Hallo liebe Stacker
Beim Stacken tritt die Frage auf, wie gross müssen die Stackschritte sein, wie kann man sie berechnen?
Ich habe mal nach Erfahrung in der Praxis eine Formel kreiert:
Stackschritte in mm = 0.00055 / (Na x NA) / (10 x NA + 1)
0.00055 / (Na x NA), ist die Tiefenschärfe
10 x NA + 1, ist die Anzahl der Bilder innerhalb der Tiefenschärfe, sie berücksichtigt, dass bei höherer Apertur mehr Bilder innerhalb der Tiefenschärfe nötig sind, um zu einem vergleichbaren Ergebnis zu kommen.
Das "+1" ist bewusst, vor allem im Bereich niedriger Apertur (z.B. 0.1) wirksam.
Diese Formel ergibt im Bereich 1:1 bis 100:1 höchst aufgelöste Stacks.
Verwendet man die doppelte Strecke von Bild zu Bild, resultieren gut aufgelöste Stacks, bei weiterer Verdoppelung der Distanz reicht es knapp noch fürs Internet.
Diese Formel resultiert NICHT aus wissenschaftlichen Untersuchungen, sondern ist die Essenz meiner heimischen Makro- und Mikroskopischen Beobachtung.
(Zur Beobachtung im Heim, lasse ich mir noch etwas Zeit)
Kritik, wie sachdienliche Hinweise sind erwünscht, ebenso humorvolle Randbemerkungen.
Kurt
Hallo Kurt,
Im "Mikrokosmos" Jg. 1988 im Juliheft Seite 216ff. hat Gerhard Göke einen gut verständlichen Artikel "Schärfentiefe und Schärfentiefeerweiterung der mikroskopischen Abbildung veröffentlicht. Die Formel lautet: tm = n(l/2A² + 0,15/A*VMik) wobei tm = Schärfentiefe in mm; n = Brechzahl ; l = Wellenlänge des Lichts; A = n.A.; 0,15(mm) = zulässige Größe des Unschärfekreises bei konventioneller Sehweite. Die Vergrößerung des Mikroskops Vmik kann durch den Maßstab des Endbildes ersetzt werden. Ich verstehe aber nicht , warum Gerhard (Rawfoto) von ,,absoluter Schärfe" spricht, die es im Licht dieses Artikels doch eigentlich garnicht geben kann. Ich hoffe, ich konnte helfen!
Es wünscht ,,Gut Licht"
Heinrich(limno)
In der Formel l=lambda
Hallo Heinrich
Ich spreche von Kernschärfe und nicht von absoluter Schärfe, die wiederum ist jener kleine Teil der Schärfentiefe indem der Zerstreuungskreis am kleinsten ist ...
Der Zerstreuungskreis von Göke entspricht nicht der Betrachtungsweise von Digitaldaten, die stammt noch aus der Ära des Films. Ich würde die vom Gefühl her auf 0,08 - 0,1 legen. Grund: jeder Käufer eines Bildes betrachtet diese mit 100 x und nicht mehr mit der Lupe ...
Lieber Kurt
Wollte nur die Aussage von Heinrich richtigstellen, ich muss mir Deine Formel erst in Ruhe ansehen und mit meinen Erfahrungswerten vergleichen ...
Liebe Grüße
Gerhard
Hallo Heinrich
Vielen Dank für deinen Hinweis. Es geht jedoch nicht um die Tiefenschärfe, wie sie bei normaler Betrachtung empfunden wird!
Schärfe ist der optische Eindruck beim Sehen und ist ihrerseits von mehreren unterschiedlichen, messbaren Faktoren abhängig, Auflösung, Kontrast usw..
Am wichtigsten erscheint mir die Auflösung, denn diese kann in der digitalen Fotografie nicht so einfach und massiv wie der Kontrast mit Bildbearbeitung erhöht werden.
Ich möchte die Grösse der Distanz von Bild zu Bild beim Stacken wissen, bei unterschiedlichen Objektiven und Abbildungsmassstab, dies bei vergleichbarer resultierender Bildqualität.
Hallo Gerhard
Anbei die Stackschritte in Millimeter in Abhängigkeit der Apertur, bei gleichbleibender Bildqualität und optimalster Auflösung.
Apertur / Stackschritt in mm
0.09 / 0.036
0.11 / 0.021
0.13 / 0.014
0.15 / 0.0098
0.2 / 0.0046
0.25 / 0.0025
0.3 / 0.0015
0.4 / 0.00069
0.5 / 0.00037
0.7 / 0.00014
0.8 / 0.000095
Kurt
Zitat von: Kurt Wirz in Juni 15, 2014, 23:54:43 NACHMITTAGS
bei gleichbleibender Bildqualität und optimalster Auflösung.
Hallo Kurt,
es fehlen Angaben zu Bildgröße oder Sensorauflösung, denn davon hängen die Tabellenwerte doch ab?!
Gruß,
Stuessi
Hallo Kurt,
ich habe mit großen Augen auf die Tabelle geblickt und mir erlaubt eine Regressionsrechnung mit den Werten auszuführen.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/152240_45586451.jpg)
Jetzt kommt meine Frage zu Aufnahmen mit Immersionsobjektiven und Aperturen über 1,0. Es geht aus der Extrapolation hervor, dass nun die Schrittweiten < 50 nm !!! sein sollen. Da der Korrelationskoeffizient von 0,999 vorliegt, ist die Extrapolation sicher auch legal.
Jetzt die Frage an alle Feinmechaniker: Können solche Schrittweiten ( nicht theoretisch ! ) sondern in der Praxis mit einem Mikroskoptisch realisiert werden ? Ist die Mechanik dafür ausgelegt?
Oder werden nun Piezoelemente benötigt und nicht der Tisch, sondern das Objektiv verstellt? Oder habe ich etwas noch nicht verstanden? Müssen solche Aufnahmen dann in einem klimatisierten Raum stattfinden? Ein kleines STANDARD oder PHOMI erfüllt solche Anforderungen sicher nicht.
Unwissende Grüße
Peter
Hi Kurt,
From my own personal experience with a 20x/0.7 lens of fluorescence images (ie full aperture), I routinely stack 1um images. By using an optivar 1.5x (M=30x), I do use 0.67um distance stacks for the most critical specimen. My images (often dinoflagellates) can be found here on the forum. I never found a need for adding more images to the stack.
Technicalities: dry objective 20x NA 0.70 Oly Splanapo at 20 or 30x (optivar); specimen in water; camera 5Mp CMOS colour via 0.75x relay optics. Camera 'resolution' 66 pixels/10um (20x) or 100pixels/10um (30x).
For example, here's a dino from brackish waters:
Alexandrium ostenfeldii, cel diameter about 55um, 20x objective.
Frontal view, stack of 18 img, 1um apart:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/152248_39997193.jpg)
Top view, 20x objective, stack of 23 img, 1um apart:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/152248_3501148.jpg)
Top view, apical pore, 20x1.5 (30x), 5 images, 0.66um apart, crop at 100% (100 pixels/10um):
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/152248_62433635.jpg)(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/152248_28343124.jpg)(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/152248_42062636.jpg)(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/152248_12813664.jpg)(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/152248_4343522.jpg)
And here's the corresponding Pyramid stack with Helicon Focus:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/152248_26492598.jpg)
The stack could be a bit better, the first image of the stack shows a more clear inner line of the 'key hole' pore. Mind you, this is at the edge of resolution for this lens. But this is what Helicon Focus makes of it in auto-mode. The thick line of the key hole is about 0.5um thick, the distance between the thick and thin line is 0.7um. The calculated resolution of this lens is 0.5um with green light.
Best wishes, René
Moin Peter,
meiner Meinung nach müsste das auch mechanisch machbar sein, wenn nicht erforderlich ist, dass der Tisch, auf dem sich das Objekt befindet, bei jedem Bild reproduzierbar stoppt. Wenn der Tisch (oder die Optik, je nachdem ob aufrechtes oder inverses Mikroskop) gegen die Schwerkraft, also von unten nach oben um ruckelndes Nachrutschen zu vermeiden, langsam und gleichmäßig auf der optischen Achse bewegt wird, ist die Feinheit der Einzelaufnahmen doch nur durch ihren zeitlichen Abstand limitiert. Unschärfen durch die Bewegung lassen sich durch kurze Belichtungszeiten - heute dank der Empfindlichkeit der Sensoren wahrscheinlich meist auch ohne Blitz erreichbar - vermeiden.
Kurt hat Vergleichbares doch mit seiner "Büchse der Pandora" schon demonstriert. Sollte es dennoch an der Feinmechnik scheitern, könnte ich mir einen aufsetzbaren, kleinen Heiztisch auf einem Mikroskoptisch gut vorstellen. Ob diese sehr kleinen Schritte aber praxisnah sind, wage ich etwas zu bezweifeln, da das mikroskopische Bild im Hochauflösungsbereich weniger detailreich ist. Am Konfokalmikroskop werden ja durchaus auch mit 63er oder 100er Linsen und hohen Aperturen Bildstapel erstellt um räumliche Information zu gewinnen. Eine derart feine Z-Bewegung, möglichst auch noch reproduzierbar, bringt keinerlei Informationsgewinn mehr. Zumindest solange wir uns im Rahmen üblicher optischer Abbildung bewegen und Sondertechniken wie STORM , SIM oder ähnliche Verfahren mal aussen vor lassen. In der normalen Lichtmikroskopie beträgt die laterale Auflösung unter günstigen Umständen 200nm (wenn man nicht gerade mit UV-Licht beleuchtet :-)), die Auflösung in Z-Richtung ist normalerweise (!, auch da gibt es inzwischen Rechenwege zur Verringerung) um den Faktor 2,5 geringer. Folglich sollten Schrittweiten wesentlich unter ca. 400nm kaum eine echte Verbesserung ergeben.
Allerdings denke ich auch, dass Temperaturschwankungen im Arbeitsraum tunlichst zu vermeiden sind.
Freundliche Grüße
Wolfgang
Lieber Peter, lieber Wolfgang,
"Jetzt die Frage an alle Feinmechaniker: Können solche Schrittweiten ( nicht theoretisch ! ) sondern in der Praxis mit einem Mikroskoptisch realisiert werden ? Ist die Mechanik dafür ausgelegt?"
-> Nein. Dafür sind Mikroskoptische nicht gebaut.
"Oder werden nun Piezoelemente benötigt und nicht der Tisch, sondern das Objektiv verstellt?"
-> Ja. Das wird mit Piezoelementen bewerkstelligt. Es gibt beide Varianten, Tisch- und Objektivverstellung, mit eigenen Vor- und Nachteilen. Firmen wie Physik Instrumente oder Prior liefern z-Tische mit 1 nm geregelter Auflösung.
"Müssen solche Aufnahmen dann in einem klimatisierten Raum stattfinden?"
-> Nicht unbedingt. Entscheidend ist eine exakte Positionsbestimmung, über die mittels closed-loop-Regelung die Position nachgeregelt wird.
Die erforderliche Schrittweite liegt bei weitem nicht bei 50 nm; Zeiss gibt dazu folgende Information:
"Der mindestens erforderliche Ebenenabstand ergibt sich aus axialen Auflösung d des Objektivs, die umgekehrt proportional zum Quadrat der numerischen Apertur nA ist:
d_axial=2 η*λ/(nA^2 )
wobei η Brechungsindex des Einschlußmediums und λ die Wellenlänge ist.
Beispiel: 540 nm Wellenlänge, Objektiv-nA 1,3, Brechungsindex 1,52: = 970 nm.
Der optimale Z-Abstand ergibt sich nach der Nyquist-Theorie bei einer zweifachen Überabtastung zu ca. 485 nm."
Aber dazu mögen sich die Optiker mal äußern.
@ Wolfgang:
Man kann sich so einen Tisch selbst bauen, sehr einfach mit einer Höhenverstellung aus Lautsprechern, also nach dem moving-coil-Prinzip. Habe ich mehrfach hier vorgestellt. Eine ausführliche Beschreibung gibt's auf der MKB-Seite, unter "Bibliothek", "Mikroskopische Technik". Entscheidend ist die genaue Positionsbestimmung, die mit einem Differentialkondensator kapazitiv und damit berührungsfrei erfolgt, und so eine closed-loop-Lagerregelung in definierten Schrittweiten ermöglicht. Mit einem angebauten Michelson-Interferometer kann man dann absolute Höhendifferenzen messen. Die 0,67 µm Distanz, die René angibt, glaube ich nicht unbesehen. Die sind vermutlich aus der Feintriebteilung abgeschätzt, und dazu schreibt wiederum Zeiss: "Die Einstellung am Grobtriebknopf ermöglicht eine orientierende Messung der Objektdicke, ... jedoch nicht reproduzierbar (Schlupf)".
Eigentlich braucht man nicht so pingelig sein, es zählt das Ergebnis, wie René gezeigt hat. Ich fand's nur reizvoll, so eine Einrichtung zu bauen. Preis gekaufter Tisch fünfstellig, Eigenbau: Schrottplatz-Teile, ein defekter DVD-Brenner und 200 Eur für die Kapazitätsmessung. Und vollautomatisierbar incl. Fotoauslösung. Sieht so aus (links mit dem runden Loch das Interferometer):
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/152254_20729886.jpg) (http://s767.photobucket.com/user/vonGneisenau/media/zTischAufsicht_2_zpsd3268527.jpg.html)
Viele Grüße aus Bonn
Horst
Korrektur: 970 nm natürlich, nicht 0,970 nm (ist oben schon geändert, vielen Dank an Peter).
Hallo Stuessi
Die verwendete Kamera ist eine Nikon D7100, CMOS-Sensor 23.5x15.6mm, 6000x4000 Pixel.
Kurt
Hallo Wolfgang,
Zitat von: l'œil armé in Juni 16, 2014, 15:18:16 NACHMITTAGS
...Wenn der Tisch (oder die Optik, je nachdem ob aufrechtes oder inverses Mikroskop) gegen die Schwerkraft, also von unten nach oben um ruckelndes Nachrutschen zu vermeiden, langsam und gleichmäßig auf der optischen Achse bewegt wird, ist die Feinheit der Einzelaufnahmen doch nur durch ihren zeitlichen Abstand limitiert...
...
...Kurt hat Vergleichbares doch mit seiner "Büchse der Pandora" schon demonstriert...
das ist nicht direkt vergleichbar, weil die "Büchse" einem Direktantrieb gleichkommt, während der Fein-/Grobtrieb mit dem Tisch über ein Getriebe verbunden ist. Ein Getriebe erzeugt aufgrund seiner Bauart und der Fertigungstoleranz Nichtlinearitäten, die eine perfekt gleichförmige Drehbewegung am Fein-/Grobtrieb in eine
nicht gleichförmige Linearbewegung in Z-Richtung umsetzt, d.h. dass exakt gleiche Zeitabstände eben
nicht gleichen Z-Wegschritten entsprechen. Eine Steuerung (man "glaubt", dass sich der Tisch so bewegt wie man am Knopf dreht) ist nicht ausreichend. Die Tischbewegung muss geregelt sein, indem sie mit geeigneten Mitteln gemessen und gegebenenfalls korrigiert wird (closed-loop). Nur dann "weiss" man, was der Tisch macht.
Zitat von: l'œil armé in Juni 16, 2014, 15:18:16 NACHMITTAGS
...Allerdings denke ich auch, dass Temperaturschwankungen im Arbeitsraum tunlichst zu vermeiden sind...
Das stimmt schon, ich würde aber die mechanischen Schwingungen an die erste Stelle setzen, da sich Temperaturschwankungen langsamer und kontinuierlich auswirken.
Viele Grüße, Jürgen
Zitat von: Kurt Wirz in Juni 15, 2014, 23:54:43 NACHMITTAGS
Anbei die Stackschritte in Millimeter in Abhängigkeit der Apertur, bei gleichbleibender Bildqualität und optimalster Auflösung.
Apertur / Stackschritt in mm
0.09 / 0.036
0.11 / 0.021
0.13 / 0.014
0.15 / 0.0098
0.2 / 0.0046
0.25 / 0.0025
0.3 / 0.0015
0.4 / 0.00069
0.5 / 0.00037
0.7 / 0.00014
0.8 / 0.000095
Kurt
Hallo Kurt,
danke für die Infos, das ist für mich ganz hilfreich um einen Anhaltspunkt zu haben wie ich ein gutes Bild hin bekomme.
Beim 10er wäre das ziemlich genau ein Bild je Teilstrich auf dem Feintrieb, mit dem 20er wäre es auch noch mit dem Feintrieb machbar.
Beim 40er muss ich dann also deutliche Abstriche bei der Bildqualität in kauf nehmen, das ist doch schonmal gut zu wissen.
Gruß
Tobias
Zitat von: JüSchTü in Juni 19, 2014, 02:29:45 VORMITTAG
das ist nicht direkt vergleichbar, ...
Vielen Dank, Jürgen, für die Erklärung.
Was die Temperaturschwankungen anbetrifft, so kann ich Dir allerdings aus eigener, häufiger und leidiger Erfahrung sagen, das diese sich durchaus kurzfristig auswirken können: In früheren Jahren - heute sind diese Geräte wohl meist ausrangiert - wurden Ultradünn-Schnitte für die Elektronenmikroskopie mit Mikrotomen ausgeführt, die eben der kleinen Schritte wegen (minimal 20-30nm Schnittstärke) mit einem thermischen Vorschub ausgestattet waren, d.h. man erreichte die gewünschte Schnittstärke über die Abstimmung von Heiztemperatur und Schnitt-Geschwindigkeit. Wenn Du gerade die schönsten Serienschnitte - dunkelgrau, Shatter- und Faltenfrei und gleichmäßig in der Serie, wie sich das gehört (das war nicht einfach mit diesen Geräten!)- und jemand machte die Tür zum kalten Flur auf oder so: schwupp, war Dein Präparat weg und Deine Serie am Ende. Der Vorschub hatte das Blöckchen ein paar Nanometer zurückgezogen. Er kam dann auch gleich wieder vor, aber nie an die gleiche Position wie zuvor. >:(
Freundliche Grüße
Wolfgang
Zitat von: Horst Wörmann in Juni 16, 2014, 16:41:48 NACHMITTAGS
@ Wolfgang:
Man kann sich so einen Tisch selbst bauen, ....
Vielen Dank Horst!
Eine eindrückliche "Bastelarbeit". Ja, mir sind die VoiceCoil Tisch- und Objektiv-Mechanismen von PI durchaus bekannt. Ein bisschen was davon haben wir hier im Labor in der Anwendung. Es führen ja bekanntlich immer mehrere Wege nach Rom. Nur dachte ich, dass eine Lösung in Form eines mittels z.B. eines kleinen 2-4V Glühbirnchen vorsichtig angewärmten POM-Blocks o.ä., der auf einem (Metall-)Objektträger klebt, etwas einfacher zu realisieren sei. Dass so etwas nicht den gleichen Ansprüchen genügt wie die von Dir gezeigte Lösung, steht wohl ausser Frage.
Freundliche Grüße
Wolfgang
Zitat von: Safari in Juni 20, 2014, 16:53:04 NACHMITTAGS
Zitat von: l'œil armé in Juni 20, 2014, 14:28:00 NACHMITTAGS
... und jemand machte die Tür zum kalten Flur auf oder so: schwupp, war Dein Präparat weg und Deine Serie am Ende.
Wenn die Masse von dem Vorschubteil groß genug ist, dürfte das öffnen einer Tür keine besondere Auswirkung haben.
Soweit die Theorie :) 4 Jahre Praxis lehrten jedoch etwas Anderes
Lieber Wolfgang,
das mit dem Erwärmen eines POM-Blockes ist schon eine gute Idee und funktioniert beim Auflicht gut, wie ja schon eindrucksvoll gezeigt wurde. Mein Problem war aber die korrekte Köhlerbeleuchtung, die bei hoher Vergrößerung - nur dafür ist meine Einrichtung gedacht - unerläßlich ist und bedingt, daß der Kondensor nahe am Objektträger ist. Vielleicht gibt's auch beim POM-Block eine Lösung dafür?
Tobias braucht meiner Meinung nach keine Sorgen wegen der Bildqualität beim 40er zu haben. Die von Kurt angebenen Ebenenabstände sind zu gering. Unsere Profis hier arbeiten mit minmal 300 nm. Zeigt ja auch die Rechnung.
Viele Grüße
Horst
Hallo Horst
Zitat von: Horst Wörmann in Juni 20, 2014, 21:34:49 NACHMITTAGS
Tobias braucht meiner Meinung nach keine Sorgen wegen der Bildqualität beim 40er zu haben. Die von Kurt angebenen Ebenenabstände sind zu gering. Unsere Profis hier arbeiten mit minmal 300 nm. Zeigt ja auch die Rechnung.
Verstehe ich da etwas falsch?
Mein 40er ist ein NIKON M Plan, 40/0.5 ELWD, 210/0 und für die Apertur von 0.5 zeigt meine Liste 370nm.
Du meinst somit, dass meine Abstände nicht zu gering, sondern zu gross sind??
Kurt
Hallo Kurt,
bitte um Entschuldigung: ich bin von meinem Plan-Neofluar 40x/0,75 ausgegangen. Bei 0,75 Apertur komme ich nach Deiner Liste auf einen Ebenenabstand zwischen 140 und 95 nm, und das halte ich für zu gering. Nach der Formel ist die axiale Auflösung für nA 0,75, Brechungsindex 1,52 und 540 nm Wellenlänge rund 3000 nm. Bei fünffacher Überabtastung komme ich dann immer noch auf ca. 600 nm Ebenenabstand und damit weit über die 140...95 nm aus Deiner Liste.
Viele Grüße
Horst
Hallo Horst
Keine Entschuldigung nötig, alles o.k.
Ich habe meine Überlegungen hier zur Diskussion gestellt und erwarte somit Fragen und ebenfalls Richtigstellungen, samt Kritik.
Bei 1:1 sind innerhalb der Tiefenschärfe (bei gleicher resultierenden Bildqualität) nicht so viele Bilder nötig wie bei 100:1.
Nach meiner Erfahrung spielt dabei der Abbildungsmassstab nicht die entscheidende Rolle, sondern die Blende/Apertur.
Ich habe versucht, dies in einer Annäherung, in eine Formel zu verpacken. Hier soll sich nun zeigen, ob diese Formel für die Füchse ist, oder ein dienlicher Hinweis.
Meine beschriebene Beobachtung bezieht sich auf einen CMOS-Bayer-Sensor mit einem Pixelpitch von 0.004mm.
Kurt
Hallo Kurt,
Deine Kurve beruht auf kritischer Beobachtung und ist deshalb sicher bei geringen Vergrößerungen bestens geeignet. Bei hohen Aperturen spielt aber die Auflösungsgrenze bedingt durch die Wellenoptik eine zunehmend größere Rolle. Wollte damit nur sagen, daß die Kurve zu den hohen Aperturen nicht extrapolierbar ist. Peters Grafik führt da in die Irre. Ist wohl doch alles nicht so einfach...
Viele Grüße aus Bonn
Horst
Hallo Horst
Weil es nicht so einfach ist, habe ich dieses Thema eröffnet.
Die Beobachtung hat gezeigt (sofern man die Tiefenschärfe mit λ/(Na x NA)) dass die Anzahl der nötigen Schritte innerhalb der Tiefenschärfe mit steigender Apertur, steigt.
Weshalb dies so ist, kann ich nur vermuten. So vermute ich, dass die Kurve betreffend Auflösung zu freiem Arbeitsabstand (FWD), im Bereich der Tiefenschärfe, von niedriger zu höherer Apertur, sich von platykurtic zu leptokurtic verändert?
Ich frage, ob dies abwegig ist, oder zutreffen könnte, ebenfalls frage ich, ob jemand eine klare Antwort kennt und diese hier kund tut.
Vielen Dank
Kurt
Eine rein theoretische Betrachtung !
Was sicher nur sehr schwer in Bilder festzuhalten ist, kann man versuchen in theoretischen Überlegungen oder besser Rechnungen nachzuweisen. Dazu habe ich versucht aus Konstruktionsdaten eines einfachen Mikroobjektivs (Achromat) über Spotdiagramme die Größe des Einflusses in Z-Richtung zu berechnen.
Objektiv
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/152512_37969248.jpg)
In Z-Richtung liegt die Schrittweite bei 1µm. Das Airyscheibchen hat hier einen Durchmesser von ~2µm.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/152512_62684903.jpg)
In der Bildmitte sind diese Schrittweiten sicher noch erkennbar, für einen Punkt 8mm von der Mitte im Zwischenbild entfernt, ist eine Änderung nur noch bedingt erkennbar.
Sicher gibt es bessere Objektive welche dann eine Änderung auch leichter erkennen lassen, aber diese Objektive haben fast immer auch eine höhere Apertur und damit wieder ein anderes Verhalten.
Nun wäre eine Gegenüberstellung aus der Praxis schön. ;D
Viel Freude bei der Betrachtung
Peter
Hallo liebe stacker
hier noch als Ergänzung meine Messungen, die ich nun wiederholt habe.
Jürgen hat die Situation in der Praxis schon erwähnt die ich hiermit bestätige.
Ich habe am Axioskop und auch am Orthoplan gemessen hier als Beispiel
am Axio, beim Orthoplan etwa das selbe Resultat.
Jeweils 1/1000mm verstellt und Messweg an der Messuhr abgelesen. (gerundet)
Stackschritt in 1/1000mm
Verstellweg/Messweg
1 / 0.5
1 / 0.5
1 / 0.5
1 / 4.5
1 / 0.5
1 / 0.5
1 / 0.5
1 / 0.5
1 / 5.0
1 / 1.5
1 / 0.5
1 / 1.0
Die Präzision im denken stimmt leider nicht mit der Realität überein,
es ergeben sich riesige sprünge in der Mechanik. (bis 4.5/1000mm)
Aber es gibt ja inzwischen gute Ideen wie man das umgehen kann. :)
Viele Grüsse
Martin
Hallo Martin,
Jumps of 4.5 um wouldn't be acceptible at all for my work... No dounbt your measurements are correct, but a well maintained Olympus inverted (from the 1980's) seems to work better in that respect.
Are you going in one direction only?
Best wishes, René
Guten Tag,
mit dem Axioscop/Axioplan u.ä. Modellen wundert mich eine mangelhafte Genauigkeit nicht, wegen des Kugelumlauf-Getriebes. Zeiss selbst ging zur Zeit dieser Modelle bei den Konfokalmikroskopen direkt an die Feintriebwelle. Dritthersteller wie zum Beispiel BioRad, die von außen über einen an den Mikrometertrieb angesetzten Schrittmotor die Z-Achse steuerten, hatten mit den gleichen Problemen, vor Allem mit mangelhafter Reproduzierbarkeit der Stackschritte zu kämpfen. Heute ist dort ein Schrittmotor eingebaut, der zwar sehr genau ist, aber andere Probleme aufwirft. Allerdings haben diese nichts mit dem Stacken zu tun.
Wenn hingegen ein Orthoplan mit seinem Trieb derartige Ungenauigkeiten produziert, dann stimmt meiner Meinung nach etwas nicht. Ist bei der Messung gegen die Schwerkraft gearbeitet worden? Wenn nicht, dann könnte hier schon der Hund begraben liegen.
Liebe Grüße
Wolfgang
Hallo Wolfgang
Das Orthoplan hat ja bekanntlich einer der besten Triebe die gebaut wurden.
Meiner ist Top in Form, aber für diese feinen Schritte reichst doch nich, es würde mich
wundern wenn das ein konventionelles Mikroskop bewältigt.
Messen kann ich, die Messuhr drückt noch mit sehr leichtem Federdruck auf den Tisch!
Ev. Könnte man den Druck noch erhöhen und so den Prozess etwas optimieren.
Oder ein System mit Rückkoppelung des Messwegs, analog oder besser digital.
Liebe Grüsse
Martin
Hallo,
hier einzelne Bilder bei einer Abstandsänderung von jeweils ca. 0,1 µm.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/152598_39442956.jpg) (http://s618.photobucket.com/user/Stuessi/media/Mikroskopieren%20ab%2020100701/StacktiefeKopie_zpsc737aae7.jpg.html)
Gruß,
Stuessi
Hallo Martin
1 µm kann man den Tisch bei einem guten Mikroskop AUFWÄRTS bewegen,
beim Hinunterschrauben, bewegt er sich nicht bei jeder Verstellung (Friktion).
Mein lieber Stuessi
Für mich sprichst du mit deinen Bildern in Hieroglyphen.
Ich bitte um Erläuterung für Dummis!
Vielen Dank
Kurt
ZitatMeiner ist Top in Form, aber für diese feinen Schritte reichst doch nich, es würde mich
wundern wenn das ein konventionelles Mikroskop bewältigt.
Hallo Martin,
das würde mich auch wundern. Ebenfalls auch, wenn sich die Industrie nicht des Problems annähme. Vor ...zig Jahren wurde von Drehern die Feinverstellung des Supportes (Passmaße) in Y-Richtung über die Verstellung der angewinkelten X-Richtung vorgenommen. Vermutlich wird dieses Prinzip irgendwann wieder aufgegriffen.
Gruß - EFH
Zitat von: peter-h in Juni 23, 2014, 15:44:12 NACHMITTAGS...Nun wäre eine Gegenüberstellung aus der Praxis schön. ;D ...
Hallo Peter,
Dein für die Theorie gewähltes Objektiv habe ich nicht, mit einem anderen versuche ich aber eine Gegenüberstellung.
Im folgenden Beispiel wurde der Abstand zwischen Loch-Präparat und Objektiv bei meiner gewählten Kombination
NPL FLUOTAR 50x/0,85 + NEX-5N
von Aufnahme zu Aufnahme um Delta z = 0,5 µm verringert.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/152609_13511520.jpg) (http://s618.photobucket.com/user/Stuessi/media/Mikroskopieren%20ab%2020100701/deltaz0_5mikrometerKopie_zpsfd3e9d90.jpg.html)
Bei einem Stack würde diese Schrittweite 0,5 µm sicher ausreichen.
Gruß,
Stuessi
Lieber Stuessi,
da möchte ich mich dem Kurt anschließen: "Für mich sprichst du mit deinen Bildern in Hieroglyphen.
Ich bitte um Erläuterung für Dummis!" und frage: Wat lernt uns dat?
Ich verstehe die Diskussion inzwischen nicht mehr ganz. Zur lateralen und axialen Auflösung und damit zur Ermittlung des Ebenenabstands bei hohen Aperturen gibt's doch dicke Bücher mit langen Abhandlungen, z.B. Kubitscheck, Fluorescence Microscopy, S. 54 - 61 und S. 182 - 189 für Konfokal. Das ist doch alles längst geklärt oder täusche ich mich da?
Viele Grüße
Horst
Hallo
Meine Bilder dienen der Freude an der Natur, deren Farben und Formen. Eine reproduzierbare Genauigkeit ist deshalb nur bedingt gefordert.
Ein Dialog mit Fachleuten wie in diesem Beitrag ist für mich jedoch wertvoll, da interessant und dienlich auf meinem Weg zu schönen Bildern.
Oft konzentriert man sich auf einen Faktor und lässt weitere etwas zu sehr unbeachtet.
Hier nun die Essenz meiner Versuche, dutzende von Stacks, tausende von Bilder.
Die am Anfang genannte Formel hat ihre Richtigkeit, wenn der Aufbau nicht genügend stabil ist, da tragen viele Bilder innerhalb der Tiefenschärfe zur Klarheit der Bilder bei. Mit einem stabilen Mikroskop hat man weniger Erschütterungen, wie mit meinem Aufbau.
Inzwischen habe ich die Blitzabbrennzeit auf ein 1/24000 Sekunde reduziert, indem ich einen Diffusor wählte der lichtdurchlässiger ist und somit mit den drei Blitzgeräten mit einem 1/128stel der maximalen Leistung geblitzt werden konnte.
Weiters hebt die Kamera ihren Spiegel 2 Sekunden vor dem Blitz an und es wird im leicht abgedunkelten Raum, mit der Kamera 1 Sekunde belichtet.
So dass weder durch Spiegelschlag noch durch Öffnen des Verschlusses Erschütterungen das Bild beeinflussen. Da sich diese Erschütterungen bei starker Vergrösserung stärker zeigen, waren deshalb, nach meiner anfangs erwähnten Formel bei starker Vergrösserung mehr Bilder innerhalb der Tiefenschärfe nötig, wie bei weniger starken Vergrösserung.
Mein Problem wurde deshalb durch die verwendete Spiegelreflexkamera DSLR und den Aufbau mit einem Reprostativ hervorgerufen.
Jetzt wo alles stabil ist, reichen für eine optimalste Auflösung und somit klarste Bilder, zwei Bilder innerhalb der Tiefenschärfe, wenn sie mit λ/(NA x NA) berechnet wird.
Dies bei einem Abbildungsmassstab von 1:1 bis 100:1.
Die Tabelle lautet nun, Stackschritte in Millimeter in Abhängigkeit der Apertur, bei gleichbleibender Bildqualität und optimalster Auflösung.
Apertur / Stackschritt in mm
0.1 / 0.028
0.15 / 0.012
0.2 / 0.0069
0.25 / 0.0044
0.3 / 0.0031
0.4 / 0.0017
0.5 / 0.0011
0.6 / 0.00076
0.7 / 0.00056
0.8 / 0.00043
Stackschritte von 0.0005mm lassen sich mit dem Stackshot realisieren, wenn das leichte Objekt, von unten nach oben und nicht die schwere Kamera mit Objektiv bewegt wird.
Somit reicht der Stackshot für eine Apertur von 0.7 und sogar knapp für 0.8.
Die Bemerkung von Wolfgang:
,,Folglich sollten Schrittweiten wesentlich unter ca. 400nm kaum eine echte Verbesserung ergeben."
Und auch weitere Angaben in Berichten, die vom Mikro-Forum aus erreichbar sind, beschreiben schon längst, was ich nun auch am eigenen "Leib" fest stellen konnte.
Ich danke für das geduldige Füttern mit Informationen und Ideen.
Kurt
Hallo
Zum Dank, das folgende Bild von Schmetterling Flügelschuppen. Die Bildbreite beträgt 0.38mm.
Nikon D7100 mit NIKON M Plan, 60/0.7 ELWD, 210/0.
Mit dem StackShot wurden 187 Schritte von 0.000496mm (1 Step) ausgeführt.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/155069_36406500.jpg)
Der Gebrauch "Der Büchse der Pandora" und der damit verbundene Umbau, erübrigt sich somit für mich.
Kurt