in geschmolzener Salzgelatine
- in feuchter Kammer erstarren lassen
- Abspülen mit A. dest.
- in Silbernitratlösung stellen
- UV- oder Sonnenlichtbestrahlung
- Entwässern in Alkoholreihe
- Xylol (heutzutage vielleicht durch "Rotihistol" u.ä. ersetzbar)
- Einbettung in Euparal oder Eukitt

Viele Grüße

Sebastian

Hallo Sebastian,

Es gibt bestimmt 1000 Arten, Paramecium zu fixieren. Wie gesagt, fürs Lichtmikroskop ist Glutaraldehyd brauchbar, es ist in der 2.5% Konzentration nicht so gefährlich. Und anstelle des giftigen Natriumkakodylats kann man auch mit Phosphatpuffer arbeiten.

Natürlich kannst Du auch andere giftige Verbindungen nehmen.

ZitatChampy's Gemisch

Von sowas würde ich die Finger lassen. Da ist Chromtrioxid drin! Das kann Foissner gerne in seinem Labor machen. 

früher hat man OsO4 deutlich häufiger eingesetzt. Da wurde mit OsO4 fixiert und dann im Mikroskop betrachtet. Der Wissenschaftler war danach oftmals 6 Wochen halb blind :D Ich weiss, dass oftmals Glutaraldehyd und Osmiumtetroxid zusammen eingesetzt werden. Ich habe damit jedoch keine so guten Erfahrungen gemacht. Hintereinander ist besser. Man kann auch mit Osmiumtetroxid 0.5% vorfixieren, dann 2.5% Glutaraldehyd und dann noch einmal nachfixieren in 2% Osmiumtetroxid. Dadurch bleiben feine Strukturen auf der Glykokalix von Amöben oftmals besser erhalten.

REM/TEM Fixierung ist immer noch etwas Alchemie.

Herzliche Grüsse,
Eckhard

Hallo Eckhard,

ja, ohne vernünftiges Labor scheint da kaum was zu machen zu sein.

Schade, weil mich das schon interessieren würde und man die Tierchen ja relativ einfach gewinnen und aufbewahren kann und auch die ganze Mikrotomie und Paraffineinbettung etc. wegfällt.

Immerhin, eine nicht ganz so giftige Methode (im Vergleich zu den Anderen) hätten wir also schon mal. Und vielleicht erreicht man ja mit den anderen genannten, etwas üblicheren Fixantien (die aber wie gesagt auch nicht ganz ungefährlich sind) auch etwas, wenn man etwas Herumprobiert.

Eine Zentrifuge habe ich auch nicht und bei mir kommt jetzt sowieso erst einmal etwas Anderes dran.

Ob wir Hans Wilhelm nun geholfen haben, ist erst einmal offen.

Viele Grüße

Sebastian

Hallo Sebastian,

Wenn Du eine gute Nährlösung für die Paramecien hast, vermehren sie sich so rasant, dass Du keine Zentrifuge benötigst.

Gruß

Klaus

Hallo Klaus,

ich habe Tetrahymena, sofern meine Kultur noch rein ist - (und in weiteren Gefäßen vermutlich so alles Mögliche) - und es stimmt, die wachsen ziemlich dicht.

Danke + besten Gruß

Sebastian

An alle Mikroskopier die auf meine Anfrage geantwortet haben,
vielen Dank für die Infos, ich bin ganz überrascht von der Resonanz zu
meinem Problem.
Die meißten der genannten Chemikalien sind für mich nicht beschaffbar
und wohl auch im Hobbybereich wegen der Giftigkeit nicht empfehlenswert.
Daher habe ich die von Klaus vorgeschlagene Methode mit dem Hühnereiweiß
ausprobiert. Es klappt nach anfänglichen Ungeschicklichkeiten ganz gut!

Damit möchte ich für heute schließen und wünsche allen ein schönes
Pfingswochenende!

Hans Wilhelm

Hallo Alle Mikroskopiker.

Ich halte auch die Methode mit dem Hühner-Ei-Eiweiss am besten.

Ausserdem lassen sich fast alle P.-Tiere leicht in Roh oder Reinkulturen nachzüchten,
halten und füttern. Ein Neuansatz mit einer "Impfung ist auch kein Problem.

So hat man auch nach wochenlangen "Beobachtungspausen" immer wieder "Material" für
weitere Experimente.

Auch stark verdünnte Färbemittel (die ganz einfachen sind: Rote, blaue oder grüne Tinte) lassen sich so
vor dem Eiweiss-Einsatz einsetzen. (Auf dem OT- oder in einem Zweit-Hälterungsgefäss, für wenige Tage.)

Diese verdünnten Tinten, auch auf PH 7 abgepuffert, können nach einiger Zeit (auch nach Wochen)
Filtriert werden, um Schwebstoffe und Ausfällungen zu entfernen.

Ein UHC - Filter allein, oder kombiniert mit schwachen Farbfiltern kann den Kontrast erhöhen.

Grüsse von Günter, Lünen, Nähe Dortmund.