Hallo,
ich möchte einen Dünnschliff durch einen Knochen machen. Im Schlüter wird empfohlen Knochen zu benutzen, die schon so lange draußen lagen, dass alle organische Substanz aufgelöst ist. Gibt es eine Möglichkeit die aus frischen Knochen heraus zu bekommen, vielleicht mit Wasserstoffperoxyd wie bei den Diatomeen?
Ich habe bis jetzt zwei Flächen eines Rohrenknochen vom Rind (typischer Suppenknochen-Ring) plan geschliffen bis Körnung 600 und jeweils einen Längs- und einen Querschnitt von ca. 1,5mm Dicke mit der Laubsäge abgetrennt. Zum Entfetten schwimmen die Streifen gerade in Benzin, aber ich hätte gerne die pure mineralische Knochensubstanz.
Beste Grüße
Gerd
Zitat von: Safari in März 29, 2015, 22:59:29 NACHMITTAGS
: Salzsäure.
Neee - dann ist der Kalk, also die
reine mineralische Substanz mit Sicherheit weg und es bleibt der organische Teil (Knorpel) übrig - und den kann man ja gerade nicht schleifen - Salzsäur nimmt man, um den Knorpel übrig zu behalten und daraus z.B. Knochenleim zu kochen.
Hallo Gerd.
Messermacher kochen Knochen relativ lange, um daraus Griffschalen herzustellen, wenn ich mich richtig erinnere. In entsprechenden Messerforen solltest Du detaillierte Anleitungen finden.
Liebe Grüße Jorrit.
Hallo Gerd,
ich brauche gelegentlich auch "nichtmehrstinkende" Knochen. Wenn man sie einfach eine weile in Waschpulver und oder Spülmaschninenspülmittel kocht, dann ist Schluss mit jedem Geruch. ich vermute, dass damit auch jede organische Substanz weitgehend entfernt ist. Spülmaschienenspülmittel ist ziemlich gründlich.
Grüße
Thomas
hallo Gerd
um die Knochenkomponenten zu erhalten, gibt es die klassischen Schulversuche :
Beweis für die elast. Komponente, den Knorpel :
Knochen ca 2 Tage in verd. Salzsäure legen - anorgan. Substanz ("Kalk") löst sich auf
Beweis für die anorgan. Substanz ("Kalk") :
Knochen über dem Bunsenbrenner stark erhitzen - Knorpelmasse verbrennt und die Knochenbälkchen bleiben übrig.
Hallo Gerd,
wieso willst du die organische Substanz für einen Dünnschliff entfernen ? Dadurch wird das ganze doch nur poröser und schlecht schleifbar.
Wenn du einen guten Dünnschliff erhalten willst musst du die Knochenstücke fixieren (z.B. Formaldehyd), entwässern und entfetten (Alkohohlreihe, Aceton, Xylol (oder Ersatz Rotisol), einbetten (infiltrieren) in Epoxydharz und dann dünnschleifen.
Hier eine Anleitung wie man z.B. bei der Darstellung von Implantaten im Knochenschliff vorgeht:
www.struers.de/resources/elements/12/38873/e-Structure%206_DT.pdf
viele Grüsse
Wilfried
Zitat von: plaenerdd in März 29, 2015, 22:35:16 NACHMITTAGS
Im Schlüter wird empfohlen Knochen zu benutzen, die schon so lange draußen lagen, dass alle organische Substanz aufgelöst ist. Gibt es eine Möglichkeit die aus frischen Knochen heraus zu bekommen, vielleicht mit Wasserstoffperoxyd wie bei den Diatomeen?
Ich vermute, dass Schlüter die Knochen lagert, um die grobe organische Substanz (Fleisch, Knochenmark) aufzuloesen. Dafuer eignen sich auch Waschmittellauge oder eine Steckkaeferkultur ;) Die Proteine in der Knochenmatrix, insbesondere Collagen, werden so nicht beseitigt. Collagen im Knochen ist SEHR langlebig; die 14C-Datierung von Knochen beruht auf der Extraktion des "Collagens" aus dem archaeologischen Material, soweit ich das verstehe.
Selektiv Collagen zu entfernen und nur die mineralische Substanz zu hinterlassen geht durch Ausgluehen (unter Verlust der Feinstruktur) oder durch Behandlung der polierten Schnitte mit Collagenase: Green et al. (1985) Bone microstructure by collagenase etching. Biomaterials 6:150-2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2988660
Mit dem Suchbegriff
collagenase etching finden Sie sicher weiteres Material.
Selbst diese Methode scheint aber nur die oberflaechennahen Collagene zu entfernen (deshalb "Aetzung"); laut den Autoren finden sich Kanaelchen von bis zu 200 nm dort, wo die Collagenfasern entfernt wurden. Die Verbindung von mineralischen Komponenten und Collagen ist naemlich so intim, so kleinskaliert http://www.nature.com/ncomms/journal/v4/n4/images/ncomms2720-f1.jpg , dass sich dies mit dem Lichtmikroskop gar nicht sinnvoll analysieren laesst.
Beste Gruesse, Jon
Zitat von: JB in März 30, 2015, 01:30:29 VORMITTAG
... Die Verbindung von mineralischen Komponenten und Collagen ist naemlich so intim, so kleinskaliert http://www.nature.com/ncomms/journal/v4/n4/images/ncomms2720-f1.jpg , dass sich dies mit dem Lichtmikroskop gar nicht sinnvoll analysieren laesst.
Hallo,
natürlich braucht man für die Strukturanalyse der Collagen/Hydroxylapatit Verbundmatrix die Transmissionselektronenmikroskopie.
Die Hydroxylapatit Kristalle haben Abmessungen von ca. 15 x 40 nm und die Bandstruktur der Kollagenfibrillen liegt in ähnlicher Grössenordnung.
Mit Lichmikroskopie wird man da also nicht weit kommen. Aber ich denke auch dass Gerd eher die mikroskopische Struktur (z.B. Haversche Kanäle)
sehen will und nicht die Nanostruktur.
viele Grüsse
Wilfried
Moin,
ich habe sowas fürs REM schon mal gemacht um den Kalkauf- und -abbau in den Knochen von mit unterschiedlichen Steroid-Präparaten behandelten Ratten zu zeigen. Zunächst die Knöchelchen im frischen Zustand mit scharfem Messer (Mikrotomklinge o.ä.), kleiner Säge oder auch durch schleifen auf Schleifpapier so zurichten, dass man die erforderlichen Abmessungen erreicht und anschließend in Kalilauge einlegen. Nach ein paar Tagen (in Abhängigkeit von der Größe des Knochenstücks) bleiben lediglich die Kalkstrukturen übrig, können gewaschen und getrocknet und für das REM vorbereitet werden. Vorsicht, das kleine Gebilde das da übrigbleibt ist äußerst fragil.
Man kann aber auch vorher bereits den Prozess unterbrechen, wenn alle äußerlich anhaftenden Weichteile zersetzt sind, dann spülen, evtl. fixieren - ich habe damals nur getrocknet. Danach lassen sich die Knochenteile durchaus von Hand zunächst auf Wasserschleifpapier zuletzt bis zur 800er Körnung erst auf der einen Seite planschleifen, mit Zweikomponisten-Klebstoff auf einen Objekträger kleben ( ich benutzte seinerzeit wegen der größeren Stabilität Gießener Objektträger) und bis zur Durchsichtigkeit herunterschleifen, eindeckeln, fertig. Man muss erst ein wenig üben, aber man kann so durchaus gleichmäßige Schliffe bis zu 30-40 Mikrometern Dicke erhalten. Ich selbst habe die allerdings für die Fluoreszenzmikroskopie angefertigt, um durch Fütterungsgabe von Fluoreszenz-Farbstoffen in den Knochen Wachstumsphasen sichtbar zu machen. Im Auflicht benötigt man dann natürlich nicht derart dünne Schliffe, ich habe es dennoch mal ausprobiert, wie weit ich mit dieser Methode herunterkommen kann.
Der umgekehrte Weg geht natürlich auch: Um an ein normal histologisch schneid- und färbbares Präparat zu kommen, wird der Knochen mit EDTA oder nach meiner Erfahrung besser, mit Trichloressigsäure entkalkt, anschließend eingebettet und geschnitten. Hierbei sind dann einigermaßen problemlos Schnitte bis herunter zu 3-5 Mikrometern möglich. Schneiden sollte man mit schräggestelltem Messer im ziehenden Schnitt, sonst gibt es u.U. Schwierigkeiten mit Falten. Fixieren braucht man nach dem Entkalken mit Trichloressigsäure kaum oder garnicht, da diese bereits eine fixierende Wirkung hat. Allerdings gilt es, Schrumpfungen zu minimieren, aber da müsste ich noch einmal in alte Protokolle schauen. Vorausgesetzt ich finde sie noch, weil diese Arbeit bereits 12 oder gar 14 Jahre zurückliegt. Es gibt aber wunderbare Färbungen, z.b. eine Pentachromfärbung, die die Lage und Ausrichtung der Collagenfasern zeigt und auch eine, die die ursprünglich verkalkten Strukturen sehr spezifisch einfärbt.
Freundliche Grüße
Wolfgang
p.s.: es könnte sogar sein, dass ich noch ungeschnittene Blöckchen liegen habe, fällt mir gerade ein
Hallo,
herzlichen Dank allen Antwortenden. Es ist in der Tat so, dass ich die mineralischen Strukturen mit dem Polmikroskop ansehen möchte. Tja, warum die organische Substanz weg? Weil ich eben im SCHLÜTER gelesen habe, dass man dazu am besten alte Knochen nimmt, wo das weitestgehend fehlt, ich aber nur frische habe. Ich habe inzwischen auch eine andere Quelle gefunden, in der Knochendünnschliffe beschrieben sind: R. DREWS "Mikroskopie als Hobby". Er schreibt. "Säubern Sie zunächst das Objekt von allen organischen Bestandteilen, indem Sie es in verdünnte Natronlauge oder in eine Sodalösung legen. Anschließend müssen Sie das Teil gründlich wässern (mehrmaliger Wechsel über mehrere Tage) und dann trocknen lassen" Danach soll in Epoxitharz eingebettet, gesägt und geschliffen werden. Das ist sicher die edelste Methode, aber mit dem Epoxitharz, möglichst unter Vakuum verarbeitet, wollte ich jetzt nicht noch anfangen.
@ Jorrit: Die Messermacher brauchen einen stabielen Knochen, der aber möglichst weiß sein soll (also entfettet, aber sehr wohl mit der organischen Substanz, die dem Knochen seine hohe Elastizität gibt. Wenn die Knochen selbst zu Werkzeugen verarbeitet werden (Pfeilspitzen, Knochennadeln, Falzbein) muss auch das Fett drin bleiben, auch wenn es mit der Zeit zu einer Gelbfärbung führt.
Ich werde mal versuchen, das organische drin zu lassen und nur zu entfetten, da ich fürchte, dass sonst der Schliff nicht auf dem Objektträger hält.
Die Idee mit dem Fixieren gefällt mir auch. Ob es auch mit hochprozentigem Alkohol geht? Ich habe kein Formol.
Zum Aufkleben wollte ich mit Eukitt arbeiten. In der (Gesteins-)Dünnschliffherstellung nimmt man ja wohl nur noch 2-Komponenten-Geschichten, von denen ich aber auch nichts da habe. Ich will jetzt nicht über Knochen forschen, sondern einfach mal einen dünn genug raspeln, dass ich ihn im Pol-Mik angucken kann. Da wollte ich mir kein zu umfangreiches Chemikalienlager anlegen.
Beste Grüße
Gerd
Moin moin,
schon mal darüber nachgedacht dafür auf fossile Knochen zurück zugreifen. Die sind immer auf diversen Börsen und im Netzt erhältlich und wenn Du nur Bruchstücke brauchst auch fürs kleine Geld.
Grüße
Ulrich
Hallom Ulrich,
ich habe selber schon einige fossile Knochen gefunden, unter anderem von Nothosaurus, aber die sind mir irgendwie zu schade...
Grüße
Gerd
Zitat von: plaenerdd in März 30, 2015, 17:31:30 NACHMITTAGS
Ich werde mal versuchen, das organische drin zu lassen und nur zu entfetten, da ich fürchte, dass sonst der Schliff nicht auf dem Objektträger hält.
Die Idee mit dem Fixieren gefällt mir auch. Ob es auch mit hochprozentigem Alkohol geht? Ich habe kein Formol.
Hallo Gerd
wir (Ralf Wagner und Freunde) haben im Februar so einen Knochenjob-Sonntag veranstaltet und hatten auch versucht uns vorher schlau zu machen wie man am einfachsten vorgeht. Nach allem was ich im Kremer und bei Romeis gelesen hatte, braucht man aufwändige Fixation und Entkalkung nur für Mikrotomschnitte und anschliessende Färbung. Fürs schleifen sollte einfache Vorbehandlung mit Alkohol reichen. Siehe z.B. Romeis:
" Schliffherstellung ohne Vorbehandlung:
Von mazeriertem Knochenmaterial, das von Weichgewebe
befreit ist, und von Zähnen können sowohl im nativen als
auch im fixierten Zustand durch Schleifen transparente
Präparate hergestellt werden.
Diese Präparate werden als Dünnschliffpräparate oder
Schliffe bezeichnet und haben eine Dicke von 50 bis 100
Mikrometern (Abb. 4.6). Sie informieren über den strukturellen Aufbau der verkalkten Bindegewebsmatrix und
geben indirekt und sehr klar Auskunft über die Gestalt der
am Aufbau der in der Hartsubstanz enthaltenen Zellen (v.a.
der Osteozyten)"
Ich erinnere nicht genau, ob Ralf FAE oder 70% Ethanol zu groben Fixierung benutzt hatte. Zum aufkleben haben wir UV Kleber benutzt. Die Resultate waren sehr ansehnlich!
Viel Glück denn
und Mikrogrüße
Bernhard
Moin Gerd,
2-Komponenten-Klebstoff gibts im Supermarkt: UHUplus. Der reicht für die angestrebte Klebung voll und ganz aus. Wasserschleifpapier beim Autozubehörhandel, wenn die dort auch Lackiermaterialien vertreiben. das spannst Du über eine etwas dickere Glasplatte und los geht es. Entfetten kannst Du den Knochen äußerlich -mehr braucht es ja nicht zu kleben - auch sehr gut und schnell mit Wundbenzin. In UHUplus habe ich auch schon richtig eingebettet zum schleifen. Ich weiß, klingt alles nicht sehr wissenschaftlich, mein damaliger Chef wollte das auch erst nicht glauben und dann habe ich ihm doch nahezu 100 Präparate auf diese Art und Weise hergestellt. Schleife aber bitte unbedingt nass, sonst funktioniert das nicht.
Wenn man besonders fest kleben möchte, nimmt man UHUendfest 300 und erhitzt den aufgeklebten Knochen auf dem Objektträger im heimischen Backofen für 8-10Minuten auf 180Grad. Dann ist das Material auch sofort schleifbar. Mach Dir da nicht zuviel Gedanken, das funktioniert einigermaßen problemlos. Ein bisschen üben schadet allerdings nicht.
Freundliche Grüße
Wolfgang
Hallo Wolgang,
ich habe SiC-Pulver (60-120-220) fürs Grobe, dass ich nass auf einem schönen glatten Granit (ehemalige Fensterbank) benutze und 600 und 1000er Kourund für's Feine, das ich - natürlich auch nass - auf einer Glasplatte benutze. Gabs mal als Stein-Schleif-Starter-Set auf einer Mineralienbörse für 10,-€. Schätze, dass das noch grader wird als auf dem Papier bzw. Leinen.
Beste Grüße
Gerd
Zitat von: plaenerdd in März 30, 2015, 20:52:40 NACHMITTAGS
Hallo Wolgang,
ich habe SiC-Pulver (60-120-220) fürs Grobe, dass ich nass auf einem schönen glatten Granit (ehemalige Fensterbank) benutze und 600 und 1000er Kourund für's Feine, das ich - natürlich auch nass - auf einer Glasplatte benutze. Gabs mal als Stein-Schleif-Starter-Set auf einer Mineralienbörse für 10,-€. Schätze, dass das noch grader wird als auf dem Papier bzw. Leinen.
Beste Grüße
Gerd
...au, au, Gerd, ich würd das lassen! Einige von uns haben an dem bewussten Sonntag auch Schleifpulver benutzt. Das setzt sich wunderschön in die Poren des Knochenstückes und lässt sich auch im Ultraschallbad nicht mehr entfernen. Das trübt dann das mikroskopische Bild erheblich, denn SiC sieht im Durchlicht erstaunlich langweilig aus ;D
Nimm lieber Nassschleifpapier.
Viele Grüße
Bernhard
Zitat von: Bernhard Lebeda in März 30, 2015, 21:07:14 NACHMITTAGS
Nimm lieber Nassschleifpapier.
Das hätte ich Dir jetzt aber dringend ebenfalls geraten. Schleifpulver ist hervorragend fürs Anschleifen von z.b. Steinen, von denen man es aber auch rückstandslos wieder herunterspülen kann. Organische Hartgewebe und auch der Klebstoff sind einfach zu weich.
Freundliche Grüße
Wolfgang
Hallo,
ja das mit dem in die Poren setzen des Schleifpulvers habe ich auch schon etwas gemerkt. Werde ich wohl doch noch ein paar Zutaten kaufen müssen und von vorn beginnen. Nasschleifpapier hab ich nur bis Körnung 400. Das wird nicht ganz reichen.
Danke für den Hinweis! Da wäre Einschluss in Epoxydharz doch am besten, um dann mit den üblichen Steinschleifmethoden weiter machen zu können.
Es ist doch immer wieder ein weites Feld mit vielen kleinen Fallgruben, wenn man sich an einer neuen Technik versucht...
Beste Grüße
Gerd
Zitat von: plaenerdd in März 30, 2015, 22:02:39 NACHMITTAGS
Da wäre Einschluss in Epoxydharz doch am besten, um dann mit den üblichen Steinschleifmethoden weiter machen zu können.
Guten Morgen Gerd,
da hast Du "Im Prinzip" recht, aber eben nur im Prinzip. Denn das funktioniert nur dann, wenn Du den Knochen, ganz so wie es die professionelle Methode ist, komplett mit Epoxid-Harz durchtränkst, d.h. dass auch jede auch noch so kleine Pore mit dem Harz ausgefüllt und auch das im Knochenmaterial gebundene Wasser durch Harz verdrängt/ausgetauscht ist, ähnlich dem Paraffin im gewöhnlichen histologischen Präparat. Dies ist grundsätzlich natürlich möglich, aber erfordert selbst bei kleineren Knochenstücken viel Geduld (Wochen bis Monate) und auch eine gewisses Equipment (Vakuum-Wärmeschrank u.a.m.)
Die von uns geschilderte Methode basiert aber auf der Tatsache, dass der Knochen, zum histologischen Schneiden viel zu hart, seinerseits genügend Festigkeit besitzt um mit der nötigen Umsicht angeschliffen zu werden. Die Klebung mit 2-Komponentenklebstoff durchtränkt ihn nicht, sondern dient genaugenommen nur zur Montage und Stabilisierung des Knochens um eine Bearbeitung überhaupt möglich zu machen. Ohne ihn entsprechend zu montieren, wäre ein Herunterschleifen auf wenige 10 Mikrometer Stärke kaum möglich. Daher empfiehlt es sich auch, den Knochen nicht nur mit einer dünnen Schicht anzukleben, sondern auch drumherum Klebstoff aufzubringen um die Außenkanten des Schleifgutes möglichst zu stabilisieren. Ein kleiner Röhrenknochen, wie von mir beschrieben, sollte auch im ersten Arbeitsgang unbedingt so weit angeschliffen werden, dass Klebstoff in das Lumen der Spongiosa eindringen kann, bevor man die plane Fläche dann auf dem Objektträger montiert. Ich selbst habe dies nicht durch schleifen erreicht, sondern habe mir mittels einer kleinen PROXXON-Bohrmaschine eine Miniaturkreissäge mit einem feinen, hauchdünnen Sägeblatt improvisiert, um anstelle des Anschliffs einen planen Anschnitt zur Montage zu bekommen. Das lohnte sich bei der Vielzahl der zu bearbeitenden Präparate.
Auf ähnliche Weise können auch Samen von Steinobst u.a.m. zu Schliffen bearbeitet werden, ohne sie richtigehend einzubetten. Die Objekte sind damit zwar schleifbar, aber eben nur durch ihre Eigenfestigkeit und die liegt meist erheblich unter der Härte von Epoxidharz oder gar fossiliertem, vielleicht sogar verkieseltem Knochen. Aber die schleifen sich dann aber auch nicht so leicht zu Fuß. Auch bei solchen eigenstabilen Objekten wie z.B. einer Kokosnussschale würdest Du bei der Verwendung von Schleifpulver dieses nur sehr schwer oder garnicht aus dem fertigen Präparat herausbekommen.
Außerdem bestünde noch dadurch, das nach vollendetem Schliff das uneingebettete Gewebe offen liegt die Möglichkeit, durch aufbringen von Fixatien oder auch einfach durch Behandlung mit Formoldampf (einstellen des O-Trägers in eine Färbeküvette in der ein halber Finger hoch Formalin steht, abdeckjen und einen Tag stehenlassen) nachträglich zu fixieren. Ob dies nötig ist muss man von Fall zu Fall entscheiden. Ich habe mir gestern eines von meinen damaligen Knochen-Präparaten angeschaut und hatte nicht den Eindruck, dass sich das Objekt irgendwie verändert hat, obwohl seinerzeit nur getrocknet.
Freundliche Grüße
Wolfgang