Hallo zusammen,
ich bin auf der Suche nach der optimalen Ausrüstung zur Lebendbetrachtung von Einzellern. Derzeit arbeite ich mit HF, DF und PH-Kontrast. Ich möchte gerne hochauflösende und farbige Aufnahmen mit einer Digitalkamera machen (Nikon DS mit 5 Megapixeln habe ich mir ausgesucht) und die Auflösung und den Kontrast mit Immersionsobjektiven und DIC steigern. Dazu habe ich jetzt einige Fragen und mich würde die Erfahrung der "alten Hasen" unter Euch sehr interessieren.
Zum einen hätte ich gerne gewusst, ob sich nun Ölimmersions- oder eher Wasserimmersions-Objektive besser eignen (unter dem Deckglas befindet sich Wasser, da wäre es ja naheliegend zu vermuten, dass Wasserimmersionen ein besseres Bild ergeben)?
Von den Top-Herstellern Zeiss, Leica, Olympus und Nikon gibt es recht unterschiedliche DIC-Varianten. Zeiss und Nikon arbeiten mit objektivspezifischen DIC-Slidern im Objektivrevolver und wenigen Prismen im Kondensor, wobei die Zeiss Objektivprismen verstellbar sind. Leica und Olympus arbeiten mit wenigen Prismen oberhalb des Objektivrevolvers und objektivspezifischen Prismen im Kondensor. Bei Olympus und Nikon gibt es neben den Standardprismen auch solche für High Contrast und High Resolution (letztere sollen sich optimal für dickere Objekte eignen). Kann man überhaupt eine Wertung in Bezug auf mein Anwendungsgebiet vornehmen, oder spielen alle Hersteller in derselben Liga und es ist völlig unerheblich, welchen ich wähle? Gibt es große Unterschiede zwischen DIC nach Nomarski (Zeiss, Olympus, Leica) oder Senarmont (Zeiss, Nikon)?
Bei den Preisen für die Optik ist mir aufgefallen, dass Zeiss (bei der EC Plan Neo-Serie) deutlich teurer ist als Leica, Olympus und Nikon. Bei den letztgenannten bekommt man zu den gleichen Preisen schon fast Plan Apos. Ferner gibt es so gut wie keine Vergleichstests zu den vier Herstellern. Hat jemand von Euch Erfahrungen gesammelt und kann eine Empfehlung geben? Oder spielt auch hier der Hersteller keine große Rolle und die Wahl ist mehr eine Sache der persönlichen Präferenz?
Schon mal herzlichen Dank und freundliche Mikrogrüsse,
Andreas
2 wochen zurück hatte ich die Möglichkeit ein neues Nikon 60 X apo (NA 0.95 ) trocken zu testen.
test preparat war ein Coprinus sporen in Euparal eingebettet.
Die qualität was sehr gut and könnte auch vergleichen mit ein 100 X fluor objectiv ( NA 1.35 , öl).
Weil 60 X objective ziemlich kritisch sind , fand ich doch bei Nikon eine sehr gute Ergebnis.
ZitatZum einen hätte ich gerne gewusst, ob sich nun Ölimmersions- oder eher Wasserimmersions-Objektive besser eignen (unter dem Deckglas befindet sich Wasser, da wäre es ja naheliegend zu vermuten, dass Wasserimmersionen ein besseres Bild ergeben)?
Das ist wohl zu naiv gedacht. Wichtig ist, dass der Strahl möglichst ungebrochen durch das Deckglas in das Objektiv kommt, das ebenfalls aus Glas ist. Daher wird gewöhnlich ein Medium mit möglichst hohem und konstantem Brechungsindex (also Öl) genommen. Diese Objektive sind auch leichter zu bekommen als Wasserimmersionsobjektive. Wer also keine Angst vor der "Ölpanscherei" hat, wird schon im mittleren Vergrößerungsbereich (20x - 60x) mit Ölimmersion die besten Bilder bekommen.
Für welche Anwendungsfälle es sich lohnt, ohne Deckglas direkt im Wasser zu arbeiten, müssten mal die Spezialisten beantworten.
Hallo Andreas,
The working distance of high-NA objectives is too small to see the gain in quality of a water immersion over an oil immersion. In brightfield that is, not so for critical confocal work. But it's not 'zu naiv gedacht'!
If you are serious about buying new DIC-stuff, you can and should request trial hours with your own material.
(good luck convincing the sales people).
René.
Hallo Andreas,
zum Thema, direkt im Wasser zu beobachten, kann ich beitragen:
Ich mache das seit Jahren mit dem Wasserimmersions-Objektiv 40x0,75 von Lomo in der Petrischale, habe darüber auch hier im Forum schon mehrmals geschrieben. Es ist für nicht-störende Lebendbeobachtung sehr gut, natürlich als Achromat nicht so hochauflösend wie die teueren Objektive "höherer Ordnung". Zur Zeit wird bei Langner-Voss ein Restposten sehr günstig angeboten. Auf alle Fälle braucht man eine Anpassung an die heute übliche Abgleichlänge von 45 mm, auch dort zu haben. Gerechnet ist es für Endlichoptik, geht aber mit kleiner Einschränkung sogar bei Unendlich.
Zitat von: Rene in Juli 15, 2009, 09:25:00 VORMITTAG
The working distance of high-NA objectives is too small to see the gain in quality of a water immersion over an oil immersion. In brightfield that is, not so for critical confocal work. But it's not 'zu naiv gedacht'!
Hallo,
wieso soll das für Hellfeld anders sein als für confocal?
Wenn wir von high NA reden, also z.B. Öl 1,4 und Wasser 1,2, dann haben die Wasserobjektive, die ich da kenne einen Arbeitsabstand von um die 200 µm, die Öl-Objektive meist einen von <100 µm. Das allein kann schon ein Grund sein, ein Wasserobjektiv zu bevorzugen, je nachdem was man anschauen will.
Was die Auflösung betrifft: mal vorausgesetzt, das Deckglas hat die richtige Dicke von 170 µm (Abweichungen sind hier bei Wasser natürlich schlimmer als bei Öl, da der Brechungsindexunterschied größer ist) dann ergibt sich für eine wässrige Probe etwa zwischen 10 und 20 µm vom Deckglas entfernt rechnerisch die gleiche Auflösung für beide oben genannten Objektive. Dichter dran ist das Ölobjektiv besser (wegen der höheren NA) und weiter weg ist das Wasserobjektiv besser (wegen der geringeren Brechungsindexabweichung). Das sind zugegebenermaßen Zahlen, die mir im Zusammenhang mit confocaler Mikroskopie begegnet sind, deshalb meine Eingangsfrage.
Es käme dann also drauf an, was man anschauen möchte, also wie groß das ist, und wie weit weg vom Deckgglas. Für Objektive mit anderer NA müsste man es entsprechend ausrechnen.
Bei "Wasserobjektiv" bin ich jetzt mal davon ausgegangen, das eins mit Deckglasbenutzung gemeint ist. Es gibt ja auch solche, bei denen das Objektiv direkt ins Wasser eingetaucht wird. Die, die ich von der Sorte kenne, haben Arbeitsabstände im mm-Bereich, bei NAs unter 1.
Leider habe ich was Einzeller angeht mit keinem der genannten Objektive Erfahrung.
Schöne Grüße
Steffen
Wasser- versus Öl-Immersion bei wässrigen Proben, z.B. protozoologischen Objekten:
Moderne Immersionssysteme folgen aus konstruktiven Gründen (Glassorten, Vergütungsbereiche etc.) nicht mehr streng dem Prinzip der homogenen Immersion von Ernst Abbe. Die in den oben stehenden Antworten gegebenen Begründungen treffen daher nicht zu.
Man unterscheidet Öl-, Wasser- und Multi-Immersionssysteme (1973 bei CARL ZEISS erfunden, jetzt als LCI- Systeme bezeichnet. LCI= Live Cell Imaging).
Wasser- und Multi-Immersionssysteme werden für die Verwendung mit Deckglas (0,17 +/- 0.01 mm) oder als direkte Eintauchobjektive (D= 0) sphaerisch korrigiert berechnet. Bei den Objektiven W Korr D=0 ergibt sich als starker Gebrauchswertnachteil, dass der Frontlinsen-Fassungsbereich die Zellen sehr leicht vor sich herschiebt, was eine langandauernde und ruhige Beobachtung von Protozoen unmöglich macht, sobald man den Präparathalter verfahren muss. Diese Objektive W Korr D=0 sind eher etwas für neurobiologische Fragestellungen. Ausnahme hiervon ist das CARL ZEISS Objektiv Plan- APOCHROMAT 20/ 1.0 W (D=0).
Wasserimmersionsobjektive gestatten es im Gegensatz zu den Ölimmersionen dennoch, bei der Untersuchung wässriger Proben, tiefer in dickere Objektschichten hineinzuschauen und ein Bild frei von sphaerischer Aberration zu erhalten (im Extrem bis etwa 400 µm Schichttiefe beim LD C- APOCHROMAT 40/ 1,1 W Korr UV-VIS-IR von CARL ZEISS). Hierzu sind diese zum Ausgleich der von der Probe herrührenden sphaerischen Restfehler, welche durch die wässrige Objektschicht bewirkt werden, mit einem Korrekturring versehen.
Ölimmersionen sind hier empfindlicher, nicht nur wegen der im Gegensatz zu den Wasser-Immersionen höheren Aperturen (> 1,2). Das ist der Grund, warum hier Wasserimmersionen vorzuziehen sind.
In der Regel verlangen alle heute von den 4 Mikroskopherstellern gefertigten Immersionen, die für bedeckte Präparate gerechnet sind, für beste Bildqualität die Benutzung von Deckgläsern exakt 0,17 mm +/- 0.005 mm (diese werden jedoch nur von CARL ZEISS hergestellt und auch vertrieben).
Wasserimmersionen sind fertigungstechnisch sehr aufwändig herzustellen. Daher sind diese sehr hochpreisig. Ein solches Mikroskop kommt mit 3-5 solcher Objektive leicht in die 90 - 100 000 EURO Preisklasse.
Für die Beobachtung von Protisten sind die 160 mm- Optiken von CARL ZEISS, Oberkochen sehr gut geeignet und auch erschwinglicher.
Insbesondere folgende 160mm- Objektive sind besonders für protistologische Untersuchungen im DIC geeignet:
Plan- APOCHROMAT 20x/ 0.65 (DIC- Schieber PN Multi 20/ 0.8), Plan- APOCHROMAT 40x/ 0.95 Korr (DIC- Schieber Multi 40x, Plan 40x), APOCHROMAT 40x/1.0 Öl Iris (DIC- Schieber Plan 40x) und alle Multi- Immersionen Plan- NEOFLUAR 16x, 25x, 40x und das seltene Wasserimmersionssystem 63x/1,25 W Korr (DIC- Schieber Planapo 63x). Schöne und kontrastreiche Bilder macht auch das Plan- NEOFLUAR 63x/ 1.25 Öl (DIC- Schieber Planapo 63x).
CARL ZEISS bietet ebenfalls schon sehr lange verschiedene DIC- Schieber für unterschiedliche DIC- Kontrastarten (HighResolution, HighContrast) an (diese wurden dort bereits 1965 entwickelt und werden dort seit 1967 vermarktet).
Die kleinen DIC- Schieber der 160 mm- Optik von CARL ZEISS, Oberkochen sind alle HR Schieber, die sich für die Untersuchung von Protisten seit langem bewährt haben.
Das von LOMO produzierte Wasser-Eintauchobjektiv ist die (manchmal recht ordentliche) Kopie des von ZEISS 1972 markteingeführten Objektivs 40/ 0.75 W D=0, das durch die schönen Filme von Hans Henning Heunert bekannt geworden ist und lange recht populär war. Eine Aufsteck-Kappe wurde für Untersuchungen von marinen Protisten gefordert, sie gab es auch hierfür. Es war ein sehr guter Achromat mit Flusspatlinse. Auch ERNST LEITZ in Wetzlar hat einmal sehr gute SEEWASSER- Eintauchobjektive gefertigt (die damals übrigens ein Biologe, Prof. Adolf von Stosch, für Leitz berechnet hat).
Zitat von: d65 in Juli 15, 2009, 15:45:55 NACHMITTAGS
wieso soll das für Hellfeld anders sein als für confocal?
¨
Purely practically speaking, compared in brightfield with reduced condenser aperture. Direct experience. I am not talking DIC here.
Zitat
Moderne Immersionssysteme folgen aus konstruktiven Gründen (Glassorten, Vergütungsbereiche etc.) nicht mehr streng dem Prinzip der homogenen Immersion von Ernst Abbe. Die in den oben stehenden Antworten gegebenen Begründungen treffen daher nicht zu.
Can Mr Apochromat forget his sales talk and explain this statement please?
Rene.
Zitat von: Apochromat in Juli 15, 2009, 17:20:52 NACHMITTAGS
Moderne Immersionssysteme folgen aus konstruktiven Gründen (Glassorten, Vergütungsbereiche etc.) nicht mehr streng dem Prinzip der homogenen Immersion von Ernst Abbe. Die in den oben stehenden Antworten gegebenen Begründungen treffen daher nicht zu.
Das ist in der Tat eine ziemlich kryptische Aussage. Was genau gilt weswegen nicht?
Zitat von: Apochromat in Juli 15, 2009, 17:20:52 NACHMITTAGS
In der Regel verlangen alle heute von den 4 Mikroskopherstellern gefertigten Immersionen, die für bedeckte Präparate gerechnet sind, für beste Bildqualität die Benutzung von Deckgläsern exakt 0,17 mm +/- 0.005 mm (diese werden jedoch nur von CARL ZEISS hergestellt und auch vertrieben).
Andere Hersteller sind in der Lage, ihre Objektive so herzustellen, dass man per Korrektur-Ring auf andere Dicken einstellen kann. Bei Zeiss geht das nicht? Komisch. Bei der Spezifizierung mit +/- 5 µm frag ich mich schon, ob das tatsächlich in den offiziellen Anforderungen drinsteht.
Und muss es nicht eigentlich CARL ZEISS MICROIMAGING GMBH heißen?
Sorry, die Spitze konnte ich mir jetzt nicht verkneifen. Zitat von: Rene in Juli 15, 2009, 18:01:08 NACHMITTAGS
Purely practically speaking, compared in brightfield with reduced condenser aperture. Direct experience.
ok, aber wenn der Kondensor (stark?) zugezogen ist, dann dürfte dies vermutlich maßgeblich für die Auflösungsbegrenzung sein, oder? Macht dann die Benutzung von hohen NAs bei den Objektiven überhaupt noch Sinn?
Steffen
Antwort an d65:
Bei allen Herstellern guter Mikroskopoptik, also nicht nur der CARL ZEISS MicroImaging GmbH, gilt das gleiche:
1. Das moderne Mikroskopobjektiv (etwa ab 1982 mit der Einführung der 250 CF- Optik beim VEB CARL ZEISS Jena durch Horst Riesenberg, Manfred Matthae. u.a.) wird im Vergleich zu den älteren Systemen (und hierzu gehört auch die 160 mm- Optik) mathematisch für weite, nicht vignettierende Strahlenbüschel und extreme Feld-Korrekturen ausgeführt. Praktisch merkt man das an der Koma-/ Verzeichnungs- Armut von kleinen in der Bildmitte scharfgestellten Punkten, die dann zum Objektfeldrand hin verschoben werden. Dort kann man dann nach etwas Übung leicht die Bildfehler visuell feststellen und beurteilen. Die nutzbaren und auskorrigierten Sehfelder der modernen Mikroskopobjektive liegen in einem Bereich von Sehfeldzahlen 25 - 26.5 und eigentlich sogar teilweise noch höher. So eine hohe Bildfehlerhebung kann man mathematisch nicht erreichen, wenn man als Hauptbedingung "homogene Immersion" einsetzt, also in der Frontlinse stets Gläser verwenden möchte, welche eine Brechzahl von etwa 1,51 - 1.52 haben. Abbe konnte dies tun und somit das Prinzip der "homogenen Immersion", also die weitgehende Brechzahlgleichheit zwischen Immersionsmittel, Frontlinse und Deckglas (ja bisweilen sogar des Einschlussmittels) einhalten. Man darf aber nicht vergessen, das dieses Prinzip bereits 1938 von Hans Boegehold (Carl Zeiss, Jena) bei der Berechnung des ersten Plan- Achromat 90x nicht mehr streng eingehalten werden konnte, obwohl diese Objektive mit H.I. (Homogene Immersion) graviert waren.
Zusammenfassend kann man sagen, das dass Prinzip der homogenen Immersion aufgegeben werden musste, als die Anforderungen an die Bildkorrektur für grösste Felder umgesetzt werden musste. Dies kann häufig nur mit Gläsern abweichender Brechzahl gerechnet werden. Warum? Dies liegt in den Möglichkeiten der Berechnung des jeweiligen Objektives, diese sind stets und überall auf der Welt ein wohlgehütetes Firmengeheimnis.
Oder anders ausgedrückt: Um diese hohe Bilddefinition, die ja im zentralen Feldbereich auch bei älteren Mikroskopobjektiven mathematisch gut ist, für große Objektfelder (und damit nutzbare Sehfelder) beim modernen Objektiv zu ermöglichen, konnte das Prinzip der homogenen Immersion für vollkommen farb- und ebnungskorrigierte Abbildung nicht mehr aufrecht erhalten werden.
Früher hat man um das Prinzip der homogenen Immersion einhalten zu können, auch bewusst begrenzende Blenden zur Vignettierung in die Mikroskop- Objektive einbauen müssen, weshalb bei ganz genauer Beobachtung die Feldleistung von 160mm- Immersionssystemen am äusseren Bildrand nicht perfekt ist (dies kann man auch bei älteren Plan- APOCHROMAT-Objektiven selbst zu Hause einmal nachprüfen, am besten eignen sich hierzu Stern- Test- Präparate oder fluoreszierende Beads). Da ältere Ölimmersionssysteme nicht so empfindlich auf Deckglasdickenschwankungen reagieren, sind viele der 160mm- Ölimmersionen mit "-" (= indifferent) graviert.
2. Alle Objektive einschliesslich aller Korr-Objektive sind stets (und waren seit ihrer erstmaligen Berechnung durch Abbe 1867 - 1886) für die Grundbedingung "Soll-Deckglasdicke= 0.17 mm" und "Struktur befindet sich direkt an der Deckglasunterseite" gerechnet. Eine Ausnahme hiervon bilden nur die D=0- korrigierten Objektive. Bei Ihnen wird das sphaerisch optimale Bild meist dann erzielt, wenn sich das Objekt in der Distanz des freien Arbeitsabstandes von der Frontlinse entfernt befindet.
Trockenobjektive einer Apertur kleiner etwa 0,6 sind aber nicht so empfindlich gegenüber den praktisch auftretenden Deckglasdickenschwankungen (von etwa 0.1 - 0.23 mm), weshalb diese dann mit "-" (=indifferent) gekennzeichnet sind.
Hat man ein Objektiv mit Korr-Ring, so kann man bei von der stets in der Optikrechnung vorgegebenen Soll-Deckglasdicke (diese beträgt bei allen Objektiven ab einer Apertur von etwa 0,6 und einer Massstabzahl etwa 40:1 genau 0.17 mm +/- 0.01) abweichenden, also "praktisch vorkommenden" Deckglasdicke, die dann stets auftretende sphaerische Aberration innerhalb der mit dem Korr- Ring möglichen Kompensationskraft -und diese ist bei den Systemen durchaus stark verschieden- ausgleichen.
Es ist übrigens unwesentlich, welche Einheit auf der Skala des Korr- Ringes aufgraviert ist (Temperatur, Deckglasdicke, Kammerdicke), es wird immer nur die sphaerische Aberration kompensiert, lediglich mit unterschiedlich starkem Kompensationsbereich. Den stärksten Kompensationsbereich haben Long- Distance Objektive für die Zellkultur, also z.B. die Objektive LD EC Plan-NEOFLUAR Korr.
Hat man es mit einem Präparat zu tun, bei dem die interessierende Struktur im Innern, also entfernt von der Deckglasunterseite liegt, muss der Korr- Ring nachgestellt werden um die sphaerische Aberration zu kompensieren. Hat man jetzt ein Deckglas abweichend von 0.17 mm, so kann der Korr-Ring der durch die Probe verursachten sphaerischen Aberration weniger stark entgegenwirken, da ja jetzt die Deckglasdickenabweichung mit ausgeglichen werden muss. Die Kompensationskraft des Korr-Ringes wird dann verschwendet, was zur Folge hat, dass man "nicht so tief in eine solche Probe hineinschauen kann". Es ist auch so, dass geringfügig dünnere Deckgläser stärker bildverschlechternd wirken, als etwas zu dicke.
Das oben zu den abweichenden Deckglasdicken Gesagte ist jetzt bei der Verwendung von hochauflösenden Wasserimmersionen von praktischer Wichtigkeit: Wasserimmersionen haben im Vergleich zu Trocken- Korr- Objektiven (Ausnahme: das LCI- Korr- Objektiv 25x) nämlich eine relativ geringe Kompensationskraft der sphaerischen Aberration. Diese möchte man für das Präparat nutzen und nicht zum Ausgleich einer sorglos gewählten Deckglasdicke verschwenden.
Zum Schluss möchte ich noch anmerken, das die Wahl der geeigneten Okulare, bzw. Kamera-Adaptionsoptik mit zur Aufrechterhaltung der hohen Fehlerhebung moderner Mikroskopobjektive am Bildfeldrand wichtig ist. Solche Okulare können ohne weiteres den Preis eines guten Routineobjektives übertreffen.
Zitat von: d65 in Juli 15, 2009, 21:24:34 NACHMITTAGS
ok, aber wenn der Kondensor (stark?) zugezogen ist, dann dürfte dies vermutlich maßgeblich für die Auflösungsbegrenzung sein, oder? Macht dann die Benutzung von hohen NAs bei den Objektiven überhaupt noch Sinn?
Steffen
Of course, and again for the second question: of course. I'm using a 60/1.4 routinely on an inverted with condenser NA 0.55. That lowish condenser aperture is a compromise, but it works pretty well for protists in brightfield. It is the absolute max I can get out of my system. Certainly in sedimentation chambers there would theoretically be some gain to be had with a waterimmersion over an oil lens, but practically speaking I have not seen the advantage. I have no access to a full aperture DIC system on my inverted, so I cannot speak for that purpose.
Herr Zölffel, I realise my last comment has been a bit sauer, I apologise for that. Thanks for sharing your knowledge and enthousiasm.
Best wishes, René.
Hallo zusammen,
herzlichen Dank für die Informationen.
Viele Grüße,
Andreas
@ Apochromat:
Vielen Dank für die Mühe
Gruß aus Berlin