Hallo Forum,
in meinem Vanox Prospekt wird von "multi-mode observation possible by mounting phase-contrast and DIC units to the reflected light fluorescence attachment"
Versteh ich das richtig, es soll DIC mit Fluoreszenz oder Phasenkontrast mit Fluoreszenz in Kombination anwendbar sein?
Wenn ja, gibt es hierzu eine Anwendung und evtl. sogar Beispielbilder?
Ein spezielles Objektiv welches für die Fluoreszenz ist und einen Phasenring hat, hätte ich sogar.
lg
anne
Hallo Anne,
Gemeint ist weniger die gleichzeitige Beobachtung (ist aber auch moeglich, wenn die Fluoreszenz ausreichend hell ist), sondern die konsekutive Beobachtung, also Objekt im Phasenkontrast finden (verhindert das Ausbleichen), dann schnelles Umschalten auf Fluoreszenz.
Nacheinander gemachte Aufnahmen koennen dann nachtraeglich ueberblendet werden. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/fluorophase.html
Bei Fluoreszenz und DIK sollte man aufpassen, dass kein UV verwendet wird, da dies die Pol-Filter schaedigt.
Beste Gruesse, Jon
Hallo Jon,
es wird speziell im Zusammenhang mit einer starken Beleuchtung (200W) darauf hingewiesen und von "simultaneous observation" gesprochen.
Die DIC Prismen werden hier direkt im Fluoreszenz Kondensor eingebracht aber auch am Durchlicht Kondensor.
Der Tip mit dem UV Licht und den Prismen ist auf jeden Fall hilfreich um sich nicht die Prismen zu beschädigen.
lg
anne
Hi Jon,
Combining fluorescence and brightfield (or phasecontrast) is no problem, simply adjust lighting to such a low level that it is in balance with the fluorescence signal. A near UV filter cube for epifluorescence is ideal as it does not visibly change the spectrum of the transmitted (brightfield) lighting.
I used to make cryosections of tobacco leafs with DAPI (DNA stain), combined with DIC. It worked well on an Axiophot. However, on my Olympus IMT-2 it does not work due to fact that the polarizer blocks UV light. It is combined with the DIC prism and is in the lightpath of the excitation light. I'm not sure how it is arranged on a Vanox. But I'm sure you will find out quickly enough.
Good luck, René
Hallo Anne -
Zeiss(W) hat schon vor ca. 50 Jahren einen speziellen Phasenkondensor geliefert, bei dem die Phasenblenden (1, 2 3) im Kondensor aus Polfolie bestanden. Beleuchtet hat man durch einen drehbaren Polarisator, sodass man durch Verdrehen des Polarisators das Durchlicht durch den Ring variabel bis auf fast Null abschwächen konnte, um es an die vergleichsweise schwache Auflichtfluoreszenz anzupassen. Ist also gar nicht so neu.
Die Phasenringe im Objektiv stören eigentlich die Auflichtfluoreszenz kaum, man hat dafür ganz gewöhnliches Phasenobjektive, vorzugsweise Neofluare, genommen.
Viele Grüße
Rolf
Zitat von: Rene in Januar 29, 2015, 17:54:42 NACHMITTAGS
Combining fluorescence and brightfield (or phasecontrast) is no problem, simply adjust lighting to such a low level that it is in balance with the fluorescence signal. A near UV filter cube for epifluorescence is ideal as it does not visibly change the spectrum of the transmitted (brightfield) lighting.
Hi Rene,
You're right; that's possible when the fluorescence is quite bright, as with DAPI. When the fluorescence is dimmer, as it is the case with most immunodetections, and when UV is to be avoided, as with all living material, it's much easier to optimise fluorescence and phase contrast image separately and then do a digital composite.
Jon
Liebe Anne,
einen ähnlichen Kondensor gab es auch von Leitz. Den 402aa. Dieser war identisch mit dem 402a, jedoch zusätzlich mit Filtern bestückt:
1: Ph I
2: Ph II, UV
3: Ph II, blau
4: Ph III, UV
5: Ph III, blau
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/164945_15584387.jpg)
Allerdings alles für die Durchlichtbeleuchtung anglegt.
Für AL-Fluoreszenz/Phaco gab es Phaco-Öl-Objektive bis runter zum 10er, um die Lichtausbeute mittels hoher Apertur möglichst groß zu halten.
Und für hohe Beleuchtungsstärken gab es Prismenpoalrisatoren, damit keine Folie verbrennt.
Links: Folie, rechts: Prisma und in der Mitte ein Schmankerl für sehr hohe Beleuchtungsstärken: ein Prisma mit seitlichem Austritt des außerodentlichen Strahls, damit dieser das Prisma nicht zusätzlich erwärmt.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/164945_34980106.jpg)
Oder hier ein DIK-Kondensor mit Prisma:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/164945_24898218.jpg)
Das alles schon in den späten 60er/frühen 70er Jahren zu haben.
Wofür? Dafür bin ich zu wenig Anwender. Aber ein Beispiel wurde ja schon genannt.
Viele Grüße
Wolfgang
Hallo Rolf und Wolfgang,
vielen Dank für die ausführlichen Antworten.
Inzwischen habe ich gesehen, dass die vorhandenen DIC Prismen wohl auch speziel für den UV Bereich sind.
Das PH-Objektiv, ist wie Wolfgang schon sagt sehr hochaperturig, DPlan 40 UV PL 1,4 Öl.
Das Vanox ist ja nun aber auch schon ein recht gediegenes Gerät.
Können den die neuen Zeiss Mikroskope auch solche Kombinationen?
Oder ist das eher eine ältere Methode von der man inzwischen aufgrund neuer Technologien abgekommen ist?
Falls irgend jemand ein Bild hat oder findet von DIC kombiniert mit Fluoreszenz, wäre ich sehr neugierig darauf.
lg
anne
Liebe Anne,
Holger hat hierüber einst berichtet.
http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=4451.0
Viele Grüße
Wolfgang
Lieber Wolfgang,
super, genau so was wollte ich sehen.
Vielen Dank!
lg
anne
Hallo Anne,
zur weiteren Information noch einige Beispiele aus der Wild Leitz Broschüre " Fluoreszenzmikroskopie " von E. Becker (1989).
Vielleicht kannst du mit dem Vanox verschiedenes davon ausprobieren. Ich habe früher interessante Ergebnisse mit folgender
Gerätekombination erzielt: Mikroskop Leitz Orthoplan, Fluoreszenz-Auflichtilluminator PLOEMOPAK 2, Durchlicht Lampenhaus
100 Z mit Halogen-Glühlampe 12 V 100 W, Auflicht Lampenhaus 500 mit Xenon-Hochdrucklampe 150 W, Kombination der
Beleuchtungen mit Spiegelhaus 500 S.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/165014_38848369.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/165014_49279278.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/165014_7184510.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/165014_26129482.jpg)
Liebe Grüße
Jürgen aus Hemer
Hallo lieber Jürgen,
vielen Dank für diesen Einblick, nun kann ich mir auch mehr darunter vorstellen, wofür diese Kombinationen sinnvoll sein könnten.
lg
anne
Zitat von: anne in Januar 29, 2015, 18:59:15 NACHMITTAGS(...)Inzwischen habe ich gesehen, dass die vorhandenen DIC Prismen wohl auch speziel für den UV Bereich sind.
Das PH-Objektiv, ist wie Wolfgang schon sagt sehr hochaperturig, DPlan 40 UV PL 1,4 Öl.
Das Vanox ist ja nun aber auch schon ein recht gediegenes Gerät.
Können den die neuen Zeiss Mikroskope auch solche Kombinationen?
Oder ist das eher eine ältere Methode von der man inzwischen aufgrund neuer Technologien abgekommen ist?
Hallo Anne,
ich bin zwar überhaupt nicht "vom Fach" (das sind die Lebenswissenschaftler und Mediziner hier), aber ich habe ein Mikroskop, das ähnlich ausgerüstet ist: das Nikon Microphot FX. Auch dafür gab es eine Einrichtung für die Kombination aus Auflicht-Fluoreszenz und DIK, bzw. Phako und diese extrem hochaperturigen Objektive mit hoher Transmission im kurzwelligen Bereich bis ins UV (Fluor 40/1.4 Oil). Obwohl dieses Objektiv nicht besonders gut geebnet ist, lässt es sich mit dem im Fluorezenskondensor eingebauten DIK-Schieber zusammen verwenden. Andere Objektive haben außerdem noch einen Phasenring und ermöglichen damit einen Wechsel zwischen Phako und Fluoreszenz.
Holger hat in seinem von Wolfgang verlinkten Beitrag sehr schön gezeigt, wie sich Phasenkontrast und Fluoreszenz auch
in einem Bild kombinieren lassen. Das finde ich zwar wirklich faszinierend, aber ob nun die Kombination der Methoden dem Ästhetischen dient, wage ich mal zu bestreiten (nicht gegen Holgers tolle Bilder). Ich glaube, es ist, wie Jon beschrieben hat, vor allem
ein Werkzeug, das es erlaubt, ohne Objektiv oder sonst etwas ändern zu müssen, von einem Kontrastverfahren zum anderen zu
wechseln (und dabei sowohl zu verhindern, das das Objektfeld ausbleicht, als auch, dass man es einfach nicht wiederfindet).
Viele Grüße
Thomas
Hallo Thomas,
vielen Dank für Deine Erläuterungen!
Für mich ist es wohl in erster Linie eine Erweiterung der Spielwiese, die Anwendung als Kombination macht wohl nur, und wenn überhaupt, in der Histologie Sinn.
(und davon habe ich keinen blassen Schimmer...)
lg
anne
Hallo Anne -
beim Tümpeln kann man damit Chloroplasten rot untermalen. Bringt zwar keine Zusatzinformation weil sie eh gefärbt sind, ist aber lustig.
Viele Grüße
Rolf
Hallo zusammen.
Das Thema hat einen gewissen Reiz, also frisch an die Arbeit. Alle Kombinationen kann ich nicht ausführen, aber am Olympus BH-2 geht doch etwas. Das Objekt ist ein 4µm Schitt durch eine Leber vom Igel (Präp. Robin Wacker). Objektiv Neofluar 40/0,75 Ph2. Als Phasenkondensor ein Leitz-Heine, für die Auflichtfluoreszenz ein angepaßter Zeissknochen mit Filter BP450-490 FT510 LP520 , blaue LED zur Anregung.
1.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/165048_22943289.jpg)
Hellfeld , weiße LED
2.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/165048_1150788.jpg)
Phasenkontrast , weiße LED
3.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/165048_47182344.jpg)
Auflichtfluoreszenz , Blauanregung
4.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/165048_55427933.jpg)
Keine Bildaddition ! Auflichtfluoreszenz + DL-Phasenkontrast LED mit Rotfilter zur besseren Trennung der Information.
Sicher nicht das geeignete Objekt, aber einen Versuch war es wert.
Viel Spass
Peter
Hallo Peter,
super, ja das macht Freude!!
lg
anne
Hallo Anne
Bei Olympus finde ich die Kombination mit dem Öl-Dunkelfeldkondensor interessant ==> dort kann man gut den Kontrast zwischen dem UV-angeregten Bildteil und dem ohne Dunkelfeld-Aufhellung tiefschwarzen Bereich steuern. Ich habe das bisher eingesetzt um die Basis für gute Schwarzweiß-Umwandlung zu haben ...
Liebe Grüße
Gerhard
Hallo Anne,
der spezielle, bereits angesprochene Leitz Phasenkontrast-Fluoreszenzkondensor (beides im Durchlicht) ist sicher ein interessantes Gerät,
aber viel besser funktioniert die Kombination aus Durchlicht -Phasenkontrast (oder DIC) und AUFLICHT- Fluoreszenz,
dann kann man auch die jeweiligen Helligkeiten der beiden Bilder gut aufeinander anpassen.
Ein paar Beispielfotos am Leitz Orthoplan sollen das veranschaulichen.
Ich fand die Kombination aus Auflicht-Fuoreszenz und Durchlicht-DIC sehr spannend, habe aber die Beobachtungszeiten immer kurz gehalten, da
ich das Wollaston-Prisma im Objektiv (bzw. dessen Verkittung) nicht zu lange der hohen Intensität der Auflicht-Anregungsbestrahlung aussetzen wollte,
besonders, wenn es sich wie in meinem Beispiel unten um Auflicht-Anregung mit UV handelt, um die schöne Blaufluoreszenz der DNA mittels DAPI zu bekommen.
Herzliche Grüsse,
Holger
Infusor, gefüttert mit DAPI-markierten Hefezellen. Man sieht, dass sich durch Diffusion des DAPI auch der Kernapparat des Infusors markiert.
Lebendaufnahme. Auflicht Fluoreszenz, kombiniert mit Durchlicht-Phasenkontrast.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/165153_24150570.jpg) (http://s974.photobucket.com/user/hgadm/media/paramecium-fluo05b_zpslxglvkwv.jpg.html)
Maus-Fibrozytenkultur. Auflicht Fluoreszenz, kombiniert mit-Durchlicht Phasenkontrast.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/165153_50649309.jpg) (http://s974.photobucket.com/user/hgadm/media/mouse-fibrosarcoma-3-culture-Ph-Fluo01_zpskbv4fnev.jpg.html)
Maus-Fibrozytenkultur. Auflicht Fluoreszenz, kombiniert mit-Durchlicht DIC.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/165153_63355759.jpg) (http://s974.photobucket.com/user/hgadm/media/mouse-fibrosarcoma-culture-DIC-Fluo01_zpsw5zcrset.jpg.html)
Hallo Holger
Das ist absolut steil, super Beispiel, toll :-)
Liebe Gruesse
Gerhard