Hallo liebe Microforengemeinde,
da ich auf Formaldehyd allergisch reagiere, war ich seit einiger Zeit auf der Suche nach formalinfreien Fixierungen für Ciliaten.
Es gab vor einiger Zeit mal einen Forumsbeitrag in dem Glutaraldehyd empfohlen wurde. Leider ist das, zumindest in den benötigten Kleinmengen, schwer zu beschaffen. Auch die Durchführung ohne Loborausrüstung erschien mir schwierig. Deshalb habe ich vorab mit vielen mir zugänglichen Fixierungen ein klein wenig herumexperimentiert.
Von Hitze bis Kälte, Lugol bis Alkohol, alle Versuche zerstörten die äußere Form der Ciliaten und erwiesen sich als unzulänglich - bis ich aus lauter Verzweiflung zu einer frei und an jeder Ecke erhältlichen Haushalts-Chemikalie griff.
Ich habe einfach wahlos einen Ciliat (Größe ca. 100µ) auf ein Objekträger pipettiert, ein Tropfen Fixierung dazu, Deckglas und habe folgendes erhalten:
Objektiv 10x
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/167753_6646117.jpg)
Objektiv 40x, gestacked aus 18 Eizelaufnahmen
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/167753_31458267.jpg)
Die Bilder haben sicher nicht die hier übliche Qualität, da ich nur eine einfache Okularkamera verwendet habe und eigendlich auch nur Belegfotos machen wollte. Dennoch glaube ich, dass klar wird, dass die Fixierung - wider Erwarten - recht gut geklappt hat.
Die Fixierflüssigkeit besteht aus: Wasser, Propylenglykol, Glyzerin, 12mg/ml Nikotin und Aromen. Es handelt sich um Liqud für E-Zigaretten, das in jedem Tabakladen für ca. 4€ pro 10ml zu erhalten ist. Welcher Bestandteil für die Fixierung verantwortlich ist - Propylenglykol od. Nikotin - weis ich nicht.
Wie gut die Fixierung wirklich ist, kann ich mit meiner Ausrüstung nicht beurteilen. Für meine Zwecke ist sie sicherlich ausreichend. Vielleicht hat ja jemand Lust, mal bessere Vergleichsfotos ins Forum zu stellen?
Zumindest hat diese Fixierung einige unschlagbare Vorteile:
- völlig ungiftig (bis auf Nicotin)
- preiswert
- leicht erhältlich
- und - last but not least - wer kann schon bei seiner Fixierung zwischen verschiedenen Geschmacksrichtungen wählen. ;D
Viel Spass beim Ausprobieren,
Michael Müller
PS: Vor lauter Fixieren habe ich mich gar nicht groß um den Ciliat gekümmert; vielleicht hat ja jemand einen Tip zur Bestimmung?
Hallo Michael,
der Ciliat könnte Paramecium caudatum gewesen sein, zumindest wenn man die Form und Bewimperung betrachtet.Allerdings ein recht kleines Exemplar. Tipp: Hat man einen unbekannten Organismus im Wassertropfen, ist es von Vorteil, nicht sofort ein Deckglas aufzulegen, sondern zunächst bei niedriger Objektivvergrößerung dessen Bewegungen und Aussehen genau zu betrachten; notfalls ein Foto/Video davon machen, auch wenn's keinen Schonheitspreis dafür gibt. Denn nach Auflegen des Deckglases (besonders wenn die Dicke der Waserschicht gering ist) verändert sich die Gestalt oft rasch, Paramecium caudatum z.B. nimmt dann rundlichere Formen an und schwimmt auch nicht mehr in torkelnden Schraubenlinien Wenn Dein fixierter Ciliat so nahe an die lebende "Version" heranreicht, sieht das doch recht gelungen aus!
Schöne Mikrogrüße
Heinrich
Hallo Heinrich,
vielen Dank für deine schnelle Antwort.
Es ist immer schwer, Artbestimmungen aufgrund von schlechten Fotos und noch dazu bei fixiertem Material zu versuchen. Auf den Bildern ist leider nicht zu erkennen, dass das Tier ein adorales Membranellenband hat, dass auf der Bauchseite zum Zellmund führt. Direkt am Mikroskop ist das recht eindeutig. Außerdem habe ich am Stemi das Tier längere Zeit beobachtet. Es is platt wie eine Flunder, gleitet am Boden entlang und strudelt sich die Nahrung in den Mund. Ich würde das Tier eher in die Ordnung Stichotrichia verordnen. Wenn ich mehr güne Flecken im Tier erkennen würde, würde ich eher auf Paraurostyla viridis tippen. Ich halte die wenigen grünen Flecken (die auf dem miesen Foto nicht zu sehen sind) aber eher für Nahrungsreste als für Zoochlorellen.
Ich zeige dir noch ein Foto eines anderen Exemplares (ca. 110µ), bei dem man von seitlich, unten auf die Bauchseite blickt. Vielleicht kann man hier das Membranellenband erahnen.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/167777_49154993.jpg)
Ich glaube, dass meine Fotos für eine Bestimmung nicht ausreichen. Trotzdem bin ich für alle Tipps dankbar.
Ich habe übrigens mehrmal versucht, den Ciliat lebend zu beobachen. Die Tiere pflegen lange bevor sie durch das Deckglas festgelegt sind, zu platzen - wahrscheinlich mache ich da was falsch oder die Tiere sind sehr empfindlich. An meinem Mikroskop kann ich (ausser Bewegungen) keine Unterschiede zwischen lebenden und fixierten Tieren beobachten - was nicht viel heissen mag.
Grüsse,
Michael
Hallo Michael,
ein stichotricher Ciliat ist es auf jeden Fall!
Herzliche Mikrogrüße!
Heinrich
Hallo Michael,
ich muss nochmal was nachfragen: Du schriebst, dass Du Lugolsche Lösung probiert hast. Eigentlich ist Lugol ein recht gutes Fixiermittel, das hervorragende Ergebnisse liefert,(Streble/Krauter, S.23, 10. Auflage) wie ich selbst schon beim Auszählen von Plankton feststellen konnte. Mit welcher Konzentration hast Du gearbeitet?
Und noch eine Frage an ALLE, besonders die Chemiker in der werten Runde; Ist in der Lugolschen Lösung bereits Natriumacetat bzw. Eisessig enthalten, oder muss das noch in entsprechender Menge zugefügt werden?
Liebe Grüße und besten Dank
Heinrich
Hallo Heinrich,
ja, ich habe Lugol in unterschiedlichen Konzentrationen probiert. Zur Standardlösung habe ich, wie in Streble/Krauter beschrieben, Essigsäure zugesetzt. Es gibt Lugol aber auch bereits mit Natriumacetat zu kaufen (ich glaube unter dem Namen "Lugol-Plus" od. so ähnlich).
Lugol hat gut fixiert für Phytoplankton und Mehrzeller wie Nematoden, Tardigraden u. ä. Ciliaten wurden nicht so gut fixiert. Der Körper wurde stark deformiert und ist oft geplatzt. Zirren waren aber noch gut zu erkennen. Eiweiß wurde denaturiert. Die oben vorgeschlagene Fixierung liefert weit bessere Ergebnisse: Form bleibt erhalten, Eiweiß wird nicht denaturiert sondern - wahrscheinlich - quervernetzt. Zellstrukturen bleiben wohl weitgehend erhalten.
So ist z.B. bei den oben gezeigten Exemplaren (und auch bei den 3 weiteren von mir fixierten) jeweils an der Stelle des Zellmundes - selbst auf diesen Fotos -ein Spalte zu sehen. Ob das der Zellmund ist, weis ich nicht - jedenfalls ist diese Zellorganelle bei allen untersuchten Exemplaren vorhanden. Dies war mit meiner Ausrüstung an lebenden Tieren so nicht zu beobachten.
Grüsse
Michael
Hallo Michael,
Mmh..sonderbar. Mir ist es auch schon mal in anderem Zusammenhang passiert, dass der Streble/Krauter sich geirrt hat, aber hier...-bei einer Standardmethode? Da bin ich überfragt, woran das schlechte Ergebnis liegen könnte. Das würde mich genauso brennend interessieren wie Dich.
Bitte helft uns!
Herzliche Grüße
Heinrich
P.S. Diese am Rand bewimperte "Spalte"ist der "Zellmund" und ein gutes Erkennungsmerkmal bei den Stichotricha und Hypotrichia
Hallo Heinrich,
soweit, dass der Streble/Krauter sich geirrt hat, würde ich nicht gehen. Die Fixierung mit Lugol und Auszählung des Sediments ist eine Standardmethode zur Gewässeruntersuchung (Utermöhl Methode) Sie wird in der Literatur aber ausdrücklich nur für Phytoplankton empfohlen. Vielleicht hängt der Erfolg bei Ciliaten ja von der Widerstandsfähigkiet der Tiere ab. Wie gesagt, die von mir untersuchten Ciliaten waren sehr empfindlich und sind beim leisesten Deckglasdruck geplatzt.
Bei Lugol werden die Tiere durch Denaturierung des Eiweiß sehr trübe. Zum Auszählen mag das ja nicht stören, zur genaueren Untersuchung aber schon.
Ich habe heute ein paar Euplotes nach meiner Methode fixiert und muss sagen, dass das die Tiere immer noch aussehen wie im Streble/Krauter abgebildet (auch verglichen mit den Fotos). Es würde mich wirklich interessieren, wie Experten diese Fixierung beurteilen. Will nicht jemand mal einen Versuch machen? Am E-Liquid solls nicht scheitern. Ich bin gerne bereit an Interessierte eine Kleinmenge zu schicken.
Grüsse
Michael
Zitat von: limno in März 09, 2015, 10:22:25 VORMITTAG
Hallo Michael,
Und noch eine Frage an ALLE, besonders die Chemiker in der werten Runde; Ist in der Lugolschen Lösung bereits Natriumacetat bzw. Eisessig enthalten, oder muss das noch in entsprechender Menge zugefügt werden?
Liebe Grüße und besten Dank
Heinrich
hallo Heinrich
LUGOLsche Lösung enthält von Ansatz her nur Kaliumjodid und elementares Jod in wäßriger Lösung. Elementares Jod löst sich nur minimal in Wasser, aber sehr gut in der wäßrigen lösung seines Salzes Kaliumiodid unter Bildung von KI5. Ein Zusatz von Essigsäure HAc mit ihrem Salz, dem Acetat, bewirkt nur eine Einstellung des pH-Wertes so um pH = 4,8 +/- 0,5 je nach Mischungsverhältnis HAC / Ac.
Ein Zerplatzen des Einzeller kann eventl dadurch erklärt werden, dass die Gesamtlösung zu gering konzentriert ist und dass das Lösungsmittelwasser per Osmose versucht, den hochkonzentrierten Cilaten zu "verdünnen" , was natürlich zum Platzen des Ciliaten führt.
Hallo,
alle Fixierungen erzeugen Artefakte. Das ist auch nicht so schlimm, so lange man weiss, was Artefakte sind und was nicht. Aus diesem Grund ist es sinnvoll, etablierte Fixiermethoden zu benutzen. Ansonsten sind die Ergebnisse nicht vergleichbar und nicht aussagekräftig.
Herzliche Grüsse,
Eckhard
Hallo Wolfgang,
an Osmose hatte ich auch schon gedacht. Als die ersten Versuche mit LUGOL in einer Konzentration, bei der die "Färbung an Kognak erinnert" (Streble/Krauter) fehl geschlagen sind, habe ich folgende Versuche gemacht:
1. LUGOL weiter verdünnt, um das Konzentrationsgefälle zu minimieren: Fixierung des Ciliaten dauert mehrere Sekunde; Ciliat wird dann trübe und sedimentiert; Zellen geplatzt, Zirren nicht sehr gut fixiert.
2. LUGOL im Vergleich zur Standardlösung konzentrierter eingestellt: Fixierung augenblicklich; Ciliat wird dann trübe und sedimentiert; Zellen geplatzt, Zirren sehr gut fixiert. Insgesamt etwas besser.
3. LUGOL unverdünnt: Fixierung augenblicklich; Ciliat wird dann trübe und sedimentiert; Zellen geplatzt, Zirren sehr gut fixiert. Insgesamt etwas schlechter als bei 2.
Da die stark verdünnte Lösung ebenfalls zum Platzen führt, glaube ich nicht an ein Osmose-Problem, da der osmotische Druck bei kleinem Konzentrationsgefälle entsprechend kleiner sein müsste. Vielmehr glaube ich, dass LUGOL zur Denaturierung des Eiweiß in der Zelle führt. Dabei quillt das Material möglicherweise auf, was, je nach Stabilität der Zellwand, zum Platzen führt. Dies würde auch erklären, warum LUGOL bei Algen bessere Ergebnisse zeigt.
Bei der oben vorgestellten Fixiermethode beruht die Fixierung wohl auf dem enthaltenen Nikotin (immerhin 12%). Nikotin schädigt wohl auch den Cilienschlag der Flimmerzellen in den Atemwegen.
Um den Fixiererfolg genauer zu beurteilen, habe ich gesten 3 Exemplare eines alten Bekannten, "Euplotes muscicola" fixiert. Mit diesen Tieren, im lebenden Zustand, habe ich mich die letzten Wochen genauer beschäftigt und kenne ihr Aussehen daher recht gut. Die fixierten Tiere sind in meinen Augen genauso transparent wie die lebenden. Die Zellform und die Organellen sind gut erhalten. Lediglich die Zirren sehen z.T. so aus, als ob sie sich in "Haarbüschel" verwandelt hätten. Ich kann mit meinem Instrument nicht feststellen, ob diese Büschel wirklich aus den Zirren entstanden sind oder ob Trichozysten ausgelöst wurden (besitzt Euplotes Trychozysten?).
Insgesamt glaube ich, dass die Nikotinfixierung für den Amateur durchaus interessant ist, da sie
- praktisch ungiftig
- problemlos durchführbar
- eine lebensnahe Fixierung
- leicht zu beschaffen
- preiswert
ist.
Ich würde mich wirklich freuen, wenn jemand anderes diese Fixierung mal ausprobieren würde.
Grüsse,
Michael
Hallo,
auch auf die Gefahr hin, etwas überlesen zu haben: Was spricht eigentlich dafür, dass es sich im vorliegenden Fall überhaupt um eine Fixierung handelt?
Töten ist doch wohl sicherlich nicht synonym zu fixieren?
vlg
Timm
Zitat von: treinisch in März 10, 2015, 13:50:42 NACHMITTAGS
Hallo,
auch auf die Gefahr hin, etwas überlesen zu haben: Was spricht eigentlich dafür, dass es sich im vorliegenden Fall überhaupt um eine Fixierung handelt?
Töten ist doch wohl sicherlich nicht synonym zu fixieren?
vlg
Timm
Richtig. Die Fixierung soll die sicht- bzw. mikroskopierbaren Organe so erhalten, wie sie vor Beginn der Fixierung waren - möglichst alle Organe, die meisten oder ganz bestimmte.
Allerdings bin ich etwas verunsichert, weil es sich im vorliegenden Fall nicht auisweislich des "Betreff" gar nicht um eine Fixierung, sondern um eine
Fuxierung handeln soll.
Boys & Girls, schlampt nicht so viel im Betreff, sonst kann der ganze Thread mit der Suchfunktion des Forums niemals gefunden werden.
Und Gruß
KH
Zitat von: Klaus Henkel in März 10, 2015, 14:17:57 NACHMITTAGS
Richtig. Die Fixierung soll die sicht- bzw. mikroskopierbaren Organe so erhalten, wie sie vor Beginn der Fixierung waren - möglichst alle Organe, die meisten oder ganz bestimmte.
Well , technically speaking there's a difference between fixation and preservation. That shouldn't matter in this discussion though.
René
Hallo!
Zitat von: Klaus Henkel in März 10, 2015, 14:17:57 NACHMITTAGS
Allerdings bin ich etwas verunsichert, weil es sich im vorliegenden Fall nicht auisweislich des "Betreff" gar nicht um eine Fixierung, sondern um eine Fuxierung handeln soll.
Boys & Girls, schlampt nicht so viel im Betreff, sonst kann der ganze Thread mit der Suchfunktion des Forums niemals gefunden werden.
Entschuldigung für die Schlamperei, ich habe aber erst jetzt begriffen, dass ich den Betreff in der Übersicht ändern kann, wenn ich den ersten Eintrag editiere.
Zitat von: Klaus Henkel in März 10, 2015, 14:17:57 NACHMITTAGS
Richtig. Die Fixierung soll die sicht- bzw. mikroskopierbaren Organe so erhalten, wie sie vor Beginn der Fixierung waren - möglichst alle Organe, die meisten oder ganz bestimmte.
Ja, Töten ist einfach. Meiner Meinung nach erhält die vorgeschlagene Fixierung die sicht- bzw. mikroskopierbaren Organe recht zufriedenstellend. Darum geht es ja gerade.
Ob das Ergebniss über längere Zeit konserviert wird, kann ich noch nicht sagen.
Grüsse
Michael
Hallo,
ZitatMeiner Meinung nach erhält die vorgeschlagene Fixierung die sicht- bzw. mikroskopierbaren Organe recht zufriedenstellend
Hmm. Ich kann auf den Bildern keine Organellen zufriedenstellend erkennen.
Herzliche Grüsse,
Eckhard
Hallo,
Zitat von: Eckhard in März 10, 2015, 16:38:41 NACHMITTAGS
Hmm. Ich kann auf den Bildern keine Organellen zufriedenstellend erkennen.
Ja, Du hast natürlich recht - ich hätte von vorherein auf das Zeigen dieser miesen Bilder verzichten sollen. Wie beschrieben sind sie mit einer schlechten Okularkamera aufgenommen und können sich in keiner Weise mit der hier üblichen Bildqualität messen.
Ich wollte nur ausdrücken dass ich rein optisch mit meiner schlechten Ausrüstung keinen schlechteren Eindruck vom fixierten Material habe als vom lebenden - wohlgemerkt gemessen an meiner alles anders als professionellen Ausrüstung. Die Bilder habe ich nur gezeigt, da diese erkennen lassen, dass die Fixierung in meinen Augen viel besser war, als die von mir im Vorfeld getesteten.
Aus diesem Grund habe ich darum gebeten, ob nicht jemand mit einer besseren Ausrüstung die vorgeschlagenen Fixierungsmethode überprüfen kann.
Meine Absicht war zu keinem Zeitpunkt, mit professionellen Fixierungen zu konkurrieren. Ich kann mir aber vorstellen, dass im Amateurbereich so mancher froh wäre, eine einfache - vielleicht einigermaßen zufriedenstellende - Methode für seine speziellen Zwecke aufgezeigt zu bekommen. Dazu würde es aber einer unvoreingenommenen Überprüfung der Fixierungsergebnisse bedürfen.
Vielleicht findet sich ja jemand, den diese Aufgabe reizt - ich kann das mit meiner Ausrüstung nicht leisten.
Grüsse,
Michael
Hallo in die Runde,
ich möchte nur noch abschließend, für alle Interessierten berichten, dass die "Nikotinfixierung" eine spätere Färbung nicht beeinträchtigt. Ich habe gestern einige fixierte Ciliaten mit Hämatoxilin (Mayer) und Eosin gefärbt. Das Ergebnis möchte ich Euch nicht vorenthalten:
Ciliat, fixiert, Hämatoxlin & Eosin; heftig nach bearbeitet, damit man wenigstens ein bisschen was erkennen kann:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/168107_45892468.jpg)
Da das Foto sehr schlecht ist, lege ich noch eine Zeichnung bei, die die Einzelheiten aus dem optischen Bild einarbeitet:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/168107_2543004.jpg)
Ich weis natürlich, dass die Färbung besser hätte sein können - ich übe noch.
Grüsse,
Michael
Hallo zusammen,
da ich mir vor kurzem ein CH2 hier im Mikromarkt gekauft habe, wollte ich dieses natürlich ausprobieren und da meine primären "Zielobjekte", die Stechmücken noch nicht unterwegs sind, hab ich mir vom nahen Tümpel etwas Belag und Algen geholt.
Ich habe dann, mangels besserer Chemikalien, erstmal mit Aceton das Abtöten diverser Protisten ausprobiert, was aber nicht wirklich befriedigend war. Ich habe dann auf Betadine (Povidon-Iod) aus dem Arzneimittelschränckchen zurückgefriffen, welches - entsprechend verdünnt - sehr zuverlässig alles unter dem Deckglas in kurzer Zeit den Gar aus gemacht hat.
Hat jemand schon mal Povidon-Iod ausprobiert? Und weiss jemand ob das gravierende Nachteile gegenüber der Lugolschen Lösung hat? Wenn nicht wäre das eine billige Alternative welche praktisch in jeder Apotheke weltweit erhältlich ist.
Grüße aus der Schweiz
Christian
Hallo,
Zitat von: cabo in April 07, 2015, 14:46:30 NACHMITTAGS
das Abtöten diverser Protisten
einen Hinweis möchte ich an dieser Stelle gern wiederholen: Zwar ist Fixierung zwingend mit dem Tod verbunden, aber nicht umgekehrt.
fixieren ≠ töten
Davon abgesehen sollte Povidon-Iod genau den selben Effekt wie Lugolsche Lösung haben, ist schließlich das Gleiche nur in grün. Halt Povidon statt KI. Allerdings sollte Lugolsche Lösung ebenfalls in jeder Apotheke erhältlich sein?
vlg
Timm
Hallo Michael,
Zitatich möchte nur noch abschließend, für alle Interessierten berichten, dass die "Nikotinfixierung" eine spätere Färbung nicht beeinträchtigt. Ich habe gestern einige fixierte Ciliaten mit Hämatoxilin (Mayer) und Eosin gefärbt. Das Ergebnis möchte ich Euch nicht vorenthalten:
Vielen Dank dass Du Deine Ergebnisse hier mit uns teilst. Ich habe bezüglich Ciliaten-Fixierung bzw. Färbung keinerlei Erfahrungen. Insofern kann ich auch nicht beurteilen, ob das Ergebnis gut ist, bzw. ob man das noch besser machen kann. Ich finde Dein Ergebnis durchaus ansprechend...ich habe noch nichts besseres hier im Forum gesehen (es gibt ja keine entsprechenden Fotos von fixierten bzw. gefärbten Ciliaten im Forum zu bewundern) ;) . Ich vermute mit dem DIK ist das aus der Mode gekommen.
Mich würde es jedenfalls interessieren, wie Du da genau vorgegangen bist.
Viele Grüße
Jochen
Hallo Jochen,
zum Färben habe ich das H & E Färbeset von CHEMLAB verwendet.
Im Detail bin ich wie folgt vorgegangen:
- Pipettieren einiger Ciliaten auf einen Objektträger
- Zugabe eines Tropfen Fixierung
- Pipettieren der fixierten Ciliaten in einen Tropfen dest. Wasser (5 min warten)
- Pipettieren in einen Tropfen Hämatoxilin auf einem OT (5 min)
- ... in einen (großen) Tropfen Differenzierlösung (15 min)
- ... in Spüllösung (3 min)
- ... in Eosin (10 min)
- ... in Spüllösung (5 min)
- wasserlöslich Eindecken (in Includal A, bin mit dem Ergebnis aber nicht sehr zufrieden)
Die Zeiten sind durch den z.T. recht schwierigen Pipettiervorgang nicht so genau einzuhalten. Später habe ich die Färbung mit Eosin weggelassen und fand das Ergebnis ansprechender und klarer.
Grüsse,
Michael
Hallo,
Zitat von: Michael in April 08, 2015, 12:38:36 NACHMITTAGS
- Pipettieren in einen Tropfen Hämatoxilin auf einem OT (5 min)
witzig! Mir ist beim googeln gerade aufgefallen, dass ich meine Ostereier mit Hämatoxilin gefärbt habe!
(Blauholz+Alaun, färbt wie Sau!, die Eier kann man dann aber nicht mehr essen, der Farbstoff ist mutagen)
So klein ist auch die chemische Welt.
Vielleicht mal ein spannendes Projekt für Schulen :-) Histologie mit Pflanzenfarben oder so...
vlg
Timm