Liebe Mitmikroskopiker,
ich hoffe auf eure Ideen zur Einbettung von Insekten in Kunststoff, insbesondere in Technovit 7100.
Technovit 7100 ist ein Glycolmethacrylat. Es ist mischbar mit Wasser. Das Objekt kann daher Wassergemischen mit steigender Technovitkonzentration ebenso entwässert werden, wie mit steigenden Alkoholkonzentrationen. Ich habe bisher, wie bei meiner Paraffineinbettung mit steigenden Isopropanolstufen entwässert.
Sodann bin ich nach der Anleitung verfahren:
Einbetten in Technovit 7100/ Iso 100 zu gleichen Teilen.
Dann Technovit pur ebenfalls 24-48 Stunden, die Anleitung nennt das Präinfiltration.
Hiernach die Infiltration mit Technovit 7100 mit Härter 1, die eigentliche Infiltration. Zwischendurch Agitation in einer Art Schüttler und leichtes Vacuum.
Es schließt sich der eigentliche Einbettungsschritt mit Technovitflüssigkeit, Härter 1 und Härter 2 an, laut Anleitung.
Die Anleitung findet sich hier:http://kulzer-technik.de/media/webmedia_local/kulzer_technique/media_4/downloads_4/gebrauchsinformationen/GBA_Technovit_7100.pdf oder hier:http://kulzer-technik.de/media/webmedia_local/kulzer_technique/media_4/histologie_1/Prospekt_Histologie_deutsch.pdf
Die Zeiten der Infiltrationen habe ich gegenüber der Anleitung sukzessive von Versuch zu Versuch verlängert, und zwar bis zu 48 Stunden.
Das Ergebnis ist nahezu immer gleich. Nach dem Festwerden des Kunststoffes zeigt sich stellenweise etwas wie ein silbriges Häutchen um das Insekt. Beim Schneiden stellt sich deren Ursache heraus: Das Insekt ist nicht fest mit dem umgebenden Technovit verbunden. Vielmehr fällt das Objekt zumindest teilweise aus dem Schnitt heraus. Es bleibt zwar an manchen Stellen mit der Kunststoffumgebung verbunden. Aber das Objekt wellt sich und dreht sich in andere Richtungen als der übrige Schnitt.
Das Ergebnis ist dem einer schlechten Paraffineinbettung vergleichbar. Auch dort kann das Objekt sich ja aus dem Schnitt nach einer schlechten Durchtränkung mit Paraffin herauslösen.
Der Technovitschnitt will auf Wasser gestreckt sein. Das geschieht blitzartig, sobald der Schnitt mit dem Wasser in Berührung kommt. Wenn dann das Objekt keine feste Verbindung zur Umgebung hat, insbesondere in andere Richtungen gedreht ist, als seine Umgebung, gibt es schnell nur Gekrumpel.
Hier habe ich einen Schnitt als Beispielobjekt herausgesucht. Insgesamt ist der Schnitt nicht doll, insbesondere auch was die Färbung angeht. Aber darum soll es hier auch nicht gehen. Für meine Probleme ist es ein gutes Beispiel.
Es handelt sich um eine Nymphe der Rhododendronzikade, deren Speicheldrüse mich besonders interessiert.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/206391_61339327.jpg)
Rechts am Kopf hängt die Technovitumgebung noch einigermaßen fest am Objekt.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/206391_31884449.jpg)
Überall sonst hat sich das Objekt aus der Technovitumgebung völlig gelöst. Dabei ist das Objekt teilweise geradezu zerrissen worden.
Hier noch ein Detail aus dem obigen Bild stärker vergrößert:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/206391_32194030.jpg)
Bei 1 hat möglicherweise der Zug sogar ein inneres Organ zerissen. Bei 2 zeigt sich, dass das Technovit durchaus eine feste Verbindung mit dem Integument eingegangen ist. Meine erste Vermutung, dass Technovit keine gute Verbindung mit Chitin eingeht, ist also wohl möglicherweise nicht richtig.
3 ist ein Beispiel für viele Falten, die das umgebende Technovit schlägt.
Mir fällt weiterhin auf, dass die Technovitumgebung stärker fuchsinrot gefärbt ist, als die Leerstellen im Inneren des Objekts. Besonders deutlich ist dies bei dem Hohlraum, der Saugpumpe, etwa in der Mitte des Insekts (Bild1). Dieser Hohlraum ist nahezu gar nicht gefärbt. Kann man daraus schließen, dass dort wenig bis kein Kunststoff eingedrungen ist?
Weiterhin fällt mir auf, dass der zurückgezogene Kunststoff nahe beim Insekt stärker gefärbt ist, als in einiger Entfernung von ihm. Eine Erklärung habe ich nicht.
Ich kann mir zwei Ursachen für das Lösen des Insekts aus dem Schnitt vorstellen:
1. Die Infiltration mit der Technovitflüssigkeit ist ungenügend. Hierdurch verläuft die Polymerisation unterschiedlich. Der Kunststoff zieht sich innen und außen unterschiedlich stark zusammen.
2. Das Integument ist eine Polymerisationssperre.
Zunächst dringt möglicherweise die Einbettungsflüssigkeit mit Härter 2, der die Polymerisation auslöst, nicht so schnell in das Insekt ein, wie die Polymerisation außerhalb des Insekts bereits abläuft. Allerdings dürfte auch bei der Einbettung gewöhnlicher Gewebe die Einbettungsflüssigkeit nicht vollständig in das Objekt eindringen. Wenn das Gewebe in diese Flüssigkeit eingelegt wird, beginnt die Polymerisation nämlich innerhalb von 20 Minuten und wird innerhalb von zwei Stunden fest. Gleichwohl verläuft bei gewöhnlichen Geweben die Polymerisation von außen nach innen vollständig durch das gesamte Objekt.
Weiterhin könnte das Integument bei Insekten die Verkettung während der Polymerisation teilweise verhindern; die Polymerisation könnte wegen der Integumentsperre also nicht von außen nach innen fortschreiten.
Wenn 1 die Ursache wäre, müsste für eine bessere Infiltration gesorgt werden. Hierzu fällt mir nur noch der Versuch mit anderen Lösungsmitteln ein, nachdem die Verlängerung der Zeiten nichts gebracht hat. Aceton? Ethylalkohol?
Vielleicht wäre auch Technovit 8100 eine Lösung, da dieser Kunststoff nach den Datenblättern eine geringere Viskosität hat und daher besser eindringen könnte.
Wenn 2 die Ursache sein sollte fällt mir wenig ein. Um das Eindringen zu erleichtern, habe ich das Abdomen schon vor dem Fixieren abgeschnitten. Ich habe außerdem den Block noch in der Polymerisationsform weiter erwärmt, um die Polymerisation innen wie außen zu vervollständigen.
Für jede Anregung bin ich dankbar.
Denn prinzipiell kann man mit dem Kunststoff schöne Ergebnisse erzielen. Hier ein Bild der Speicheldüse aus dem obigen Schnitt.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/206391_26228626.jpg)
1 Thorakalganglion, 3 Speicheldrüse, 2 Speicheldrüsemgänge, 4 Unterschlundganglion.
Und sehr schön kann es werden, wenn das Organ aus dem Tier herauspräpariert wird:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures005/206391_44886821.jpg)
Das aber ist ein mühsames Unterfangen. Die Speicheldrüse misst noch keinen Millimeter.
Schöne Grüße
Jürgen
Hallo Jürgen,
ev. ist eine Methacrylateinbettung besser geeignet, hier ein link zu einem ähnlichem Problem:
http://www.zobodat.at/pdf/ENTAU_0013_0096.pdf
Ich erinnere mich, dass wir im Histolabor früher ach Methacrylateinbettungen von Skorpion-Augen gemacht haben, ebenso Præparate mit harter Cuticula.
Gruß,
Michael
Jürgen,
Es ist Montagmorgen und ich habe sogar Zeit um was an Histologie zu Machen. Fantastisch doch, Urlaub ist eine sehr angenehme Sache und hatte gerne mehr davon, kommt aber!
Dein Problem ist mir auch gut bekannt und habe leider noch nicht die Lösung. Was ich aber wohl weis ist: Suche mal am Internet nach ein vollständigen Kunststoff schnitt von ein Insekt ohne Falten, Locher usw. So ein Schnitt findest du nicht. Das du Probleme hast um die Organe im inneren von das Integument gut zu infiltrieren mit Kunststoffe ist nicht so besonders denke ich, das haben mehrere Histologen. Auch ich mag es sehr um Übersicht Bild zu haben weil das meist sehr viel Aussagekraft hat. So sieht man wenigstens wie die verschiedenen Organe und Geweben geordnet sind.
Aber ich sehe auch dein Bild von die Speicheldrüse Zellen. Der ist doch fantastisch so schön, oder!
Hier muss gut Fixiert, Infiltriert und Polymerisiert sein sonst kannst du nicht so schneiden und kannst du nicht so viel an Detail sehen. Die Infiltrierung mit Kunststoff ist nur nicht vollständig und da liegt das Problem. Ich mochte gerne hilfsbereit sein und probieren das Problem zu lösen oder wenigstens zu verbessern. Technovit 8100 könnte besser geeignet sein, ich weiß es nicht. Kann es aber bekommen und also testen. Vielleicht könntest du mir noch was Fixierungsvorschlage für Insekten machen.
Gruße Ronald
Hallo Jürgen,
Ich habe keine Erfahrung mit Kunstharz, aber bei Einbettung in Paraffin kann man dem Block mehr Struktur geben, wenn man den Arthropoden vorher in Agarose einschliesst.
Arthropoden fixieren (auch wichtig fuer die Entwachsung der Citicula), zurueck in Wasser, einschliessen in 0.7% Agarose, erkalten lassen, einen Block mit dem Arthopoden + 1-2 mm an allen Seiten, dann durch die Alkoholreihe und Einbettung im Agarblock. Der Agar schrumpft schoen um das Objekt herum und macht den Block um das Objekt haerter, so dass duennere Schnitte gelingen. Ausserdem laesst sich das Objekt so leichter hantieren.
Vielleicht etwas, dass Sie ausprobieren koennten?
Beste Gruesse,
Jon
Lieber Michael,
an eine Methacrylateinbettung hatte ich zwar gedacht. Technovit 9100 wäre hierfür vielleicht eine gute Wahl. Allerdings habe ich die Methode wegen der regelmäßig damit verbundenen Gefahrstoffe erst einmal verworfen. Aber herzlichen Dank für Deinen Hinweis.
Ronald: Ich wäre sehr daran interessiert, zu wissen, ob eine Technovit 8100 Einbettung besser verlaufen könnte, als die Einbettung über 7100. Ich habe auch schon einmal daran gedacht, die ersten Einbettungsschritte über einen wesentlich längeren Zeitraum als 48 Stunden mit Technovit 7100 auszuprobieren. Das Gemisch mit Härter 1 soll ja gekühlt bis zu einem Monat halten.
Natürlich sind einzelne Stellen im Präparat immer schön. Mein Problem sind nur Serienschnitte. Wenn Du ein Organ einmal vollständig durchscannen willst, brauchst Du die. Und wenn der Schnitt sich regelmäßig halb aus seiner Umgebung löst fällt es mir schwer, alle Schnitte immer gleichmäßig gut zu strecken, sprich hinnehmbar gut ohne Krumpelei auf den OT zu bekommen. Die Ausschussquote ist zu hoch.
Ich fixiere meine Insekten regelmäßig mit alk. Bouin Dubosq Brasil.http://stainsfile.info/StainsFile/prepare/fix/fixatives/dubosq-brasil.htm Alternativ mit Davidsons Fixativ, was mehr oder weniger eine AFE Lösung ist. Nach Bouin gut waschen in 70er Alk. oder Iso. Ein alk. Fixativ scheint mir sinnvoll zu sein. Es durchdringt die Cuticula gut und schnell und entfettet die oberste Schicht des Integuments. Eine Alternative über Carnoy (Chloroformhaltig) habe ich einmal versucht, war aber damit nicht sehr erfolgreich. eine reine Formolfixierung bei ganzen Tagmata fand ich im Ergebnis auch nicht so gut. Für isolierte Organe nehme ich allerdings Formalin in Puffer.
Lieber Jon,
Ihre Idee klingt gut. Allerdings gibt man damit vielleicht den wesentlichen Vorteil der Glycolmethacrylateinbettung aus der Hand: Einbettung ohne große Wärme. Ich habe keine Erfahrung mit der Agareinbettung.Wenn ich Sie aber richtig verstehe, soll das Insekt ja nur kurz in den Agar, der sofort hart werden, erkalten soll. Das Insekt soll also nur von Agar äußerlich umhüllt werden? Ich habe eben im Netz versucht, etwas darüber herauszufinden, ob der Agar die Polymerisation unterbinden oder beeinträchtigen könnte. Wissen Sie etwas hierüber?
Herzlichen Dank an alle für eure Vorschläge!
Schöne Grüße
Jürgen
Zitat von: Jürgen H. in Dezember 19, 2016, 20:32:27 NACHMITTAGS
Ich habe keine Erfahrung mit der Agareinbettung.Wenn ich Sie aber richtig verstehe, soll das Insekt ja nur kurz in den Agar, der sofort hart werden, erkalten soll. Das Insekt soll also nur von Agar äußerlich umhüllt werden? Ich habe eben im Netz versucht, etwas darüber herauszufinden, ob der Agar die Polymerisation unterbinden oder beeinträchtigen könnte. Wissen Sie etwas hierüber?
Hallo Juergen,
Der Agar wird bei 100C in Wasser geloest (0.7 %), dann auf 40C abgekuehlt, das Insekt hineingelegt und bei 30C erstarrt der Agar. Dann wird ein kleiner Block mit dem Insekt in Agar herausgeschnitten und wie gewohnt weiter verarbeitet. Das sieht aus wie Aspik, nur kleiner: http://static.chefkoch-cdn.de/ck.de/rezepte/46/46494/22369-960x720-hering-in-aspik.jpg
Ob das die Polymerisation beeinflusst weiss ich nicht. Das Gel hat nur 0.7 % Agargehalt; die Idee ist also, dass alle anderen Stoffe leicht durch dieses weitmaschige Gel hindurchwandern. Bei Paraffin geht das problemlos, bei Technovit habe ich keine Ahnung. Es kaeme also auf einen Versuch an.
Ich wuerde uebrigens die Speicheldruesen komplett entnehmen und direkt im Agar einschliessen und dann einbetten.
Mir ist noch eingefallen, dass letztlich das Innere der Zikade zu weich ist (gegenueber der Cuticula und/oder dem Kunstharz). Ist also doch zu wenig Kunstharz im Inneren des Insekts? Man kann groessere Insekten durchaus zum Schluss noch einmal direkt mit dem Kunstharzmix zu injizieren.
Viel Erfolg,
Jon
Jürgen,
Ja Technovit 9100 ist für mein Histo Labor auch was zu aufwendig um vernünftig zu testen. Technovit 8100 aber lasst sich machen und ich werde mal sehen ob ich was bekommen kann und mache dann ein Test. Ich werde verschiedene Fixierungen durchfuhren und vor all auch verschiedenes an Infiltrations verfahren testen. Du schreibst das du mal versuchen möchte um das Technovit 7100 mit Härter 1 langer wie 48 Stunden zu gebrauchen. Das mache ich meist auch so, ist kein Problem. Wenn Kuhl gelagert dann fangt es so in zwei Wochen an etwas mehr Viskoser zu werden. Für unsere Zwecke dann schon zu Dick. Dick wie Honig ist es dann erst in ein Monat.
Um Serienschnitte zu machen ist bei mir im Prinzip kein Problem. Wenn das Block richtig ,lauft' dann kann ich am Historange jede Schneidevorgang ein Schnitt von 1,5µm abnehmen. Habe ich aber noch nie gemacht. Gestern z.B. habe ich noch ein Technovit 7100 Mucke geschnitten und da hatte ich auch dasselbe Problem aber den Schnitt an sich ist prima gelungen.
Um den zukünftigen Test durch zu fuhren brauche ich mehrere Insekten die unbedingt alle gleich sein sollten. Vielleicht muss ich mich mal ein Drosophila Pärchen besorgen und den nachwuchs betäuben und Fixieren. So bleibt die Aussagekraft hoch genug um sinnvolles zu melden.
Gruße Ronald