Hallo liebe Mikroskopiergemeinde,
nachdem ich mich an erste Einbettungsversuche gemacht habe, nun auch mein erstes Problem mit dem Schnippeln. Wie kann ich verhindern, dass sich meine PEG-Schnitte beim Schneiden aufrollen bzw. wie kann ich sie wieder entrollen?
Zur Vorgehensweise:
Es geht um das Schneiden von z.B. Fruchtknoten.
1. Fixieren (da Formaldehyd auch für angehende Apotheker kaum zu bekommen ist in Ethanol (ca. 70%) und Essig)
2. Einbettung in PEG 1500 wie im Kremer beschrieben.
3. Schneiden im Schlittenmikrotom bei Raumtemperatur (ca. 24 Grad C im Moment), mittels Einmalklingenhalter und handelsüblicher Rasierklinge (ist das vll. der Fehler?)
Leider kommt es immer wieder zu starkem Aufrollen der Schnitte. Habe schon ein wenig verschiedene Faktoren verändert (Deklinations- und Inklinationswinkel), jedoch ohne Erfolg. Die Schnittdicke beträgt zwischen 5 und 10 µm.
Bei zusammenhängenden Strukturen ist das ja kein Problem, aber bei z.B. Blüten gelingt es mir nicht, den Schnitt ganz auf den Objektträger zu bringen ohne das alles in seine Einzelteile zerfällt. Ist PEG für solche Vorhaben überhaupt geeignet?
Gibt es vll. eine Möglichkeit diese mit einem warmen lipophilen LM wieder zu strecken? Habs mit Isoprop probiert, klappt aber nicht wirklich.
Es würde mich sehr freuen an Eurer Erfahrung teilhaben zu dürfen :)
Viele Grüße aus Münster,
Fabian Herrmann
Zitat von: EugenOnegin in August 19, 2009, 16:40:59 NACHMITTAGS
...
Bei zusammenhängenden Strukturen ist das ja kein Problem, aber bei z.B. Blüten gelingt es mir nicht, den Schnitt ganz auf den Objektträger zu bringen ohne das alles in seine Einzelteile zerfällt. Ist PEG für solche Vorhaben überhaupt geeignet?
...
Viele Grüße aus Münster,
Fabian Herrmann
Hallo Herr Herrmann,
Sie haben recht, zusammenhängende Strukturen lassen sich mit PEG eigentlich gut schneiden. Wenn Sie Strukturen schneiden wollen, die nicht zusammenhängend sind, müssen Sie in Paraffin einbetten.
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter Müller
Lieber Herr Müller,
vielen Dank für die schnelle Antwort. Schade, dass das mit PEG nicht klappt, werde dann wohl auf Paraffin umsteigen müssen.
Habe Sie vll. einen Tipp für eine Bezugsquelle? Dem Romeis (16. Aufl.) und Kremer kann ich da nicht viel entnehmen.
Viele Grüße und Danke,
Fabian Herrmann
Hallo Fabian Herrmann,
Vor einiger Zeit habe ich die PEG Einbettung ausprobiert und sie dann für mich verworfen. Die Blöcke gerieten mir immer wenig schneidbar. Sie wurden bröckelig. Viel Erfahrungen habe ich damit nicht gesammelt, ich habe das damals schnell aufgegeben.
Gerlach empfiehlt in seiner Mikrotechnik den Zusatz von etwas Glycerin zum PEG. Er zitiert Krauter, nach dem auf 20g PEG 1500 0,5 ml Glycerin kommen. Sobald es aber um schwer durchdringliche Gewebe geht, gibt die PEG Einbettung dennoch nach seiner Schilderung - und nach meinen leidvollen eigenen Erfahrungen - nicht den erforderlich einheitlichen Block. Es bröselt. Zudem ist das Gemisch hygroskopisch. In Wasser strecken funktioniert nur, wenn der Schnitt gut zusammenhängt, da PEG ja wasserlöslich ist.
Nach Burck, Histotechnik ist sehr langsam!, jedenfalls am besten mit gekühltem Messer im gekühlten trockenen Raum zu schneiden. (Auf meinem Speicher ist es momentan weit über 24 Grad, da gehts auch mit Paraffin kaum...) Romeis bestätigt das in gewisser Weise, er schreibt, gewöhnlich schneide man in einem kühlen trockenen Raum, lässt aber andererseits die Blöckchen an der offenen Luft liegen oder haucht sie an, wenn sich keine Schnittbänder bilden wollen.
Bei Paraffinschnitten wäre ziemlich klar, was zu versuchen wäre, wenn sich die Schnitte rollen: Entweder ist das Paraffin zu hart, z.B. weil die Umgebungstemperatur zu niedrig ! ist, oder der Anstellwinkel des Messers zu groß (bei der Rasierklinge müsste er sicher kleiner sein als beim Mikrotommesser, weil die Rasierklinge kaum eine Facette besitzt) Oder aber man müsste dünner schneiden, aber 5 µ dürfte kaum mit der Rasierklinge gehen. Man kann auch beim ersten Schnitt in Paraffin versuchen, den Schnitt mit einem Pinselchen niederzuhalten und so das Rollen zu vermeiden. Da Paraffin gut bändert, ist dann der Folgeschnitt schon leichter: Das entstehende Schnittband hält jeden neuen Schnitt dann von selbst nieder.
Zu Streckflüssigkeiten schreiben Romeis und Burck übereinstimmend: 4 Teile Diäthylenglykol 5 Teile aqua dest und 1 Teil 40% Formol. Romeis berichtet noch von einer zweiten Streckflüssigkeit, ein Gelantine Wassergemisch mit Zusatz von Kaliumdichromat. Na wenn schon, dann doch lieber Formol, oder?
Mein Paraffin habe ich einmal in größerer Menge von Jung Histoshop gekauft, war etwas teuer, aber man braucht ja nun im Hobbybereich nicht die Menge...Ich zehre jedenfalls von meinem Kilo von vor ca. 5 Jahren immer noch.
Mikrogrüße
Jürgen