(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/192036_45300003.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/192036_45360834.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/192036_47854869.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/192036_15892608.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/192036_47617162.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/192036_6146596.jpg)
Hallo Jürgen,
ich habe nun den ersten Beitrag von dir zur Dunkelfeld Fluoreszenz angesehen, denke aber dass Du bei diesen Bildern keinen Sperrfilter genommen hast. Oder doch ? Aber welche Wellenlänge an der Kante? Ich muß doch sauber die Anregungswellenlänge von der Emissionswellenlänge trennen. Schlägt bei diesen Bildern doch noch ein Teil der Anregung durch (großer Blauanteil)?
Grüße
Peter
Hallo Peter,
die Bilder sind mit folgender Kombination aufgenommen:
Anregungsfilter • BG 12/2 mm + BG 38/4 mm.
Sperrfilter • K 490 ( das führt zu einer Überschneidung, besser wäre für die Trennung K 515 oder K 530 ! , den Filter habe ich leider nicht und ich wollte auch den PLOEMOPAK mit dem Filter LP 515 nicht einsetzen).
Mir kam es hier darauf an, einen nicht aufwendigen Weg aufzuzeigen. Der Blaustich hat mich dabei nicht gestört, ich hätte ihn ja auch digital korrigieren können !
Beste Grüße
Jürgen aus Hemer
Hallo Jürgen -
Das sind zwar sehr schöne Dunkelfeldaufnahmen, aber welchen Anteil Fluoreszenz an dem "Blaustich" hat lässt sich daraus nicht entnehmen. Dieses schöne Blau wird eigentlich meist durch UV angeregt, aber ein BG 12 lässt doch bei 495 noch so viel durch, dass eine (meist schwache) Blaufluoreszenz davon überstrahlt würde.
Viele Grüße
Rolf
Hallo Rolf,
wie groß der Fluoreszenzanteil ist, kann man leider nicht genau sagen, da der Reintransmissionsgrad des BG 12 bei K490 noch etwas über o,20 liegt. Eine saubere Trennung ist daher erst beim Einsatz des Filters K 530 vorhanden.
Wenn man das von mir beschriebene Verfahren mit einem Filter K 530 oder OG 530 / 2 mm durchführt ist die Fluoreszenz einwandfrei. Das Bild wird sich allerdings dabei nicht sehr viel ändern.
Viele Grüße
Jürgen aus Hemer
Hallo Jürgen,
wenn der Aufwand nicht zu groß ist so würde ich gerne sehen wie es mit einem OG530 als Sperrfilter aussieht. Ein BG12 mit 4mm wäre natürlich auch günstiger. Ich glaube z.Zt. nicht so recht an Fluoreszenz, sondern an "Falschlicht". Aber ich kann es natürlich nicht beweisen.
Gruß
Peter
Hallo Jürgen -
mit der Leitz-Nomenklatur bin ich nicht sehr vertraut. Ich nehme aber an, dass K "Langpass-Kantenfilter" bedeutet. Nun lässt der K490 noch etwas Blau durch, das Fluoreszenz sein kann aber auch ein Teil des Anregungslichtes. Ein K 530 sollte allerdings keines mehr durchlassen - die Fluoreszenz müsste dann grün aussehen, wenn sie einen Grünanteil hat - oder verschwinden, wenn es sich um rein blaue Fluoreszenz handelt.
Viele Grüße
Rolf
Hallo Rolf,
vielen Dank für deine informativen Anmerkungen. Von mir zur weitergehenden Information die Reintransmissionsgrade von BG 12 und BG 38 sowie
der Transmissionsgrad des Kantenfilters K 490.
Viele Grüße
Jürgen aus Hemer
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/192060_41858544.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/192060_4586304.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/192060_5057096.jpg)
Hallo Peter,
deine Vermutungen " Falschlicht " kann ich nicht widerlegen. Zu dem Verfahren möchte ich jedoch ergänzend ausführen.
Der Dunkelfeldkondensor lässt die Beleuchtungsstrahlen so flach in das Präparat eintreten, dass sie das Objektiv des Mikroskops gar nicht erreichen.
Dieses nimmt nur die vom schräg angestrahlten Präparat herkommenden Streustrahlen auf. Damit erhält man in der Fluoreszenz eine saubere
Trennung von Anregungs-und Emissionsstrahlung. Nach meiner Erfahrung bringt dabei auch das nur 2mm dicke Anregungsfilter BG 12 meistens
schon brauchbare Ergebnisse. Bei dickeren Filtern reicht nach meiner Erfahrung die Leistung der Halogenlampe 12 V 100 W oft nicht aus und es sind stärkere Lichtquellen erforderlich.
Über die rege Diskussion freue ich mich.
Beste Grüße
Jürgen aus Hemer
PS. Auch das Sperrfilter kann nach meiner Erfahrung wegen der beim Dunkelfeld nur vorhandenen Streustrahlen schwächer und nicht so streng sein !
Hallo Jürgen,
mache doch einfach einen Negativversuch. D.h. bringe z.B. ein Geflecht von einem feinen Stahlgitter oder einem Objekt, was mit Sicherheit keine Fluoreszenz zeigt auf den Objekttisch. Dann darf nach Deiner Methode doch kein Bild entstehen. Falls aber doch ..... ? Auch einfache Streupräparate von Diatomeen (wenn möglich in Caedax) könnten als Test dienen.
Achtung:
Naphrax, Styrax, ZRAX fluoreszieren ! http://www.mikroskopie-ph.de/Fluoreszenz-Medien.jpg
Ich bin gespannt.
Gruß
Peter
Hallo Jürgen -
von dem flach eingestrahlten Licht wird ein großer Teil ganz normal in alle Richtungen gestreut und ist gar nicht an der Fluoreszenzanregung beteiligt - sonst könnte man ja gar kein normales Dunkelfeld machen. Das ist übrigens auch bei der Auflichtfluoreszenz so - auch hier muss dieses direkte Streulicht vom Sperrfilter blockiert werden.
Bei schmalbandiger UV-Anregung würde das Streulicht zwar nicht sofort stören - man sieht es ja nicht. Aber für die Augen wäre es sicher nicht gesund.
Viele Grüße
Rolf
P.S. Es gibt in der Zoologie tatsächlich mehr blaufluoreszierende Substanzen als in der Botanik, deshalb wäre es schon von Interesse diese Sache gemäß der Anregung von Peter genauer abzuklären.
Guten Morgen Peter und Rolf,
vielen Dank für eure Hinweise und Vorschläge, ich werde diesen nachgehen und dann darüber berichten.
Beste Grüße
Jürgen aus Hemer
Hallo Mikrofreunde,
vorab zeige ich zur weiteren Information die Ergebnisse meiner Untersuchungen von gestern Abend.
Bild 1 + 2 : Hahnenhechel mit normalem Dunkelfeld ohne Filter
Bild 3 + 4 : Hahnenhechel DL - DF - FLUO mit Violett - Anregung
Anregungsfilter: Bandpassfilter BG 3 / 3 mm (Farbe blau) siehe auch Transmissionsgrad-Diagramm Bild 5
+Bandpassfilter BG 38 / 4 mm ( Farbe helles blaugrün) als Rot-Absorptionsfilter
Sperrfilter : Langpassfilter (Kantenfilter) K 490 (Farbe gelb)
Diese Filterkombination führt zu einer besseren Trennung zwischen Anregungsfilter und Sperrfilter sowie
zur Unterdrückung der Nebendurchlässigkeit im roten Spektralbereich.
Bild 5 : Transmissionsgrad-Diagramm von Filter BG 3 / 3
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/192112_2427122.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/192112_42111654.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/192112_15976275.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/192112_47843779.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/192112_50201689.jpg)
Viel Vergnügen beim Anschauen.
Beste Grüße
Jürgen aus Hemer
Hallo Jürgen -
sehr schönes Dunkelfeld und Blau! Mich wundert nur, das Dein Sperrfilter (Kantenfilter gelb, 490 nm) solch ein prächtiges Blau überhaupt durchlässt - meine beiden hellgelben Kantenfilter (davon einer Interferenz) lassen nur blaugrün durch, obwohl deren Kante sogar bei 470 nm liegt.
Viele Grüße
Rolf
Hallo Jürgen,
es gibt auch noch einen Punkt zu bedenken. Die Schott GG-Filter haben teilweise eine unangenehme Eigenfluoreszenz.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/192130_18992107.jpg)
GG17 ist als stark fluoreszierend bekannt und dient nur als Referenz.
Die gezeigten Filter wurden von einer UV-LED @ 365nm durchleuchtet. Damit sieht man auch, dass selbst über 550nm noch ein Anteil an Strahlung bei dieser Nichia UV-LED abgegeben wird. Weniger Eigenfluoreszenz haben die alten Kodak Wratten Filter Z.B.: UV-Sperrfilter 2B mit einer Kante bei 410nm.
Ich will heute noch am Spektralfotometer eine Kombination von BG3 / 3mm + BG38 / 4mm + GG495 / 1mm (oder GG515 / 1mm) messen um zu sehen wie gut bei der Anregung die Sperrfilter wirken. Ich hoffe ich schaffe es noch.
Gruß
Peter
Hallo Peter und Rolf,
den von Peter vorgeschlagenen Negativversuch habe ich jetzt durchgeführt. Ich habe dafür ein Objektmikrometer verwendet.
Versuchsablauf 1. Schritt
Darstellung des Objektmikrometers mit PL - DF + Filter BG 38/4, kein Sperrfilter.
Bild 1: PL APO 16/0.40 • Tubusfaktor 1.0 x • Vergrößerungsfaktor 1.0 x • Sehfeld ø ≈ 28/16 ≈ 1.75 mm.
Bild 2: PL APO 16/0.40 • Tubusfaktor 1.0 x • Vergrößerungsfaktor 1.6 x • Sehfeld ø ≈ 28/16 x1.6 ≈ 1.09 mm
Versuchsablauf 2. Schritt
DL - DF - FLUO mit Violett-Anregung
Auflegen von Anregungsfilter BG 3/3 und Einsetzen des Sperrfilters K 490
Visuell: Schwarzes Sehfeld, kein Bild !
Kamera: ISO 3200 • Belichtungszeit 1 s • schwarzes Display • kein Bild !
Fazit
Das bei der Primärfluoreszenz fotografierte Bild ist ein 100 % Fluoreszenz-Bild !
Versuchsablauf 3. Schritt
DL - DF - FLUO mit Blauviolett-Anregung
Auflegen von Anregungsfilterr BG 12/ 2 und Einsetzen der Sperrfilters K 490
Visuell: Schwarzes Sehfeld, kein Bild !
Kamera: ISO 400 • Belichtungszeit 1 s • schwarzes Display • kein Bild !
ISO 800 • Belichtungszeit 1 s • schwaches, unscharfes Bild, die Kamera kann nicht scharf gestellt werden !
ISO 3200 • Belichtungszeit 1 s • unscharfes Bild, die Kamera kann nicht scharf gestellt werden !
Fazit
Trotz der nicht optimalen Filterkombination ( Überschneidung Anregungsfilter / Sperrfilter ) hat das bei der Primärfluoreszenz fotografierte
Bild einen hohen Fluoreszenz-Anteil. Durch die Wahl eines Sperrfilters K 530 lässt sich der Fluoreszenz-Antei optimieren.
Zur weiteren Information hänge ich noch folgende Bilder an.
Bild 1: DL - DF + BG 38/4 • ISO 800 • 1/8 s.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/192133_5486421.jpg)
Bild 2: DL - DF + BG 38/4 • ISO 800 • 1/5 s.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/192133_45562356.jpg)
Bild 3: DL - DF - FLUO • BG 12/2 • K490 • ISO 800 • 1 s.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/192133_37040123.jpg)
Bild 4: DL -DF - FLUO • BG 12/2 • K490 • ISO 3200 • 1s.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/192133_56192840.jpg)
Hallo Peter, noch vielen Dank für deinen Versuchs-Tipp, man kann damit doch relativ einfach die Fluoreszenz-Qualität abschätzen !
Viele Grüße
Jürgen aus Hemer
Hallo Peter,
mein Beitrag über den Negativversuch um 15:36:53 Uhr hat sich mit deinen Ausführungen, auf die gespannt bin, überschnitten.
Man findet ihn durch Anklicken des Buttons auf der Seite !
Beste Grüße
Jürgen aus Hemer
Eben habe ich festgestellt, dass der Beitrag auf der regulären Folgeseite auch vorhanden ist !!!
Hallo Jürgen,
frisch gemessen !
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/192147_59389449.jpg)
Im Bereich 500nm - 1000nm bleibt die Transmission < 0,1%. Somit ist die Kombination auch mit einer Halogenleuchte sehr gut.
Nun sollte ein GG495 / 1mm als Sperrfilter gut sein.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/192147_55279532.jpg)
Ich habe nicht schlecht gestaunt, dass unter 480nm noch eine so große Transparenz vorhanden ist. Also im Schott Filterkatalog nachgeschaut - ja es stimmt. Das GG495 in nur 1mm Stärke läßt noch reichlich durch.
Mit einem OG515 / 1mm war das Maximum nur noch 0,001% unterhalb von 500nm.
Sehr vorsichtig formuliert : Es könnte der blaue Untergrund also von der schlechten Sperrwirkung des GG Filter herrühren.
Nun schöne Ostern.
Gruß
Peter
Hallo Peter,
vielen Dank, dass Du heute noch gemessen hast. Nach meinen Feststellungen hat das tiefgelbe Filter K 490 allerdings eine Dicke von 2 mm.
Vermutlich besteht es aus dem Schott Gelbglas GG 495, das Du mit 1 mm gemessen hast. Vielleicht rührt der blaue Untergrund trotz der größeren
Dicke des Filters davon her. Mich stört das schöne Blau allerdings nicht.
Beste Grüße und noch schöne Ostertage
Jürgen aus Hemer