Hallo -
angeregt durch Farne und Flechten habe ich mir ein älteres Projekt wieder vorgenommen. In einem gefärbten Präparat von MICHAEL DILLBERGER (leider verstorben) hatte ich eine Zellschicht in einem Spross von C. cunninghamiana beobachtet, die im UV-Licht eine Blaufluoreszenz zeigte, welche offensichtlich nicht von einem Histofarbstoff stammen konnte. Freundlicherweise hat mir Michael dann ungefärbte Schnitte von FEE-fixiertem Material überlassen, von denen ich hier einen vorstellen möchte. Er liegt in Wasser unter Deckglas und wird gezeigt in
1. Hellfeld,
2. Anregung UV-365 +- 12 nm (Anregung mit Nichia LED), T 395, LP 397
3. 436 +-10 nm (Anregung mit Luminus CBT-140), T 460, LP 470
4. 470 +- 20 nm (dto.), T 510, LP 525
5. 535 +- 25 nm (dto.), T 580, LP 590
Serie 1 - Übersicht über einen Quadranten des Querschnitts mit Zeiss PlanNeo 10x/0,30:
HF:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/182378_43099306.jpg) (http://s888.photobucket.com/user/rblaich/media/Cas000_zpsv8xaooxi.jpg.html)
Anregung 365 nm:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/182378_60420618.jpg) (http://s888.photobucket.com/user/rblaich/media/Cas365_zpsznxrsvke.jpg.html)
436:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/182378_34573254.jpg) (http://s888.photobucket.com/user/rblaich/media/Cas436_zps93jfk6r1.jpg.html)
470:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/182378_12292568.jpg) (http://s888.photobucket.com/user/rblaich/media/Cas460_zpsbjcemihs.jpg.html)
535:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/182378_16294673.jpg) (http://s888.photobucket.com/user/rblaich/media/Cas535_zpsrleahrtt.jpg.html)
Serie 2 - Ausschnitt mit Zeiss PlanApo 40x/0,95:
HF:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/182378_62171659.jpg) (http://s888.photobucket.com/user/rblaich/media/Casu000det_zpsmlvgzfmj.jpg.html)
365:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/182378_46261266.jpg) (http://s888.photobucket.com/user/rblaich/media/Casu365det_zpsmxvqjgwe.jpg.html)
436:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/182378_1382193.jpg) (http://s888.photobucket.com/user/rblaich/media/Casu436det_zpsopcygn3l.jpg.html)
470:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/182378_62198718.jpg) (http://s888.photobucket.com/user/rblaich/media/Casu470det_zpsk4owwatv.jpg.html)
535:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/182378_47478920.jpg) (http://s888.photobucket.com/user/rblaich/media/Casu535det_zpsvjf70dmg.jpg.html)
Über die Effekte kann jetzt spekuliert werden!
Viele Grüße
Rolf
P.S. Bitte keine Verbesserungsratschläge zur Bildverschönerung - ich wüsste schon wie das geht, falls es der Faktenfindung dient.
Hallo Rolf,
fachlich kann ich nichts beitragen, finde Deinen Beitrag aber höchst interessant und freue mich Bilder von Dir zu sehen.
lg
anne
Edit:
Es handelt sich natürlich nicht um einen Blatt- sondern um einen Sprossquerschnitt (D nur 0,5 mm!). Diese auffälligen Kanten sind die Blattansätze - man sieht darin das Leitbündel, der zu Schuppen reduzierten Blätter, die einen Wirtel bilden.
Gruß
Rolf
Hallo Rolf,
eine solche "Zwischenlage" hatte ich auch mal mit dieser intensiven weiss-blau Fluoreszenz. Ich denke, dass ich das hier auch gezeigt habe und Detlef was zur Interpretation gesagt hat. Dieses Präparat ist allerdings mit Wacker gefärbt.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/182388_56176637.jpg) (http://s106.photobucket.com/user/microklaus/media/Mikropraeparate%202012/Micropaeparate_2013/800_IMG_0001_zps82868f92.jpg.html)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/182388_44920701.jpg) (http://s106.photobucket.com/user/microklaus/media/Mikropraeparate%202012/Micropaeparate_2013/800_IMG_0001_1_zps5f0aa3b7.jpg.html)
Hallo Rolf,
schöne Vergleichsbilder ! Eine Frage zur UV Anregung. Welches Sperrfilter hast Du genommen und war zur Anregung noch ein Bandpassfilter dabei ?
Viele Grüße
Peter
Lieber Rolf,
ich bin mir ziemlich sicher, dass es sich um das Suberin der Zellwände des Phellems handelt. Das habe ich wohl seinerzeit auch zu Klaus' Foto angemerkt.
Herzliche Grüße
Detlef
Lieber Detlef -
danke für den Tipp!
Nachträglich: "Ja natürlich, wusste ich doch schon immer ;)". Würde auch zu der Beobachtung passen, dass die betreffenden Zellen die üblichen Färbungen kaum annehmen, sondern blass bleiben.
Da die Suberin-Nebenbestandteile chemisch ähnlich schlecht definiert sind wie das Lignin wäre es auch nicht erstaunlich, dass man diese blaue Fluoreszenz nur selten sieht obwohl es doch sehr verbreitet ist. Cumarin-Abkömmlinge eingelagert?
Die rote Fluoreszenz scheint ja von denaturiertem Chlorphyll bzw. Abbauprodukten herzurühren. Beim intakten Photosynteseapparat kriegt man die so stark ja nur mit Blauanregung, hier aber mit Grünanregung viel besser. Nun sieht die Zone im Durchlicht ja auch braun aus und nicht mehr grün. Hast Du da auch eine gute Idee?
Auf jeden Fall will ich da mal Denaturierungsexperimente mit frischen Blättern machen.
Viele Grüße
Rolf
Lieber Peter -
es handelt sich um die Zeiss-Filtersätze 01, 06, 09 und 14. Ich habe eingangs deren Daten jetzt etwas ausführlicher beschrieben. Der UV-Bandfilter hat eine HW-Breite von 24 nm, den Teiler kennst Du. Die Sperrfilter sind alles Langpassfilter - manchmal hätte ich schon gerne einen Bandpass, weil kräftige Gelbfluoreszenzen oft meist eventuell vorhandenes Grün überstrahlen.
Viele Grüße
Rolf
Hallo Rolf,
ich konnte bei einem Präparat vom Taschentuchbaum ähnliches im Rindenbereich beobachten.
Einmal im Hellfeld und einmal mit UV-Fluoreszenz 365nm. Olympus 40/1,30 UVFL. Gefärbt mit W3A.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/182439_8000236.jpg) (http://s1314.photobucket.com/user/davidkubon/media/IMG_2482_zpstly84tvp.jpg.html)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/182439_24466330.jpg) (http://s1314.photobucket.com/user/davidkubon/media/fin_zpsbudvdfr3.jpg.html)
Viele Grüße
David
ZitatHallo Rolf,
schöne Vergleichsbilder ! Eine Frage zur UV Anregung. Welches Sperrfilter hast Du genommen und war zur Anregung noch ein Bandpassfilter dabei ?
Lieber Peter,
auch wenn ich nicht angesprochen bin antworte ich doch noch zusätzlich: Bei mir ist es der Filterblock von Olympus WU BP 330-385 und Sperrfilter BA 420. HBO 100 W. Objektive: Planfluorite von Oly.
Lieber Rolf,
ZitatNun sieht die Zone im Durchlicht ja auch braun aus und nicht mehr grün
ja, habe ich: die Zellen des Phellems sind, wenn ausdifferenziert, tot und enthalten in den Wänden das braune Suberin. Deswegen sind alle Baumstämme +/- braun :).
Lieber David,
sehr schöne und klare Aufnahmen! Mehr davon!
Herzliche Grüße
Detlef
Hallo -
danke für alle Beiträge, insbesondere für die Hinweise von Thilo.
Eigentlich möchte ich kein Suberin nachweisen sondern beschäftige mich mit der Blaufluoreszenz unter UV m.o.w aus Nostalgie, weil ich mich in meiner wissenschaftlichen Jugend mit der Reserveratrolbildung bei Vitaceen beschäftigt habe und dieses Stilben zeigt eine kräftige Fluoreszenz ohne Fluorochromierung. Seine Bildung wird u.a. durch abiotische und biotische Schädigungen induziert, im Holz ist es aber konstitutiv vorhanden - auch bei viele anderen Pflanzen. Heute gilt es ja als esotherisches Wundermittel, von Krebs bis zur Maul- und Klauenseuche lässt sich alles damit heilen, man kann es teuer kaufen, aber als wir das bei einem Kongress berichtet hatten waren die ersten Beiträge Bedenken - "wie steht es mit der Toxikologie?"
Unterdessen habe ich aber erst mal mit ganz simplen Untersuchungen begonnen (mehr ist mir halt nicht mehr möglich), wobei mir auffiel, dass solche Primitivbeobachtungen in der Wissenschaft doch häufig vernachlässigt werden oder man geniert sich darüber zu reden ;D
Derzeit schneide ich zufällig verfügbare frische Stengel und Sprosse, betrachte die Fluoreszenz des Frischschnittes mit den 4 anfangs angegebenen Erreger-Wellenlängen, lasse ihn austrocknen, schaue wieder, tränke ihn wieder mit Wasser usw.
Als interessanten Nebeneffekt habe ich z.B. gesehen, dass die Zellwände von trockenem Holundermark, das mitgeschnitten wird, tatsächlich von UV bis Grün zu kräftiger Fluoreszenz (entsprechend von Blau bis Rot) angeregt werden. Ist das der Autofluoreszenz der Cellulose zu verdanken? Aber warum fluoresziert diese im frischen Schnitt nicht überall?
Interessant ist auch, was mit dem Chlorphyll passiert - ist der Rückgang der Fluoreszenz unter Blaulicht dem Kautsky-Effekt geschildert oder wird das Chlorophyll ausgebleicht?
Im ausgetrockneten Schnitt ist noch Chlorophyllfluoreszenz vorhanden, wird aber von gelber Fluoreszenz zu einem Braunton verfälscht - nach Wässern kommt sie wieder ,ist aber natürlich nicht mehr an Chloroplasten gebunden.
Wie gesagt, ich will im Lauf der Zeit versuchen solche Einzelbeobachtungen zu einer Art System zusammenzufassen - wenn noch was geht werde ich berichten.
Viele Grüße
Rolf
Liebe Pflanzenfreunde,
das sind faszinierende Aufnahmen und eine interessante Diskussion, die ich mit Spannung lese, da mir die Fluoreszenz mangels der notwendigen Ausstattung verschlossen ist.
Der Trivialname von Casuarina cunninghamiana wäre "Flußeiche" - vom englischen River Oak?
Zur Zeit habe zumindest ich massive Probleme beim Erstellen und Editieren von beiträgen mit externen Bilderlinks.
Daher werde ich diesen Faden hier erst listen, wenn sich die Lage wieder beruhigt hat. :)
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo Thilo,
interessant Deine Ausführungen. Allerdings sind die blau fluoreszienden Zellen sowohl bei Rolf, als auch bei David eindeutig dem Phellem zuzuordnen. Und dessen Zellwände sind durch den hohen Gehalt an Suberin charakterisiert. (Ich gehöre der aussterbenden Klasse der Botaniker an, die sich in der Anatomie der Pflanzen auskennen). Das alles ist kein klarer Beweis, da stimme ich Dir zu.
Gruß, Detlef
Lieber Thilo,
Einspruch: Cellulose fluoresziert nicht. Das geht schon von der Chemie nicht, weil keine konjugierten Doppelbindungen vorhanden sind und die Bausteine als Glucose-Einheiten gewinkelt sind. Es kann sich deshalb kein ausgedehntes Elektronensystem ausbilden, was die Voraussetzung für die Fluoreszenz ist.
Was da Eigenfluoreszenz zeigt, müssen immer Einlagerungen ins Cellolose-Grundgerüst sein, wie eben Lignin. Rost schreibt dazu (S. 28): "Examined with UV excitation ... cell walls commonly show a strong blue autofluorescence. This is due to a presence of lignin, cutin, suberin and/ or phenolic acids such as ferulic acid."
Die Formaldehyd-induzierte Fluoreszenz betrifft Arylethylamine. Mehr verbreitet in der Histologie, zur Botanik schreibt Rost nichts. Quelle: Rost Abschnitt 12 S. 57 ff.
Den Rost kannst Du momentan nicht ausleihen, den habe ich nämlich :)
Viele Grüße
Horst
Lieber Detlef -
Deinen Anmerkungen stimme ich völlig zu und ich zweifle nicht daran, dass es sich bei der Casuarina um Phellem handelt, zumal die etwas zusammengedrückten Zellen auch typisch sind. Bei den wunderschönen Aufnahmen von David ist die Form ja noch prächtig erhalten, ebenfalls bei denen von Klaus, wobei man bei letzteren natürlich berücksichtigen muss, dass es sich um gefärbte Schnitte handelt.
Allerdings ist dieses schöne Fluoreszenzblau selten, bei den meisten Sprossquerschnittenpräparate (gefärbt oder ungefärbt) sehe ich da nur grünliche Fluoreszenz. Interessanterweise macht man die analoge Beobachtung auch bei der Fluoreszenz der Cuticula (meist grün, selten blau).
Es ist sicher so, dass beim Suberin und beim Cutin verschiedener Pflanzen nur die Hauptkomponenten m.o.w. identisch sind, während die Zusatzbestandteile variieren und diese dürften wohl hauptsächlich für die Fluoreszenz verantwortlich sein - ähnlich wie das Horst jetzt für die Cellulose klargestellt hat.
Viele Grüße
Rolf
Lieber Horst -
Danke für Deinen Einspruch - er hat mich davor bewahrt meine verschütteten Kenntnisse über die Entstehung von Farben einer Generalüberholung unterziehen zu müssen.
Die Anlagerung von Substanzen an das Zellwandgerüst kann man auch beim Austrocknen der Zellen durch die Änderung (Verstärkung) der Fluoreszenz beobachten.
Viele Grüße
Rolf
Liebe Fluoreszenzler,
da wir schon mal beim Cutin sind, kann ich noch ein Bild beisteuern:
Blattquerschnitt bei 470 nm Anregung; das Cutin fluoresziert gelblich.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/182801_31209679.jpg) (http://s767.photobucket.com/user/vonGneisenau/media/Messel_Blatt033_zpsbuhbcquq.jpg.html)
Dasselbe im Durchlicht Hellfeld:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/182801_62258301.jpg) (http://s767.photobucket.com/user/vonGneisenau/media/Messel_Blatt032_zpsw388sidb.jpg.html)
und Hellfeld/Fluoreszenz überlagert:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/182801_50160154.jpg) (http://s767.photobucket.com/user/vonGneisenau/media/ComposedImage1_zpsgvrflffu.jpg.html)
Leider in Caedax eingedeckt, deshalb war keine Anregung bei 365 nm möglich (wegen der Eigenfluoreszenz des Caedax). Die Blätter sehen etwas angegammelt aus. Kein Wunder: sie sind schon etwas älter, etwa 47 Millionen Jahre. Sie stammen aus der Grube Messel. Gezeigt ist ein Paraffinschnitt von etwa 5... 10 µm, ungefärbt - also reine Eigenfluoreszenz des Cutins. Erstaunlich gut erhalten, trotz eines gewissen Alters!
Viele Grüße aus Bonn
Horst Wörmann
Hallo,
interessante Diskussion !
Ich habe ein wenig gewühlt und auch noch ungefärbte Schnitte des Taschentuchbaumes gefunden. Sie wurden 2 Jahre in Ethanol gelagert, fluoreszieren aber trotzdem blau ;)
DPlanApo 40/0,85 UV
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/182805_59311937.jpg) (http://s1314.photobucket.com/user/davidkubon/media/Taschentuchbaum%20ungefaumlrbt%20UV_zpssc2pivae.jpg.html)
UVFL 20/0,65
Und hier noch ein weiteres Beispiel vom Sprossquerschnitt der Purpurtanne. Es ist ebenfalls die Rinde die diese blaue Farbe zeigt.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/182805_51791499.jpg) (http://s1314.photobucket.com/user/davidkubon/media/purpurtanne%20uv_zps2hnkahtf.jpg.html)
Viele Grüße
David
Hallo David -
sehr schöne Aufnahmen! Du schreibst, die Schnitte wurden in Ethanol gelagert - wie ist das zu verstehen?
Gruß
Rolf
Hallo Rolf,
dankeschön ! In den 2 Jahren befanden sich die Schnitte in 70%igem Ethanol in einem Schnappdeckelglas ;)
Grüße
David
Liebe Kollegen!
Ich möchte Euch den ungefärbten 40µm Schnitt einer Zitterpappel bei 365nm zeigen. Die Pappel zeigt das von Euch beschriebene Blau auch in anderen Bereichen des Sprosses.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/182811_48916090.jpg) (http://www.fotos-hochladen.net)
Liebe Grüße
Franz
Lieber Thilo,
wenn ich Dich richtig verstanden habe, willst Du aus den fluoreszenzspektroskopischen Daten lokal aufgelöste Ausagen über die in der Zellwand eingelagerten Komponenten haben. Oder anders ausgedrückt und zurückkommend auf die erste Frage von Rolf:
Was sehen wir da eigentlich? Welche Komponente ist für welche Fluoreszenz verantwortlich?
Im Beispiel von Franz' Zitterpappel ist das einfach: außen Cutin, dann Suberin im Phellem, und weiter die verholzten Zellwände mit Lignin in blauer Fluoreszenz. 'Dazu noch ein bißchen Rot vom Chlorophyll. In diesem Schnitt sind die einzelnen Bereiche sauber getrennt. Was aber, wenn z.B. Berberin eingelagert wird? Dann erhält man eine grünlich-gelbe Mischfarbe, bei der das gelbe Berberin die blaue Farbe überstrahlt. Das haben Rolf-Dieter und ich mal auf der MKB-Seite (http://www.mikroskopie-bonn.de/bibliothek/botanik/index.html#a953) gezeigt.
Wie kann man aus den Fluoreszenzfarben Rückschlüsse auf die Inhaltsstoffe ziehen? Geht das überhaupt?
Jetzt wird's kompliziert, und der Vorwurf, mangelnde interdisziplinäre Zusammenarbeit hätte längst zu einer Lösung geführt, trifft nicht.
Voraussetzung sind technische Lösungen, nämlich das Mikrospektralphotometer, wie das auf meiner Kiste aufgebaut ist und in Wirkungsweise und Anwendung auf der MKB-Seite (http://www.mikroskopie-bonn.de/bibliothek/mikroskopische_technik/index.html#a3901) beschrieben ist. Es ist für den Bastler sogar möglich, orts- und spektralaufgelöste Bilder zu machen, wie Johannes Kropiunig hier vor einiger Zeit vorgeführt hat (leider wurden die tollen Möglichkeiten seines Gerätes seinerzeit nicht erkannt). Bei seinem System wird der (lineare) Eintrittspalt des Spektrometers in der Zwischenbildebene angeordnet und das Präparat dann motorisch verschoben; nennt sich "push-broom"-Verfahren und wird auch kommerziell angeboten. Hyperspektral- und Multispektralsysteme gibt's übrigens eine Menge.
Die Spektraldaten hätten wir nun - wie kommt man nun zur chemischen Zusammensetzung?
Gar nicht :( :(.
Wir haben bei den Fluoreszenzspektren leider immer nur breite Beulen. Ihr Astronomen habt's gut, ihr habt scharfe Spektrallinien, deshalb haben die astronomischen Spektrometer auch so eine hohe Auflösung. H(alpha)-Linie bei soundsoviel nm gemessen, also Wasserstoff. Das geht bei der Fluoreszenz nicht, weil physikalisch bedingt zu wenig Information im Spektrum ist, und das ist die Crux. Ganz anders als bei z.B. Infratrotspektren von Gasen, da hat man wunderbare Rotationsschwingungsspektren! Natürlich gibt es Ausnahmen, wie z.B. die schmalbandige rote Fluoreszenz bei 611 nm des Europiums in den Pigmentfarben auf Banknoten, oder die des Chlorophylls. Ist aber leider selten.
Noch schwieriger wird es, weil die Emissionsspektren ein und desselben Stoffes von der molekularen Umgebung abhängen. Deshalb sieht Rolf auch die unterschiedlichsten Farben in Cuticula und "Holz", je nach Pflanze, Präparation und Anregung. Und noch ein Problem: die chemische Zusammensetzung all dieser Naturstoffe ist nicht konstant.
Kurz zusammengefaßt: es ist grundsätzlich unmöglich, aus den Spektraldaten die Substanzen sicher zu identifizieren.
Das soll erstmal reichen, sonst langweilen sich die anderen Floureszenzler.
Viele Grüße
Horst
Lieber Horst -
danke für die Darstellung der Problematik!
Diesen allgemeinen Zwirn hier möchte ich nicht durch Spezialbeiträge verlängern aber ich will doch noch einen separaten Beitrag verfassen und hier einlinken
http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=24523.0
um zu zeigen, dass man man zwar einen fluoreszierenden Pflanzenstoff nicht durch dessen Spektrum allein identifizieren kann, dass die Fluoreszenz aber dann sehr hilfreich sein kann, wenn man ihn erst kennt.
Viele Grüße
Rolf
Liebe Kollegen,
so, nun ist der Beitrag gelistet.
Herzliche Grüße
Jörg