Hallo in die Runde,
durch die schönen Gastrotrichenbeiträge von Ole Riemann im letzten Jahr wurde ich neugierig, wie der zelluläre Aufbau von Gastrotrichen ist. Gastrotrichen sind für Mehrzeller wahre Winzlinge und mit ihrer Größe von grob 120µ bedeutend kleiner als so mancher Einzeller. Dennoch beinhalten sie (bei Lepidodermella squamata) ca. 450 Einzelzellen. Ich fragte mich, ob man diese Zellen durch eine entsprechende Kernfärbung sichtbar machen könnte.
Als es zufällig zu einer Massenvermehrung von L. Squamata in einer meiner Proben kam, nahm ich das (noch recht blauäugig) zum Anlass, mich an Dauerpräparaten zu versuchen.
Der folgende Beitrag wurde zweigeteilt, da ich vermute, dass die meisten sich mehr für die Fotos als für die Präparation interessieren. Die Einzelheiten zur Präparation folgen dann im zweiten Post.
Als Nicht-Biologe lässt meine Treffsicherheit bei Fachausdrücken leider manchmal etwas zu wünschen übrig. Deshalb sind Korrekturen und Anmerkungen sehr willkommen. Da das Fotografieren nicht zu meinen Stärken zählt, bitte ich die manchmal etwas dürftige Fotoqualität zu entschuldigen. Alle gezeigten Fotos wurden mit einem 100er Objektiv und einer EOS 1100D aufgenommen.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/189063_40967001.jpg)
Bild1: Übersicht des Zellaufbaus; Färbung mit Eisen-Hämatoxylin nach Weigert; Stack mit Picolay aus 20 Einzelaufnahmen; Histogramm angepasst
Die Eisen-Hämatoxylin-Färbung nach Weigert (EHW) liefert eine scharfe Kernfärbung in Dunkelblau-Schwarz und eine sehr leichte Plasmafärbung. Es wird nur das Gewebe gefärbt. Schuppen etc. sind im Dauerpräparat nicht mehr sichtbar.
Man erkennt in der Übersicht das Mundrohr, den 5-lappigen Kopfaufbau und die Klebedrüsen mit den beiden Kleberöhrchen recht schön. Ich bin kein Fan von gestackten Bilder (obwohl sie zweifelsohne ästhetisch sehr ansprechend sind) wenn man Einzelheiten des Aufbaus transparenter Tiere erfassen will. Durch das ,,digitale Plattdrücken" geht leider die Tiefeninformation verloren. Deshalb wurden im nächsten Bild die Einzelfotos des Kopfbereichs zusammenmontiert. Da die Farbe keine zusätzliche Information bietet wurden die Bilder zu Schwarz/Weiß konvertiert und der lokale Kontrast (und damit leider auch der Dreck) mit ImageJ verstärkt. Die Einzelbilder habe einen Abstand von jeweils ca. 0.5 µ, beginnend mit der ventralen Seite links-oben und rechts-unten mit der dorsalen endend.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/189063_62693659.jpg)
Bild 2: Montage unterschiedlicher Fokus-Ebenen; S/W; lokale Kontrastverstärkung
Mittig erkennt man die radialen Zellen des Pharynx mit ihren meist spindelförmigen Zellkernen. Auf dem Pharynx anliegend befinden sich paarige Zellen mit rundem Zellkern, in denen ich Speicheldrüsen vermute (* im 3. Bild).
Beidseitig des Pharynx befindet sich das Cerebralganglion (das ich im weiteren der Einfachheit halber als Gehirn bezeichne). Man erkennt, dass es ventral in zwei Hörner ausläuft, die sich jeweils in einer Zellkette entlang der Außenseite des Tieres fortsetzen. Geht man mit dem Fokus höher, werden beidseitig des Pharynx die Zellen des Gehirns sichtbar, die der 5-lappigen Kopfform folgen. An der Außenseite der Lappen befindet sich jeweils eine Zelle mit großem Zellkern, in die wohl die Tasthaare münden. Deshalb würde ich diese Zellen als Sinneszellen bezeichnen. Folgt man dem Gehirn dorsal weiter, schließt es sich über dem Pharynx und es zeigen sich zwei kernfreie Zonen die lt. EM-Untersuchungen mit einer faserigen Substanz gefüllt sind, die hier unsichtbar bleibt und wohl eine Nervenverbindung zwischen den beiden Gehirnhälften darstellt (Dorsale Kommissur).
Ein weiterer gut sichtbarer Bereich ist der Klebeapparat des Tieres:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/189063_2642376.jpg)
Bild 3: Montage unterschiedlicher Fokus-Ebenen des Klebeapparates; S/W; zusätzliche Plasmafärbung mit Eosin; lokale Kontrastverstärkung
Dieses Präparat wurde zusätzlich mit Eosin gefärbt, um die Plasmastrukturen sichtbar zu machen. Die Kernfärbung wird dadurch etwas überdeckt und ist nicht mehr so klar. Eosin färbt auch die kutikularen Strukturen leicht an, so dass auch der Aufbau der Haftröhrchen besser sichtbar wird.
An der Basis der beiden Haftröhrchen erkennt man jeweils eine 3-kernigen Zellapparat, der die Klebe- und Lösedrüsen darstellt. Diese Zellen ziehen bis etwa zu einem Drittel in die Haftröhrchen hinein und sezernieren die Klebe- bzw. Löseflüssigkeit in einen feinen, gemeinsamen Kanal.
Im folgenden Bild möchte ich nochmals eine Fokusebenen-Montage eines mit EHW und Eosin gegengefärbtes Exemplar zeigen:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/189063_31575752.jpg)
Bild 4: Montage unterschiedlicher Fokus-Ebenen; S/W; EHW und Eosin; lokale Kontrastverstärkung
Da Eosin auch das äußere Schuppenkleid der Tiere leicht mitfärbt, erkennt man hier recht schön, wie sehr das Gewebe des Tieres durch die Präparation geschrumpft ist. Außerdem ist die das Tier umlaufende Zellkette gut zu erkennen, die ich als Nervenstrang (?) interpretieren würde. Weiterhin fallen caudal zwei prominente Zellkerne auf, in die wohl die caudalen Tasthaare münden (Sinneszellen ?).
Als letztes möchte ich noch – obwohl das Foto nicht sonderlich gut geworden ist – eine (selten gezeigte) Seitenansicht zeigen:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/189063_51798063.jpg)
Bild 5: Seitenansicht; S/W; EHW und Eosin; lokale Kontrastverstärkung
Auch wenn die Frisur des Tieres durch die Präparation gelitten hat, war ich doch erstaunt, wie lang die Bauch-Cilien der Gastrotrichen sind. Prinzipiell sind gefärbte Seitenansichten problematisch, da das Tier zu dick ist, um bei der Färbung einigermaßen transparent zu bleiben. Auch hier ist die Schrumpfung des Gewebes sehr auffällig.
Ich hoffe, die Bilder waren von Interesse für Euch. Im zweiten, mehr technischen Beitrag werden die Qualen der Präparation beschrieben.
Viele Grüße
Michael
Hallo an die technisch Interessierten.
Weiter geht es mit dem zweiten Teil, in dem die Präperatererstellung genauer beschrieben werden soll.
Die Erstellung eines Totalpräparates eines Tieres kann prinzipiell in folgende Teilbereiche gegliedert werden:
Narkose
Fixierung
Färbung
Einschluss
1. Narkose und Fixierung
Da Gastrotrichen die unangenehme Eigenschaft besitzen, sich bei der Fixierung zu einer Kugel zusammenzurollen, ist eine Narkotisierung vor der Fixierung nötig. Dazu habe ich eine 2%-Lösung von MgCl2 (2g von MgCl2-Hexahydrat auf 100ml Wasser) verwendet. Zu einem Teil Probenwasser habe ich ein Teil dieser Lösung zugesetzt, so dass die wirksame Konzentration ca. 1% war. Die Tiere sinken dadurch innerhalb von ca. 1 min entspannt zu Boden und können dann im expandierten Zustand mit 4% Formaldehyd fixiert werden. Da ich die nötige Fixierdauer nicht kenne, habe ich die Tiere ca. 24h in Formaldehyd belassen. Die Fixierung wurde dann mit destilliertem Wasser ausgewaschen.
2. Färbung
Da Gastrotrichen recht klein sind und sich ein verlustloses Herauspipettieren aus den trüben Färbelösungen als unmöglich erwiesen hat, habe ich die Tiere zuerst auf ein Deckglas aufgeklebt. Die Bauchhärlinge werden auf das Deckglas pipettiert und das Wasser soweit wie möglich entfernt. Die Tiere sind klebrig genug, um beim Antrocknen am Deckglas zu haften. Dieser Prozessschritt ist sehr kritisch – zu langes Antrocknen führt zu Austrocknen der Tiere und macht sie zur Präparation wertlos. Wartet man zu kurz, haften sie nicht genügend und gehen bei der weiteren Behandlung verloren. Eine Antrockenzeit von ca. 3 min klappt meist.
Die weitere Behandlung erfolgt dann auf einer Färbebrücke: zwei Abstandshalter (z.B. Bruchstücke eines Objektträgers) werden auf einen Objektträger geklebt und das Deckglas ,,über Eck" aufgelegt. Dadurch ist es möglich, mit einer feinen Pipette die nötigen Flüssigkeiten unter das Deckglas einzubringen und wieder abzusaugen. Der gesamte Färbevorgang kann unter Mikroskopkontrolle erfolgen. Da die Tiere direkt unter dem Deckglas haften, ist auch die Schichtdicke im Präparat ideal.
Für Totalpräparate sollte man eine möglichst reine Kernfärbung anstreben, da nur so die nötige Transparenz des Tieres erhalten werden kann. Für eine reine, im Dauerpräparat haltbare Kernfärbung kommen klassisch nur Färbungen auf Karmin- oder Hämatoxylinbasis in Frage. Karminfärbungen klappen bei einer Fixierung mit Formaldehyd nur schlecht. Deshalb habe ich mich für Hämatoxylin entschieden.
Es gibt prinzipiell zwei Arten der Hämatoxylin-Färbung. Bei den einfacheren Hämalaunfärbungen enthält die Färbelösung bereits die nötige Beize, die die Bindung des Farblacks an die Kerne ermöglicht. Anschließend muss mit leicht alkalischem Wasser ,,gebläut" werden: Die Farbe schlägt nach blau um und haftet dauerhaft an den Kernen, während sie aus dem Plasma wieder ausgewaschen wird. Ich habe Hämalaun nach Mayer ausprobiert, musste aber leider feststellen, dass das Bläuen bei Gastrotrichen nicht klappt. Den Grund vermute ich im pH-Wert der Tiere. Deshalb musste ich auf die aufwändigeren Hämatoxylin-Färbungen mit separater Beize ausweichen.
Ich habe Eisen-Hämatoxylin nach Weigert verwendet, da es in der Anwendung noch recht einfach ist. Man mischt lediglich zwei separate Lösungen kurz vor dem Färbegang und bringt die Mischung für ca. 2 min auf der Färbebrücke unter das Deckglas. Anschließend wird mehrmals mit Wasser gespült, so dass möglichst wenige Färbereste am Deckglas verbleiben. Diese Färbung klappt problemlos und ergibt eine fast reine Kernfärbung.
Möchte man die Plasmastrukturen deutlicher hervorheben, kann man mit Eosin gegenfärben. Nach einer Färbedauer von ca. 5 min ist das Tier vollständig durchgefärbt. Man differenziert nun unter Mikroskopkontrolle mit 70%-Ethanol, bis einem die Färbung blass genug erscheint. Man sollte dabei bedenken, dass im Einschlussmittel die Färbungen kräftiger herauskommen, als man zu diesem Zeitpunkt erwartet.
3. Einschluss
Zum Einschließen habe ich Euparal gewählt. Der Vorteil von Euparal ist, dass es einigermaßen tolerant gegen eine ,,schlampige" Entwässerung ist und kein Zwischenmedium benötigt, um den Alkohol nach dem Entwässern wieder zu entfernen. Folgende Entwässerungsstufen haben sich bewährt :
70% Alkohol, 5 min
90% Alkohol, 5 min
93% Alkohol (Spiritus), 5 min
100% Isopropanol, 5 min, zweimal
Auf einen Objektträger gibt man nun die benötigte Menge Euparal (die genaue Menge ist nicht kritisch, da da Objekt direkt unter dem Deckglas festliegt), und legt das Deckglas mit den Objekten auf. Beim Auflegen sollte man zügig arbeiten, da sonst das Isopropanol am Deckglas verdampft und das Tier austrocknet. Dadurch würde das Präparat verdorben. Ich kann aus Erfahrung sprechen, wenn ich sage, dass es sehr ärgerlich ist, wenn das Isopropanol – sozusagen in der Zielgerade – schneller ist als man selbst. Der Objektträger kann jetzt beschriftet werden und sollte einige Tage eben trocknen.
Bei Gastrotrichen war die Verwendung von Euparal unkritisch. Möchte man andere Tiere präparieren, ist die Verwendung von Euparal gefährlich. Bei meinen Versuchen mit Rädertieren sind mir sämtliche Tiere beim Einschluss in Euparal durch die osmotischen Ströme kollabiert.
Obwohl das Ergebnis meiner Versuche für meine Zwecke ausreichend ist, gibt es noch eine ganze Reihe von Verbesserungsmöglichkeiten, die ich nicht unerwähnt lassen möchte. Zum einen führt die beschriebene Deckglasmethode oft zu verschmutzten Präparaten. Durch das Ein- und Auspipettieren der Färbelösungen ist es oft nicht möglich, diese rückstandsfrei zu entfernen. Da die Rückstände direkt am Deckglas und damit in der Fokusebene verbleiben, sind sie manchmal recht stören. Außerdem gleiten Schmutzpartikel beim Abpipettiern in einem dünnen Wasserfilm am Deckglas und sammeln sich deshalb gerne am Objekt, von wo sie praktisch nicht mehr entfernt werden können. Außerdem stellt sich immer die Frage, in wie weit das Aufkleben des Objekts an das Deckglas Artefakte erzeugt. Ein Aufkleben mit Eiweiß-Glyzerin habe ich zwar versucht, bin aber an meiner eigenen Ungeschicklichkeit gescheitert. Möglicherweise wären andere Handling-Methoden für die kleinen Objekte (z.B. die Färbung in kleinen Gelatine-Kapseln) besser geeignet.
Um die Gewebeschrumpfung zu minimieren wären Versuche mit anderen Fixierung (z.B. mit Essigsäurezusatz) sinnvoll.
In der letzten Zeit habe ich mit einer Färbung durch Borax-Karmin (alkoholisch nach Grenacher) an Rädertieren experimentiert und bin von der Ästhetik und der Feinheit der Zeichnung begeistert. Wenn man Formaldehyd bei der Fixierung vermeidet, wäre eine solche Färbung auch bei Gastrotrichen vielversprechend.
Insgesamt glaube ich, dass die Erstellung von Dauerpräparaten von Gastrotrichen eine lohnenswerte Aufgabe ist. Obwohl bei meinen Präparaten noch sehr viel Verbesserungspotential vorhanden ist, kann man doch bereits durch diese Präparate Einsichten in den Aufbau der Tiere gewinnen, die anders schwer zugänglich wären.
Viele Grüße
Michael
Hallo Michael,
herzlichen Dank für Deinen interessanten und detailreichen Beitrag. Beim Lesen der Schilderungen zur Präparation konnte ich an vielen Stellen aus ähnlichen, eigenen Erfahrungen nachfühlen, was es methodisch für Schwierigkeiten mit sich bringt, mit diesen kleinen Tiere möglichst verlustfrei umzugehen. Wenn man dann noch mit wenig Ausgangsmaterial umgehen und z.B. einzelne Exemplare für REM fixieren, entwässern und dann definiert aufblocken muss, hat man einige kritische Momente zu überstehen.
Für Deine Untersuchungen zur Struktur des Nervensystems ist vielleicht die folgende Arbeit zum Vergleich von Interesse: Rothe H & Schmidt-Rhaesa A (2009) Architecture of the nervous system in two Dactylopodola species (Macrodasyida, Gastrotricha). Hier kommt auch moderne Fluoreszenzmikroskopie mit Antikörpern gegen diverse Strukturen des Nervensystems zum Einsatz.
Hast Du eigentlich auch versucht, ungefärbte Totalpräparate von fixierten Tieren in Glycerin herzustellen? Von meinem letzten Ostsee-Ausflug habe ich noch zahlreiche Xenotrichuliden, die mittlerweile in wasserfreiem Glycerin vorliegen und auf das Eindecken warten. Ich werde mich am Wochenende eventuell mal damit befassen.
Viele Grüße
Ole
Hallo Ole,
Du hast recht, zur Präparateerstellung ist eine gewisse Sturheit und Frustrationstoleranz nötig!
Vielen Dank für die Literaturempfehlung. Damit werde ich mich mal in einer ruhigen Stunde beschäftigen.
Glyteinpräparate habe ich noch nicht erstellt. Ich hatte mich für Euparal wegen des höheren Brechungsindex und der Aushärtung entschieden. Falls ich aber die Osmoseprobleme bei Euparal nicht in den Griff kriege (was ich befürchte) stehen Versuche mit Glyzerin an.
Viele Grüße
Michael
Guten Morgen und danke fuer die Beschreiung zur Praeparation ...
Liebe Gruesse
Gerhard