Hallo Foristen,
Die Struktur der Schale von Pleurosigma angulatum war ja schon Thema, zum Beispiel hier: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=4683.0 (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=4683.0). Hier nun eine, zumindest für mich, neue Ansicht des alten Bekannten.
Ich habe solche Präparate schon häufig benutzt um die Abhängigkeit der Auflösung von der Kondensorblendeneinstellung bei NA um 0.65 im Hellfeld zu demonstrieren. Nun habe ich ein solches Präparat mal zu Testzwecken bei hoher Auflösung mit confocaler Mikroskopie im Reflexionsmodus aufgenommen. Dabei wird das Präparat mit einem Laserstrahl abgerastert und immer wenn es einen Brechungsindex-Unterschied gibt kommt es zur Reflexion. Signale aus anderen Ebenen werden von der confocalen Lochblende (Pinhole) blockiert, so dass nur Signal aus einer Ebene zum Detektor kommt (hier ein Photomultiplier). Danach wird die nächste Ebene abgerastert und so weiter.
Was dabei rausgekommen ist interessiert vielleicht den ein oder anderen. Zunächst eine Maximalprojektion des 3D-Stapels aus 29 Ebenen zur Übersicht. Normalerweise ist der Hintergrund neben der eigentlichen Struktur in solchen Bildern dunkel, aber da die Reflexion vom Deckglas hier mit im Stapel ist, ist auch diese seitlich sichtbar und somit der Hintergrund hell
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/216311_61608546.jpg)
Das Interessanteste ist aber in der Projektion nicht zu sehen, nämlich die Änderung des Schalenmusters entlang der optischen Achse. Daher hier von einem kleinen Ausschnitt des Bildes eine durchgehende Serie von 19 Ebenen.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/216311_42922453.jpg)
Aufnahmeparameter: Objektiv 63x1,4 Öl, Pixelgröße 40x40 nm, z-Abstand zwischen Ebenen 137 nm, Wellenlänge 488 nm, Pinholegröße 0,25 AU.
Ich bin mir noch nicht sicher was ich da eigentlich genau sehe, wie im oben zitierten Thread schon erwähnt sind Strukturen in mindestens 3 Ebenen unterscheidbar. Was mich verblüfft hat ist der deutliche Unterschied in zwei benachbarten Ebenen trotz des geringen Abstands von nur 137 nm. Das liegt sicher mit daran, dass ich die confocale Lochblende sehr stark zugezogen habe, stärker als man es sich bei fluoreszenten Aufnahmen leisten kann, da dabei viel Licht verloren geht.
Liebe Grüße
Steffen
Zitat von: d65 in Juni 07, 2017, 14:04:34 NACHMITTAGS
Ich bin mir noch nicht sicher was ich da eigentlich genau sehe, wie im oben zitierten Thread schon erwähnt sind Strukturen in mindestens 3 Ebenen unterscheidbar. Was mich verblüfft hat ist der deutliche Unterschied in zwei benachbarten Ebenen trotz des geringen Abstands von nur 137 nm. Das liegt sicher mit daran, dass ich die confocale Lochblende sehr stark zugezogen habe, stärker als man es sich bei fluoreszenten Aufnahmen leisten kann, da dabei viel Licht verloren geht.
Moin,
ich glaube nicht, dass Du das Dargestellte richtig interpretierst, weil:
erstens die "sichtbaren Ebenen" nach nach unten/hinten merklich größer werden (dabei hast Du die Diatomee doch auf Glas und nicht auf Wachstuch gebettet, oder?) und
zweitens die Auflösung in "Z" nicht mal eben dadurch um den Faktor 1,5 verbessert werden kann, indem man das Pinhole zuzieht.
Wäre das so einfach, dann würden sich die Mikroskophersteller nicht mittels optischer und mathematischer Kunstgriffe ein Bein ausreißen um eine Verbesserung um das 1,7fache (ZEISS AiryScan) zu erreichen. Dann reichte es ja, die Empfindlichkeit der Detektoren hochzutreiben. Ich nehme an, dass Du da Artefakte produzierst. Über deren Entstehung kann ich aber bloß raten. Dass Artefakte im Spiel sind, schließe ich außerdem aus dem von Dir gezeigten Strichmuster, dass so garnichts mehr ins Bild passt und dessen Details sich über die Fläche im Aussehen ändern. Aus eigener Erfahrung misstraue ich dem Reflektionsbild im CLSM. Zu viele meist nicht leicht erklärbare Artefakte habe ich mir da bislang ansehen dürfen. Dazu kommt, dass eine Maximum-Projektion auch noch durch die Mühle der Bildverarbeitung des Mikroskops gedreht wird und man dort auf Gedeih und Verderb den Software-Entwicklern ausgeliefert ist. Wobei ich befürchte, dass eine Normierung der Algorithmen hier absolutes Wunschdenken ist.
Freundliche Grüße
Wolfgang
Hallo Wolfgang,
die Diatomeen sind in diesem gekauften Präparat in einem unbekannten Einschlussmittel hinter Deckglas.
Durch (vollständiges) zuziehen des Pinholes lässt sich die Auflösung (Rayleigh-Kriterium bzw. full width half maximum) theoretisch zumindest um den Faktor 1,44 steigern, in Praxis aber natürlich weniger, da ein geschlossenes Pinhole kein Licht durchlässt. Ein weiterer Aspekt ist, dass ich im Vergleich zu Fluoreszenzbildern eine hervorragende Photonenstatisktik und dadurch quasi kein Rauschen habe, auch dass ist der effektiven Auflösung zuträglich. Ich weiß aber eigentlich gar nicht, wie Du auf eine 1,5-fache Verbesserung kommst, ich habe die nicht behauptet.
Zitat von: Silber_und_Licht in Juni 07, 2017, 15:37:30 NACHMITTAGS
erstens die "sichtbaren Ebenen" nach nach unten/hinten merklich größer werden
....
Dass Artefakte im Spiel sind, schließe ich außerdem aus dem von Dir gezeigten Strichmuster, dass so garnichts mehr ins Bild passt und dessen Details sich über die Fläche im Aussehen ändern.
Da verstehe ich leider nicht, was Du damit meinst. Bezieht sich das auf die Projektion oder auf die Einzelschnitte? Vielleicht kannst Du das noch erläutern?
Das Artefakte im Spiel sein können will ich gar nicht leugnen. Reflexion kann ja prinzipienbedingt nur an der obersten Oberfläche ungestört verlaufen. Alles was weiter unten ist wird notwendigerweise durch Strukturen oben drüber beeinflusst. Da die Schale eine Wölbung hat werden sich diese Effekte über die Oberfläche gesehen auch unterschiedlich auswirken. Auch kann ich nicht ausschließen, dass die z-Skalierung nicht stimmt. Da ich den Brechungsindex des unbekannten Einschlussmediums nicht kenne könnte es sein, dass hier eine falsche Tiefe vorgetäuscht wird.
Wie dem auch sei, die Projektion war tatsächlich nur gedacht um einen ersten Eindruck zu geben. Das eigentlich erstaunliche finde ich die einzelnen Serienschnitte. Ich habe versucht im Netz REM Bilder zum Vergleich zu finden, aber mit den Suchworten "Pleurosigma angulatum REM" war ich erfolglos.
Liebe Grüße
Steffen
Hallo Steffen,
wenn Du Dir Dein Bild anschaust, dann wird Dir auffallen, dass die zweite Schicht/Ebene nicht nur links sondern auch rechtsseitig hervorsteht. Das ist nur möglich, wenn diese Ebene breiter ist als die darüber liegende und gilt in gleicher Weise für die folgende Schicht genauso usw. Da dies aber eigentlich nicht gut möglich ist, schließe ich auf ein Artefakt.
Was den Gewinn an Auflösung betrifft, ich hatte fehlerhafterweise Deine Angabe von 137nm für x/y angenommen, in "Z" sieht das Verhältnis eigentlich noch extremer aus - vorausgesetzt ich habe Deine Ausführungen richtig verstanden: bei einer angenommenen Wellenlänge von 488nm ergibt sich eine physikalisch mögliche Auflösung von ca. 200nm +\- [(0,61x488nm)/1,4]. In Z-Richtung multipliziert sich das mit etwa 2,5, d.h. Du erreichst in Z-Richtung eine maximale Auflösung von 500nm +\-. Zu den von Dir angegebenen 137nm Abstand der Ebenen im Bild selbst dann in einem noch ungünstigeren Verhältnis als 1:1,5 wenn Du durch verkleinern des Pinholes noch etwas herausholst.
Nach Deiner Angabe sind die gezeigten Schichten der Diatomee in einem Abstand von 137nm .... und die sind im Bild auch noch klar abgegrenzt. Dieses Missverhältnis zwischen der theoretisch mit "normalen Mitteln" möglichen Auflösung in "Z" und Deinen Angaben, die wahrscheinlich den Angaben der Mikroskopsoftware entnommen sind sowie die Ebenendarstellungen im Bild, lassen mich stolpern bzw. eher an Artefakte (mehrfache Reflexion o.ä.) glauben ... oder ich habe irgendwas an Deinen Ausführungen komplett missverstanden.
Was das sich verändernde "Strichmuster" betrifft, so sieh Dir mal die Diatomee-Struktur etwa in der Mitte und im Gegensatz dazu am Rand links und besonders gut sichtbar rechts an. Du wirst sehen, dass die Details (ich mag sie hier nicht als Poren bezeichnen, obschon REM-Aufnahmen diese Bezeichnung nahelegen) im Mittelbereich kleinen erhabenen Rauten ähneln, dann zu geraden Strichen werden um noch näher am Rand ein etwa keilförmiges Aussehen zu bekommen.
Freundliche Grüße
Wolfgang