Liebe Mikrofreunde,
in Regis Moosthread (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=2924.0) hat Klaus Herrmann den für mich neuen Farbstoff Brilliantkresylblau (C.I. 51010) zum Anfärben der Hyalinzellen vorgestellt.
Angeregt durch Rolf-Dieter Müller habe ich heute erste Versuche mit Schnitten vom Ginkgoblattstiel und dem Blütenstängel einer Orchideenhybriden gemacht, um zu schauen, ob eine selektive Färbung auftritt.
Brilliantkresylblau (http://de.wikipedia.org/wiki/Brillantkresylblau) gehört zu den Diaminobenzooxazinen. Es bilden in wässriger Lösung aktive Farbstoffanteile mit positiver Ladung (über einen Stickstoffkomplex) und färbt Zellbestandteile, die negative Ladung tragen, bläulich an. Um es vorweg zu nehmen: dies ist bei lignifizierten Geweben der Fall, wie anhand der Färbung der Hyalinzellen zu erwarten war. Es liegt also eine selektive Färbung vor.
Der Farbstoff ist für Vitalfärbungen geeignet und wird hauptsächlich zur Untersuchung zoologischer Objekte verwendet.
Zur Präparation:
- Nutzung vorhandener Handschnitte vom Ginkgoblattstiel (ca. 80 µm) und von
Mikrotomschnitten des Blütenstängels einer Orchideenhybriden
(Phalaenopsis, ca. 60 µm).
- Färben mit wässriger Brilliantkresylblaulösung (0,025%, kalt) für 10 und 90 Minuten,
dazu wurde die 0,25%ige Stammlösung noch einmal um den Faktor 10 verdünnt.
- Beobachtung in Wasser
Zur Technik:
- Leica DM E mit C-Plan Objektiven (Vergrößerung siehe Bildbeschreibung)
- Canon A520 an Leica Periplan mit dem Herrmannschen Adapter
- Stacken mit Zerene Stacker (Build 07.2009)
- Bildbearbeitung mit XNView (Korrektur des Schwarz- und Weisspunkts,
Größe angepasst und leicht nachgeschärft)
Bild 1: Leitbündel im Ginkgoblattstiel quer nach 10 min Aufenthalt in der Färbelösung (Vergrößerung 200x, Stack aus 14 Bildern)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/18727_21199831.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Es werden im Wesentlichen nur die verholzten Zellen angefärbt. Wie bei der Färbung mit den Etzold-Farbstoffen sind einige Zellinnenräume des ungebleichten Schnittes komplett gefärbt.
Bild 2: Leitbündel im Ginkgoblattstiel quer nach 90 min Aufenthalt in der Färbelösung (Vergrößerung 200x, Stack aus 12 Bildern)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/18727_63886726.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Wie man sieht, führt der längere Aufenthalt in der Färbelösung zu einer intensiveren Anfärbung der verholzten Gewebe, ohne die nicht verholzten Zellen weiter anzufärben.
Bild 3: Querschnitt durch den Blütenstängel einer Orchideenhybriden, wieder mit einer Färbedauer von 10 Minuten (Vergrößerung 400x, Stack aus 6 Bildern)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/18727_2110073.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Interessant ist hier die große Zelle in der Bildmitte mit der im Vergleich zu den umgebenden Zellen verdickten Zellwand.
Bild 4: Querschnitt durch den Blütenstängel einer Orchideenhybriden ebenfalls mit einer Färbedauer von 10 Minuten (Vergrößerung 400x, Stack aus 6 Bildern, Ausschnittsvergrößerung von Bild 3)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/18727_19404137.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
In der Ausschnitsvergrößerung (Originalauflösung) sieht man den geschichteten Aufbau der Zellwand.
Bild 5: Querschnitt durch den Blütenstängel einer Orchideenhybriden zum Vergleich gefärbt mit Etzold FCA (Vergrößerung 400x, Stack aus 12 Bildern, Dauerpräparat mit Euparal)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/18727_57372153.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Hier zum Vergleich ein anderer Schnitt des gleichen Stängels, der mit Etzold FCA gefärbt ist. Auch dort findet sich (wieder mittig) der Zelltyp mit den verdickten Zellwänden. Allerdings sind diese nur ganz leicht blau gefärbt.
Bild 6: Querschnitt durch den Blütenstängel einer Orchideenhybriden zum Vergleich gefärbt mit Etzold FCA (Vergrößerung 400x, Stack aus 12 Bildern, Dauerpräparat mit Euparal, Ausschnittsvergrößerung von Bild 5)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/18727_3448048.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Und wieder die Ausschnittsvergrößerung in Originalauflösung vom Vergleichspräparat.
Leider kann ich nicht sagen, um was für einen Zelltyp es sich hier handelt. Vielleicht kann ja ein in Pflanzenanatomie besser bewanderter Mitleser hier aushelfen?
Auf alle Fälle zeigt die Färbung mit Brilliantkresylblau die interessante Struktur der Zellwände deutlich besser, als die Etzold FCA Färbung (und auch besser als die hier nicht gezeigte Färbung mit Etzold Grün).
Auf die Schnelle habe ich von den Ginkgoschnitten noch ein Dauerpräparat mit dem Einschlußmittel Euparal erstellt, das nun trocknen muss.
Beim Entwässern in Isopropanol erwies sich die Färbung mit Brilliantkresylblau als sehr empfindlich, der Farbstoff wird sehr schnell ausgezogen, solange noch Wasseranteile im Alkohol sind.
Dabei ist auch die Färbung der Zellwände aus den Bildern 3 und 4 verloren gegangen. Hier bleibt also noch einiges zu tun.
Schöne Grüße
Jörg
Hallo Jörg,
Schöne Bilder sind das geworden mit diesem Färbung.
Was mich interessiert ist warum hast Du die Bilder gestackt war das notwendig?
Stäcken bei Insekten kan ich mir vorstellen aber bei schöne Pflanzenschnitten braucht man das doch nicht oder?
Ich höre gerne etwas von Dir.
Herzlichen Gruss aus den Niederlanden
Jan
Hallo Jan,
danke für Dein Lob!
Das Stacken war leider notwendig ;D. Meine Schnitte sind nicht so plan, wie ich sie gerne hätte und auch noch etwas dick - da muss ich noch üben.
Und diese speziellen Schnitte sind zudem schon etwas älter (der Ginkgo liegt seit gut 10 Tagen auf Ethanol, der Orchideenstängel seit gut 5 Monaten). Da wird sich vielleicht noch das eine oder andere verzogen haben.
Für eine erste Testfärbung, von der ich ein so vorzeigbares Ergebnis nicht erwartet hatte, wollte ich aber keine frischen Schnitte machen sondern war ganz froh, altes Material sinnvoll verwerten zu können.
Wenn es Dich interessiert, kann ich gerne mal das erste und das letzte Bild einer Serie einstellen. Dann bekommst Du einen guten Eindruck von den Schärfeebenen im Schnitt.
Bei den Aufnahmen der verdickten Zellwände zeigt das gestackte Bild jenseits von irgenwelchen Unebenheiten das feine Linienmuster einfach besser. Das kommt auf den auch scharfen Einzelbildern nicht so schön rüber.
Hier könnte es sich vielleicht um Beugungseffekte handeln, andererseits erinnert die Struktur an den Aufbau angeschnittener Astrosklereiden z.B. aus Schirmtannennadeln.
Herzliche Grüße
Jörg
Lieber Jörg,
also "vorzeigbar" ist untertrieben, das ist sehr schön! Was mir auch gefällt: Deine zusätzliche Recherche.
Was mich verwundert ist Deine Beobachtung, dass der Farbstoff schnell wieder ausgezogen wird, wenn er mit wasserhaltigem Isopropanol behandelt wird.
Das Moos hat die Farbe in 70%igem Ethanol auch nach längerer Zeit nicht abgegeben. Obs am Moos liegt, oder wirkt Ethanol anders wie Isoprop. Kann ich mir nicht vorstellen!
Gibt auf jeden Fall noch was zu tun und es ist super, dass Du durch Deine Untersuchungen den Anstoß dazu gegeben hast.
Gespannt bin ich auch auf Ergebnisse von Herrn Kaiser.
Diese Schichtung in Skerenchymzellen habe ich bei der Brennessel (2 jähriger Spross) auch schon beobachtet (hier Etzoldfärbung!)
Ich sehe gerade, hab beim Suchen ein bescheidenes Bild gefunden - vielleicht finde ich noch ein besseres!
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/18785_56315743.jpg)
Lieber Klaus,
vielen Dank für die Blumen!
Das Ausziehen der Farbe muss ich auf jeden Fall noch mal beobachten. Die Schnitte aus der 10 Minuten Färbung hatte ich gut über eine Stunde in einer vergleichsweise großen Menge Isopropanol. Danach waren nur noch die verholzten Zellen gefärbt.
Auch die speziellen Parenchymzellen mit den verdickten Wänden waren da wieder farblos, was gegen eine Sklerifizierung spricht. Es scheint so, als ob im Restwasser verbliebene negative Ionen des Farbstoffsalzes vielleicht gerade durch die Anwesenheit der neutralen Isopropanolmoleküle in der Lage sind, den Farbstoff wieder an sich zu reißen.
Das würde bedeuten, dass eine eingeschobene Spülung mit Aqua dest. das Ausbluten aufgrund der dadurch erfolgten Verdünnung abschwächen oder verhindern könnte.
Die länger gefärbten Schnitte hatte ich gemäß den Rezepten zum Entwässern vor dem Einschluß in Euparal im Isopropanol. Also 30 Sekunden und dann zwei mal 3 Minuten jeweils im frischem Ansatz. Auch da war der Effekt schon deutlich zu sehen. Zunächst verschwindet die Farbe aus den komplett gefluteten Zellen. Ggf. ist dies also ein positives Verhalten.
Offen ist die Frage, um was für eine Zellart es sich bei den 'Dickwandern' handelt, da sie sich ja doch recht deutlich von den umgebenden Zellen unterscheidet. Solche Strukturen scheinen jedenfalls recht weit verbreitet zu sein. Du hast Sie in Deinen Brennnesselschnitten gefunden und im Ginkgo habe ich sie gerade beim runterscrollen auch entdeckt: Bild 2 am unteren Rand, etwa über dem Wort "Aufenthalt".
Schön wäre es natürlich, nun eine verträgliche Konterfärbung zu finden, die die nicht verholzten Zellteile anfärbt.
Es bleibt also spannend! ;)
Herzliche Grüße
Jörg
Lieber Jörg,
diese Färbung könnte doch Etzold sein in der Astrablau durch Brilliantkresylblau ersetzt wird. Also Mit B. färben und anschließend mit Fuchsin/Chrysoidin gegenfärben.
Wäre zu testen.
So wie ich Jörg verstanden habe, wird jetzt eine Gegenfärbung für unverholzte Zellwände gesucht.
Einmal könnte man Alciangrün nehmen. Ich fürchte nur, das der Farbkontrast zum Brilliantkresylblau zwar gegeben ist, aber nicht so eindeutig wie es zu wünschen wäre. Alciangrün färbt ja unverholzte Zellwände grün, aber auch teilweise differenzierend nach blau.
Aber ich denke, wir finden hier eine andere Lösung, denn wir sollten, um den prinzipiellen Ansatz von Klaus aufzunehmen, nach einer Rotfärbung suchen.
Aus dem Zimmermann-Schneider *) hätte ich folgende Vorschläge für die Anfärbung von unverholzten Zellwänden:
- Rutheniumrot färbt tief weinrot,
- Kongorot färbt rot,
- Eosin färbt rot.
Jörg, mir scheint in Nelkenöl gelöstes Eosin besonders erfolgversprechend zu sein. Also, Vorfärbung mit Brilliantkresylblau und Nachfärbung mit Eosin. Ich würde analog zu der im Zimmermann beschriebenen Zyanin/Eosin-Färbung eine Differenzierung des Brillisntkresylblaus durch Nelkenöl erwarten.
Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter
*) Zimmermann-Schneider, Bot. Mikrotechnik. 2. Aufl.
Guten Morgen Rolf-Dieter,
na das passt ja gut. Eosin habe ich da und Nelkenöl war soweit ich mich erinnere in des Professors Kiste. ;)
Vielleicht könntest Du einmal schauen, ob das stimmt und das Öl noch brauchbar ist. Dann müssten wir uns mal über den Färbevorgang unterhalten. Ich vermute, vor und zwischen der Nelkenöl-Eosin Färbung und dem Überführen in Isopropanol zum Einschluss in Euparal ist je ein Zwischenschritt nötig?
Da das Brilliantkresylblau einen sehr intensiven Blauton ergibt, könnte auch die Färbung mit Rutheniumrot - zumindest aus ästhetischen Gesichtspunkten - interessant sein.
Ich fülle Dir schon mal was von meiner BKB-Stammlösung ab. :)
Herzliche Grüße
Jörg
Zitat von: Fahrenheit in September 11, 2009, 08:21:35 VORMITTAG
...
na das passt ja gut. Eosin habe ich da und Nelkenöl war soweit ich mich erinnere in des Professors Kiste. ;)
Vielleicht könntest Du einmal schauen, ob das stimmt und das Öl noch brauchbar ist. Dann müssten wir uns mal über den Färbevorgang unterhalten. Ich vermute, vor und zwischen der Nelkenöl-Eosin Färbung und dem Überführen in Isopropanol zum Einschluss in Euparal ist je ein Zwischenschritt nötig?
Da das Brilliantkresylblau einen sehr intensiven Blauton ergibt, könnte auch die Färbung mit Rutheniumrot - zumindest aus ästhetischen Gesichtspunkten - interessant sein.
Ich fülle Dir schon mal was von meiner BKB-Stammlösung ab. :)
...
Jörg, Du hast ja recht, die Kiste vom Professor gibt einiges her. Am Wochenende werde ich mal nach Nelkenöl suchen und einen Entwurf eines Arbeitsplans für die Zweifachfärbung Brilliantkresylblau/Eosin erstellen.
Mich hatte schon immer die im Zimmermann beschriebene Färbung Zyanin/Eosin interessiert. Nur fehlte mir ein zeitgemässer Ersatz-Farbstoff für Zyanin. Ich vermute mal, das Du vielleicht dieses mit Brilliantkresylblau gefunden hast.
Anfang nächster Woche bringe ich Dir dann das Nelkenöl zum Tausch vorbei.
Die Färbung mit Rutheniumrot kann ich gerne machen, denn davon habe ich noch etwas. Es ist zwar für eine geplante Edelmetallsalzfärbung bei Pflanzenschnitten vorgesehen, doch es färbt so intensiv, das ich mit guten Gewissen etwas für eine Brilliantkresylblau/Rutheniumrot-Färbung abzweigen kann.
Gruß
Rolf-Dieter
Hallo Rolf-Dieter,
das Rutheniumrot hat den Nachteil, dass es in Lösung leider nicht sehr stabil ist, wie ich mich selbst schon überzeugen konnte. Und es zählt zu den teuren Farbstoffen!
Wie es mit der Haltbarkeit im Dauerpräparat aussieht weiß ich nicht.
Zitat von: Klaus Herrmann in September 11, 2009, 10:03:16 VORMITTAG
...
das Rutheniumrot hat den Nachteil, dass es in Lösung leider nicht sehr stabil ist, wie ich mich selbst schon überzeugen konnte. Und es zählt zu den teuren Farbstoffen!
Wie es mit der Haltbarkeit im Dauerpräparat aussieht weiß ich nicht.
Lieber Klaus,
Du hast natürlich mit Deinen Anmerkungen vollkommen recht und ich werde besonders Dein Hinweis zur Instabilität der Farblösung berücksichtigen. Hinsichtlich der Haltbarkeit in Dauerpräparate werde ich wohl ein Risiko eingehen und es über die Zeit beobachten müssen.
Es ist tatsächlich ein hohes finanzielles Risiko. Rutheniumrot hat eben als Edelmetallsalz seinen Preis. Doch wenn es der Sache dient, kann man es mal versuchen.
Gruß
Rolf-Dieter
Hallo Klaus,
Du hattest in Regis Moosthread ja geschrieben, dass Du zwei mit Brilliantkresylblau eingefärbte Moospräparate in Euparal eingedeckt hast.
Kannst Du schon was zur Stabilität der Färbung sagen? Ich habe nämlich das Gefühl, dass meine eingedeckten Ginkgo-Schnitte langsam an Farbintensität verlieren.
Mit dem von mir verwendeten Rezept (Vorgehensweise bei der Färbung analog Etzold-Farbstoffgemische) scheint das BKB nicht stabil zu sein.
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo, guten Morgen,
mehrmalige Färbeversuche von Torfmoosen mit Brilliantkresylblau haben tatsächlich ergeben, daß der Farbstoff nach dem Eintrocknen des Präparates weder mit Äthanol noch mit Isopropanol ausgezogen wird.
Vorgang:
Auf dem OT wird in einem Tropfen dem. H2O ein Körnchen BKB völlig aufgelöst und in der Lösung die zu untersuchenden Objekte eingelegt (vor allem Stengel - und Astblätter). Deckglas auflegen und beobachten.
Nach dem völligen Eintrocknen, die 4 Ecken mit Nagellack festlegen.
Will man das Präparat wieder anschauen, einen Tropfen Äthanol zugeben, um die Luftblasen aus den Zellen zu vertreiben, dann einen Tropfen dem. H2O.
Die Färbung hält nach der Alkoholzugabe. Methylenblaufärbung wird ausgezogen. Allerdings ist die Blaufärbung mit BKB nicht so leuchtend wie MB.
Freundliche Grüße
Bernhard Kaiser
Beitragsinhalt auf Wunsch des Autors gelöscht
Hallo Mike,
ZitatWas mich nur gewundert hat ist, das die Skerenchymzellen sich blau färben.
Die Sklerenchymzellen sind dann nicht lignifiziert, sondern bestehen nur aus Cellulose. Dann werden sie nicht vom Fuchsin/Chrysoidin angefärbt.
Ich wollte sowieso noch einen Cellulosenachweis machen um diese Hypothese zu untermauern.
# Jörg, danke für Deine weiter führenden Untersuchungen. Ich habe 5 Jahre alte Präparate Epidermis des Tulpenblattes gefärbt mit
B; die sind wie damals (Eindeckmittel Euparal).
# Herr Kaiser, vielen Dank für Ihre Untersuchungsergebnisse, die sich mit meinen decken! Jetzt müssen wir nur noch herausfinden, ob es gewebespezifische Unterschiede gibt, die dafür sorgen, dass es einmal dauerhaft aufzieht und einmal nicht. Was ja durchaus wahrscheinlich ist!
Wie Jörg schon sagte: es bleibt spannend!
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/18897_28086570.jpg)
Lieber Jorg,
Ich möchte mich noch bedanken für deinen Auskunft über das Stäcken.
Herzlichen Gruss
Jan
Hallo liebe Färberzunft!
Heute Abend habe ich das nun 5 Tage alte Dauerpräparat der mit Briliantkresylblau (BKB) gefärbten Ginkgoschnitte noch einmal geprüft und photografiert.
Am 12. habe ich ja schon die Vermutung geäußert, dass das BKB, zumindest in meiner Präparation, nicht stabil ist und dies hat sich heute eindrucksvoll bestätigt. Zum Vergleich zum Bild 2 aus meinem Eingangsposting hier nun die neuen Bilder eines der 90 Minuten lang gefärbten Schnitte.
Bild 7: Die Erste Aufnahme, wieder bei 200x als Stapel von 14 Bildern
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19041_49373718.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Bild 8: Der gleiche Bildausschnitt 3 Stunden später (nur die Kamera ist etwas verrutscht), nun ein Stapel von 7 Bildern, die auch ausreichen, um die nötige Schärfe zu erreichen.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19041_11056526.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Schon das erste Bild ist deutlich blasser als der frisch gefärbte Schnitt im alten Bild 2. Nach drei Stunden unter der leicht abgedimmten Mikroskopbeleuchtung (20 Watt, Halogen, korrekt geköhlert) jedoch ist der Farbstoff nocheinmal eklatant weiter verblasst.
Das Testpräparat enthält 2 Schnitte, der zweite war während der Untersuchung aufgrund der zugezogenen Leuchtfeldblende nicht beleuchtet und zeigt deutlich kräftigere Farben. Dies unterstützt meine These, das das BKB nicht lichtecht ist.
Aus meiner Sicht ist das das Ende der Karriere des BKB als Farbstoff für Dauerpräparate - oder ich habe einen groben Fehler in meinem Rezept.
Allerdings findet sich im Netz sowohl ein Hinweis auf die Lichtempfindlichkeit des Farbstoffsalzes als auch immer wieder die Beschreibung als In-vitro-Farbstoff. Das wird wohl seine Gründe haben.
Klaus, kannst Du bitte noch mal einen kritischen Blick auf Dein altes Dauerpräparat mit der BKB-Färbung werfen? Wie ist es gelagert und hat es noch die gleiche Brillianz wie das Moosblättchen, das Du in der letzten Woche gefärbt hattest?
Wenn die Färbung bei Dir nicht gelitten hat: wie hast Du genau gefärbt?
Herzlichen Dank!
Jörg
Lieber Jörg,
jetzt habe ich meinen inneren Schweinehund überwunden, und statt die Reste des Zwetschgenkuchens zu essen die ollen Präparate rausgeholt:
In dieser Kiste sind sie versammelt und sehen aus wie auf den nächsten Bildern ! Ich habe nachgeschaut, das Biopraktikum im Gymnasium war 2005!
Also 4 Jahre her!
Und das nimmst Du zurück: die Klage vor der Menschenrechtskommission ist schon eingereicht!: ;D
ZitatAus meiner Sicht ist das das Ende der Karriere des BKB als Farbstoff für Dauerpräparate
Kannst Du noch abwenden, wenn Du einen Kurs bei mir belegst:
die Verwendung des genialen BKB als unkomplizierten Farbstoff für botanische Dauerpräparate (https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19080_29561464.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19080_4060472.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19080_32261624.jpg)
Die Epidermisabzüge lagen aus Zeitgründen nur kurz in 70%igem Ethanol, dann wurde gefärbt, ausgewaschen und über Isoprop in Euparal eingedeckt.
Ich habe sie immer im Kasten und der ist im Schrank. Also intensive Sonne haben die Präparate wie alle meine Präparate natürlich nicht ab bekommen! ;)
Lieber Klaus,
vielen Dank für Deinen Verzicht auf den leckeren Zwetschgenkuchen, über den sich bestimmt Deine Familie her gemacht hat, als Du treu sorgend in Deiner Präparatekiste gewühlt hast. ;)
Man sieht es schon beim Blick in die Kiste: alles Brilliantkresylblau (bis auf wenige Ausnahmen mit anderer Färbung ...).
Sehr seltsam. Meine Präparate haben 48 Stunden in AFE zugebracht, dann 60 Stunden in Ethanol 70%. Nach dem Schneiden ging es wieder ins Ethanol.
Nach ca. 10 Tagen habe ich mit 3 Wechseln gewässert und dann mit einer Lösung von ca. 0,025% BKM für 90 Minuten gefärbt. Die Ergebnisse sahen alle so aus wie in Bild 2 hier im Eingangsposting.
Anschließend habe ich mit 3 Wechseln (30 Sekunden und zwei mal drei Minuten) in Isopropanol überführt und dann in Euparal eingeschlossen.
Die Präparate waren da schon gefühlt etwas bleicher, da sie eine ausgiebige Photosession hinter sich hatten und auch einige Zeit im Licht der Halogenlampe auf dem Objekttisch lagen.
Was nun passiert ist - nach 4 Tagen in einem recht dunklen Kellerraum, ohne direktes Licht und mit einem Mutternstapel als Gewicht abgedeckt, zeigt am besten Bild 7. Nach drei weiteren Stunden auf dem Objekttisch war ich dann bei Bild 8.
Denn Prozess gewinne ich! Besonders da der zweite unbelichtete Schnitt unter dem selben Deckglas (!) sogar noch etwas kräftigere Farben zeigt als Bild 7.
Ich weiss, ich verlange viel, aber da Du ja recht viele Präparate hast: könntest Du Dir vorstellen, eines davon unter gleichen Bedingungen wie bei mir auf dem Objektträger zu belichten? Wenn Du zum Beispiel bei 200x nach Köhler ausleuchtest und das BKB wirklich lichtempfindlich ist, solltest Du einen ausgebleichten "Fleck" an der belichteten Stelle erhalten ...
Dann hätten wir eine gesicherte Aussage, wie sich der Farbstoff in eingeschlossenen Zustand verhält.
Ich werde zunächst einmal versuchen, wie sich das BKB auf Filterpapier verhält. Wenn der Farbstoff getrocknet ist, werde ich eine Probe halb abgedeckt auf die Fensterbank legen und hier berichten. Dann haben wir zwar kein Verhalten unter Luftabschluss, aber immerhin.
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo liebe Färberzunft,
hier nun die Ergebnisse meines Belichtungstests mit BKB (Brilliantkresylblau).
Bild 9: Ein mit einer 2,5%igen BKB-Lösung getränkter Filterpapierstreifen nach dem Trocknen am 16.09. ...
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19480_49658646.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Bild 10: Wird bis zum 19.09. halb verdeckt für ca. 8 Stunden dem direkten Sonnenlicht und weiteren 4 Stunden einer Halogenleuchte (20 Watt, 5 cm Abstand) ausgesetzt:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19480_22738596.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Bild 11: Es ist nur eine ganz leichte Ausbleichung zu erkennen:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19480_59867235.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Bild 12: Zur Verdeutlichung mit Trennlinie zwischen dem abgedeckten und dem offenen Teil:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19480_38637547.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Bild 13: und nochmal näher ran:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19480_40635582.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Somit können mangelnde Lichtechtheit und Wärme nicht alleine für das bei meinen Präparaten beobachtete Ausbleichen verantwortlich sein. Und ich bin ziemlich ratlos.
Zur Zeit trocknen 4 weitere mit BKB gefärbte Präparate (Querschnitte durch einen Blütenstiel einer Orchideenhybriden - Phalaenopsis spec.), je zwei in altem und frischem Euparal. Die Ergebnisse werde ich wieder hier zeigen.
Wer Ideen hat, woran das Ausbleichen liegen könnte oder mittlerweile eigene Erfahrungen mit dem BKB: ich bin für jeden Hinweis dankbar.
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo Jörg
Wenn ich alle Deine Beiträge hier analysiere, dann ist Dein Bleichversuch noch nicht ganz korrekt durchgeführt worden.
Du solltest noch einen halben Farbstreifen mit Isopropanol behandeln und dann beide Streifen mit Euparal bestreichen. Trocknen lassen und nochmals an die Sonne damit.
Erst dann kannst Du genaueres über die Lichtechtheit der Färbung aussagen.
Ich hoffe, dass ich Dir damit nicht zu viel Arbeit aufhalse. ;D
Gruss Horst
Hallo Horst,
vielen Dank für Deinen Hinweis und nein, das tust Du nicht :)
Diese Tests mache ich an den kompletten Präparaten. So habe ich den gesammten Präparationsverlauf mit erfasst.
Zwei - je eins mit dem alten und dem frischen Euparal - gehen Morgen in die Sonne.
Herzliche Grüße
Jörg
Nachgelegt:
hier schon mal zwei Bilder als Ausgangspunkt für die nächste Testreihe - Präparation und Technik wie im Eingangsposting beschrieben.
Bild 14: Leitbündel aus dem Blütenstiel einer Orchideenhybriden (Phalaenopsis spec.), Vergrößerung 400x, Stack aus 3 Einzelbildern.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19489_58699600.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Bild 15: Cuticula aus dem Blütenstiel einer Orchideenhybriden (Phalaenopsis spec.), Vergrößerung 400x, Stack aus 10 Einzelbildern.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19489_57873368.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Zur Vergleichbarkeit: alle Schnitte entstammen der selben Schnittserie, wurden gemeinsam gelagert (Ethanol 70%) und gleichzeitig in den selben Reagenzien präpariert. Einziger Unterschied ist das verwendete Euparal (zwei 'alt', zwei 'neu').
Auffällig bei dem Leitbündel: die Färbung des Phloems geht ins Violette. Diese Farbe nimmt das BKB an, wenn es mit Klorix in Kontakt kommt - wird also nicht farblos.
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo Jörg,
das sieht doch sehr sehr schön aus - Schnitt, Färbung und Bild. Und das BKB bekommst Du sicherlich auch in Griff.
Herzliche Grüsse
Eckhard
Guten Morgen Eckhard,
danke für die Aufmunterung! ;) Das Lob für die Schnitte geht allerdings an Rolf-Dieter, sie stammen aus einem Färbe-Workshop in Bonn.
Wart' mal ab, wir wollen ja noch versuchen, eine Gegenfärbung mit Nelkenöl und Eosin einzufügen.
Dazu muss das BKB in meinen Präparaten aber erst mal einigermaßen stabil bleiben.
Schöne Grüße
Jörg
Guten Abend liebe Färberzunft,
nach dem sich die Sonne die letzten Tage bei uns etwas rar gemacht hat, hier nun die Ergebnisse meiner Versuche zur Lichtechtheit des Brilliantkresylblaus (BKB).
Dazu hatte ich 4 Präparate von Querschnitten des Blütenstängels einer Orchideenhybriden angefertigt und zwei davon in den letzten Tagen für insgesamt ca. 8 Stunden dem direkten Sonnenlicht ausgesetzt. 4 Präparate, weil ich älteres und frisches Euparal verwendet habe - die Ergebnisse zeigen jedoch diesbezüglich keine relevanten Unterschiede.
Das Belichten sah etwa so aus:
Bild 16: Belichtung von zwei der vier Testpräparate, die anderen beiden bleiben zur Dokumentation im Dunkeln:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19822_59408853.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Technik und Präparation wie eingangs beschrieben. Im Gegensatz zu den schon geposteten Referenzbildern hier nun die Bilder der dem Sonnenlicht ausgesetzten Präparate bei nur zweihunderfacher Vergrößerung, in Stapeln von 3 bzw. 11 Bildern. Die beiden Referenzpräparat sind zur Dokumentation im Dunkeln geblieben.
Die Schwächen der Bilddarstellung und Bearbeitung sowie das fehlende Equipment erlauben mir keine quantitativen Aussagen - es zählt also der qualitative Überblick (jeweils unbelichtet gegen belichtet direkt untereinander):
Bild 14 und 17: Das Leitbündel:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19822_56152722.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19822_43844556.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Bild 15 und 18: die Cuticula:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19822_26847985.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19822_199777.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Wie man sieht, ist neben kleineren Veränderungen (durch den Lichteinfluss aber vor allem durch die für mich nicht genau reproduzierbaren Verhältnisse bei der Bildgewinnung und -darstellung) kein nennenswertes Nachlassen der Farbbrillianz feststellbar.
Lieber Klaus: Du hattest also Recht mit Deinen Aussagen zur Stabilität des BKB - aber selber experimentieren macht schlau! :D
Was hat aber nun zum Ausbleichen der Ginkgo-Schnitte geführt, die nach dem gleichen Verfahren präpariert worden sind?
Zum einen besteht eine geringe Wahrscheinlichkeit, dass es mit dem Material selbst, also dem Ginkgo zu tun hat. Ich glaube das nicht.
Viel eher denke ich, dass die Umstände der Präparation eine Rolle gespielt haben. Eigentlich ging es mir eingangs nur darum, zu probieren, wie sich der für mich neue Farbstoff BKB auf Pflanzenschnitten verhält. Da er die Hyalinzellen der Toorfmoose so schön anfärbt, vermutete ich, dass er auch recht spezifisch auf sklerifizierte Gewebe höherer Pflanzen aufzieht - was sich ja auch bestätigt hat.
Die Schnitte waren jedoch so attraktiv und zeigten bestimmte Details deutlicher als z.B. Material in Etzold (vergleiche Bilder 3 bis 6), dass ich am Ende einer gut zweistündigen Session dann doch Dauerpräparate erstellen wollte.
Ich gehe heute davon aus, dass die Schnitte in dieser Zeit gelitten haben und ich am Ende nicht gut genug entwässert habe.
Meines Wissens nach sind insbesondere Farbstoffe, die aufgrund elektrostatischer Effekte am zu färbenden Substrat anlagern, empfindlich gegen Restfeuchtigkeit. Hier vermute ich die Lösung für die beobachtete Ausbleichung.
Was nun noch fehlt, ist eine Gegenfärbung für die nicht verholzten Gewebe. Dies möchte ich, wie oben schon mit Klaus und Rolf-Dieter diskutiert, mit Eosin und Nelkenöl versuchen.
To be continued! ;)
Anregungen und Kritik sind wie immer willkommen!
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo Jörg,
ZitatMeines Wissens nach sind insbesondere Farbstoffe, die aufgrund elektrostatischer Effekte am zu färbenden Substrat anlagern, empfindlich gegen Restfeuchtigkeit. Hier vermute ich die Lösung für die beobachtete Ausbleichung.
Das ist ja interessant. Hättest Du vielleicht eine Quelle? Ich rätsele seit langem, warum bei mir die Pseudoazanfärbungen (Sterba Schobess) teilweise nach kurzer Zeit ausbleichen (im dunklen Kasten) teilweise jedoch über Jahre unverändert bleiben. Möglicherweise liegt hier des Rätsels Lösung...
Im Übrigen: Wunderschön differenzierte Bilder!
Mikrogrüße
Jürgen
Hallo liebe Färberzunft,
gestern Abend hatte BEN bei mir auf dem Labortisch seinen ersten Auftritt. BEN steht für Brilliantkresylblau, Eosin und Nelkenöl.
Als Ausgangsmaterial mussten zwei Mikrotomschnitte des Clementinenfruchtstiels von Rolf-Dieter Müller herhalten, die ich noch vorrätig hatte.
Hier in kürze der Arbeitsablauf aus meinem Laborbuch.
Zunächst eine Testfärbung nur mit in Nelkenöl gelöstem Eosin:
- Ansatz: eine kleine Spatelspitze Eosin in 4 Tropfen Nelkenöl
- Entwässern des Schnittes in Isopropanol (3 mal wechseln)
- Färbung im EN Ansatz für 15 Minuten
- Ausspülen des Farbansatzes in Isopropanol (4 mal wechseln)
- Eindecken mit Euparal
- Photodokumentation (100x, BW 13.8, Stapel aus 13 Einzelbildern)
Bild 19: Das ganze sieht dann bei hundertfacher Vergrößerung so aus (Stapel aus 13 Bildern)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19893_51339472.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Und hier ein erster Test des kompletten Färbeverlaufs:
- Wässern des Schnittes (Clementinenfruchtstiel), 2 mal wechseln.
- Färbung für 10 Minuten in BKB Lösung ca. 1,25 % (2 Tropfen Stammlösung + 2
Tropfen Aqua dest.)
- Entwässern in Isopropanol - der Schnitt ist komplett blau
- Überführen in Eosin-Nelkenöl (Ansatz wie oben), Färbung auch hier für ca.
10 Minuten
- BKB geht in Schwaden ab, die EN Lösung behält dabei ihren Farbton und
färbt nicht nach lila um
- Lupenkontrolle: verholzte Gewebe bleiben blau, EN zieht auf die
unverholzten Gewebe auf und hat dort wahrscheinlich das BKB verdrängt
- Spülen in Isopropanol (4 mal wechseln, die ersten beiden Chargen färben
sich leicht rosa vom EN-Farbansatz, 3 - weitestgehend - und 4 bleiben
klar)
- Eindecken mit Euparal
- Photodokumentation (100x, BW 13.8, Stapel aus 13 Einzelbildern)
Bild 20: Das Ergebnis ist noch nicht optimal (Vergrößerung ebenfalls 100x, Stapel aus 12 Bildern)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19893_28574894.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Ich finde, das Eosin kommt im BEN Schnitt sehr matt und ins lila gezogen daher. Das liegt wohl daran, dass das BKM nicht ganz spezifisch aufzieht, da es auch Zellulose anfärbt, die in allen Zellwänden enthalten ist. Die durch das Nelkenöl erwartete Differenzierung des BKM ist jedoch noch nicht stark genug. Vielleicht lässt sich da über Konzentrationen und Färbedauer noch etwas machen.
Das BKB ist gewohnt brilliant und ich hoffe, das bleibt auch so ;)
Bild 21: Zum Vergleich noch einmal ein altes Bild vom gleichen Material in einer klassichen Etzold FCa Färbung, ebenfalls bei huntertfacher Vergrößerung (Einzelaufnahme):
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/19893_10801856.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Gegenüber der Etzold FCA Färbung, die farblich quasi ein Negativbild der BEN Färbung ist, fällt auf, dass sich die Cuticula deutlich besser abhebt. Allerdings sind im BEN-Bild die Strahlen im Holzteil nicht zu unterscheiden, was mit Etzold FCA (und auch Etzold grün, da noch besser) sehr wohl gelingt.
Ohne eine verbesserte Differenzierung des BKB im Färbeprozess bring BEN also als Universalfärbung keine Vorteile und kann nach meinem Empfinden auch ästhetisch nicht mithalten.
Lieber Jürgen,
leider habe ich das von Dir gewünschte Zitat noch nicht wieder gefunden. Ich habe in der letzten Woche lange im Netz gesucht, um etwas zur Instabilität des BKB zu finden. Der Text war allgemein gehalten, daher habe ich ihn nur überflogen und nicht kopiert. Das war wohl ein Fehler ;D.
Kommentare und Kritik sind wie immer willkommen.
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo liebe Färberzunft,
hier nun der nächste Versuch einer BEN Färbung. Um das Ausbleichen des Eosins zu verhindern, habe ich zur Sicherheit frisches Eosin verwendet und statt über Isopropanol ins Euparal über Xylol in Kanadabalsam eingeschlossen.
Meinen herzlichen Dank an Rolf-Dieter Müller für die Unterstützung und die schönen Mikrotomschnitte ;D
Das Objekt ist diesmal ein Lavendelstängel im Querschnitt in 70% Ethanol.
Hier das neue Rezept:
- Wässern (2-mal wechseln)
- Färben in BKB 0,125% für 5 Minuten
- Entwässern in Isopropanol (4-mal wechseln, insgesamt 10 Minuten)
- Färbung in Eosin/Nelkenöl für 20 Minuten (Ansatz wie in einem der
vorangegangenen Postings beschrieben)
- Überführen der Schnitte in Xylol, vorsichtig mit dem Pinsel bewegen, um
das Eosin/Nelkenöl zu entfernen (10 Sekunden)
- Abziehen und Xylol nachgeben (3-mal wechseln, insgesamt 15 Minuten)
- Einschließen in Kanadabalsam
Und hier nun die Ergebnisse, die sich, wie ich denke, sehen lassen können:
Bild 22: Übersicht über das Präparat, Vergrößerung 40x, Stapel aus 3 Bildern.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/20804_8261103.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Bild 23: Ausschnitt mit Leitbündel in einer der Ecken des Schnittes, Vergrößerung 100x, Stapel aus 12 Bildern
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/20804_36205315.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
In der neuen Kombination Xylol und Kanadabalsam kommen die beiden Farben sehr schön leuchtend zur Geltung. Xylol ist weit weniger polar als Isopropanol, daher vermute ich, dass es die Eosinfärbung nicht oder nicht so sehr angreift.
Die Präparate sind ganz frisch: man beachte die Tüpfelspuren wandernder Teilchen, die durch das Stacken entstanden sind.
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo Jörg,
das ist ja eine Wucht, damit stellst du die sonst übliche Farbgebung auf den Kopf. Unglaublich wie farbstark das Eosin kommt!
Ich denke auch, dass es am Xylol liegt. Ich habe auch die Beobachtung gemacht, dass Färbungen in den Eindeckmitteln Malinol, Kanadabalsam, Eukitt leuchtener wirken nach Verdunsten des Lömis als bei Euparal, obwohl das unbestritten Vorteile in der Anwendung hat.
Dass BKB scharf und intensiv färbt ist ja klar! ;)
Hallo liebe Regi,
wenn ich mich recht erinnere gingen diese ganzen Färbestudien und die damit verbundenen Erkenntnisse, von Deiner Einfärbung von Sphagnum palustre mit Brilliantkresylblau (BKB) aus, weil Du kein Methylenblau hattest.
Gratulation!
Freundliche Grüße
Bernhard Kaiser
Lieber Klaus,
vielen Dank für Deine lobenden Worte! Selbstverständlich ist das von mir zu unrecht verdächtigte BKM nun vollständig rehabilitiert. ;)
Mal sehen, was noch so in der Färbung steckt, vielleicht können sich die zwei Farbstoffe ja noch mit einem Dritten im Bunde anfreunden.
Lieber Bernhard,
die Anrede in Deinem Beitrag lässt mich etwas verwundert zurück. Gab es hier eine Antwort von Regi, die wieder verschwunden ist?
Herzliche Grüße
Jörg
Lieber Jörg,
bitte um Entschuldigung.
Ich habe da etwas durcheinander gebracht. Klaus Herrmann hatte als erster Brilliantkresylblau zum Färben von Torfmoos angewandt.
Ich bin die ganzen Punkte in den Threads nochmal durchgegangen - was durch die Löschungen des unsäglichen*** erschwert wurde - und stellte fest, daß Regi mit FCA gefärbt hatte.
Dank an Herrn Herrmann, der damit die ganzen Studien angestoßen hat.
Schönes Wochenende und freundliche Grüße
Bernhard Kaiser
Das lieber Herr Kaiser habe ich auch gemacht, weil ich mir selber nicht mehr sicher war:
ZitatIch bin die ganzen Punkte in den Threads nochmal durchgegangen
-
und da ist mir zum ersten Mal aufgefallen:
Zitatwas durch die Löschungen des unsäglichen*** erschwert wurde
..dass wir hier einen unsinnigen schweizer Käse durch diese Aktion haben. Eigenartiges Verhalten, um es mal vornehm auszudrücken.
Die Rehabilitation des genialen BKB :D könnten wir doch zum Anlass nehmen zum "Du" überzugehen. Ich biete das ja neuerdings auch in meiner Signatur öffentlich an! ;)
Hallo Klaus,
aber gerne per Du.
Freundliche Grüße
Bernhard K.
Hallo liebe Färberzunft,
wie schon angedeutet, habe ich heute mit Acriflavin als dritter Farbe experimentiert und möchte die Ergebnisse gerne vorstellen.
Anbei wie immer das Rezept, an der Technik hat sich nichts geändert.
- Erweiterung der Färbung um eine Stufe mit Acriflavin (Lavendel Stängel quer in 70% Ethanol)
- BKB 0,125%
- Acriflavin 2% für 30 Sekunden
- Eosin/Nelkenöl für 20 min
- Xylol/Kanadabalsam statt Isopropanol/Euparal
- Wässern (2-mal wechseln)
- Färben in BKB 0,125% für 5 Minuten
- Wässern (2-mal wechseln)
- Färben mit Acriflavin für 30 Sekunden
- Wässern (wechseln bis kein Acriflavin mehr im Spülwasser)
(Lupenkontrolle: Sklerenchym grün, restliches Gewebe gelb-orange)
- Entwässern in Isopropanol (4-mal wechseln, insgesamt 10 Minuten, einige Schnitte zu
Vergleichszwecken zurückgehalten)
- Färbung in Eosin/Nelkenöl für 20 Minuten (Ansatz wegen eines Unfalls mit sehr viel Eosin) ;D
(Beobachtung: Eosin verklumpt beim Kontakt mit Nelkenöl - Beize. Eventuell sollte mit Eosin
in wässriger oder alkoholischer Lösung gefärbt werden, um anschließend in Nelkenöl zu beizen.)
- Überführen der Schnitte in Xylol, vorsichtig mit dem Pinsel bewegen, um
das Eosin/Nelkenöl zu entfernen (10 Sekunden)
- Abziehen und Xylol nachgeben, Zugabe der Vergleichsschnitte
(3-mal wechseln, insgesamt 15 Minuten)
- Einschließen in Kanadabalsam
Hier nun die Präparate im Vergleich - alle Stängelquerschnitte vom Lavendel, ca. 25 µm. Zunächst die Bilder 24 bis 27 in folgender Reihenfolge:
- BEN (Wiederholung von Bild 23)
- AcriB Vorfärbung BKB und Acriflawin
- AcriBEN die komplette Färbung
- Wacker zum Vergleich
Alle Bilder bei 100-facher Vergrößerung, Bild 25 und 26 Einzelaufnahmen, die beiden anderen Bilder sind gestackt.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/20923_25430658.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/20923_3528959.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/20923_24585471.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/20923_32604385.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Wie ich finde, hat auch die Vorfärbung mit Brylliantkresylblau und Acriflavin ihren ganz eigenen Reiz. Viel differenzierter ist jedoch die komplette Färbung mit Eosin in Nelkenöl in der letzten Stufe.
Hier kommen zum Beispiel die Strahlen im Xylem deutlicher heraus und die Tüpfelkanäle im Sklerenchym sind überhaupt erst zu sehen.
Hier kann sich die neue Färbung zumindest mit meiner Wackerfärbung des gleichen Materials durchaus vergleichen.
Hier noch zwei Detailaufnahmen des Sklerenchyms:
Bild 28: Sklerenchym in einer Ecke des Lavendelstängels mit AcriB, die Tüpfel sind auch bei 400-facher Vergrößerung nicht zu erkennen, Stapel aus 3 Bildern
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/20923_57911184.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Bild 29: Der gleiche Ausschnitt in einem komplett gefärbten Präparat (AcriBEN), Vergrößerung wieder 400x, Stapel aus 8 Bildern. Hier treten die Tüpfelkanäle sehr deutlich hervor.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/20923_55866471.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Etwas problematisch finde ich die Schärfe besonders der beiden letzten Aufnahmen. Mehr war auch nach akribischem Einstellen des Mikroskops nicht zu machen und auch im Okular blieb eine gewisse Unschärfe erhalten. Ist dies vielleicht ein Effekt, der durch das noch flüssige Kanadabalsam zustande kommt? Ich bin etwas ratlos, die Optik ist jedenfalls OK, bei anderen Präparaten tritt das Problem nicht auf.
Anregungen und Kritik sind wie immer willkommen.
@Bernhard, vielen Dank für Deine Aufklärung!
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo Jörg,
vielen Dank für diese sehr gut dokumentierte Versuchsreihe! Hoffentlich bleiben die Farben erhalten.
Dass die Tüpfelkanäle so toll herauskommen, begeistert mich besonders :)
Liebe Mila,
wenn man genau hinschaut, kann man in Bild 28 und 29 erkennen, dass die Sklerenchymzellen ganz am Rand des Stützgewebes einen Gradienten vom hellgrün (ganz Außen) nach dunkelgrün aufweisen.
Wasser sollte nach dem Öl- und dem mehrmals gewechselten Xylolbad keine Rolle mehr spielen. Langsamhabe ich das Acriflavin in Verdacht ... hier eventuell im Zusammenspiel mit dem sauren Kanadabalsam.
Mal schauen, wie sich die Färbungen entwickeln.
Herzliche Grüße
Jörg
Lieber Jörg,
die Ergebnisse Deiner Tests sind schon wirklich beeindruckend. Klar, so deutlich habe auch ich die Tüpfelkanäle noch nicht gesehen, wie in Deinem letzten Foto. Aber, ich muss doch etwas zur Nachdenklichkeit anregen. In dem vorletzten Foto (ohne Eosin) sieht man die Tüpfelkanäle sehr wohl und zwar sehr fein, nämlich so, wie sie halt sind. In dem Eosin-Präparat sind sie dagegen fett und als Doppel-Struktur zu erkennen. Das gilt auch für andere Strukturen. Mir scheint, dass das Eosin sich irgendwie und etwas flockig an die anderen Farbstoffe anlagert oder undefiniert in die Zellwände eindringt. Das mag auch zu dem Eindruck leichter Unschärfe zu führen, was das Foto ja nicht ist.
Aber: der Zweck heiligt bekanntlich die Mittel. Um die Tüpfel so richtig deutlich sichtbar zu machen, ist das eine gute Möglichkeit.
Herzliche Grüße
Detlef
Hallo und Guten Abend,
ja, bei Bild 28 sieht man die Zartheit der Tüpfelkanäle und bei Bild 29 dann eindrucksvoll, wie viele es sind. Beide Fotos sind (für mich pädagogisch) wertvoll, wenn man sie hintereinander zeigt und man könnte fast sagen, erst wie "ungeschminkt" und dann ein bisschen "dick aufgetragen".
Ich hoffe Jörg, Du verzeihst mir den Vergleich, meine Schüler würden so sofort wissen, was ich meine... ;)
Einen schönen Abend und
Guten Abend Mila, guten Abend Detlef,
zunächst vielen Dank für den Zuspruch!
Ich habe mich etwas ungeschickt ausgedrückt. In der AcriB-Färbung sind die Tüpfelkanäle nicht an gefärbt, einige von ihnen, die nahe der gewählten Schärfenebene liegen, kann man als leichte Aufhellungen erkennen, wenn man weiß, dass da welche sein müssen. Aber sie heben sich nicht durch eine Kontrastfarbe ab.
Mit dem Eosin in der AcriBEN Färbung ist das anders. Hier sind , denke ich, die Lumen der Kanäle wohl aufgrund des Kapillareffektes noch mit Eosin gefüllt oder das Eosin/Nelkenöl hat noch vorhandene Reste des Zellplasmas rot gefärbt.
Schließlich sind auch die 'Innenwände' der sklerifizierten Zellen rot.
Somit treten die Tüpfelkanäle sehr deutlich hervor, was auch für die Interzellularen gilt.
Mal sehen, ob die Präparate schärfere Aufnahmen erlauben, wenn das Kanadabalsam durchgehärtet ist.
Mila, Deine Erklärung ist nachvollziehbar und sofort einsichtig ;D
Wenn Du die Bilder in voller Auflösung haben möchtest, sag' Bescheid - oder warte noch ein paar Tage: wie gesagt, da sollte noch bessere Aufnahmen möglich sein.
Herzliche Grüße
Jörg
Guten Abend liebe Färberzunft,
hier nun ein neuer Satz Präparate (und Bilder davon), in denen ich das Acriflavin als dritte Farbe durch Chrysoidin ersetzt habe. ChrysoBEN quasi :)
Wie schon bei den vorherigen Vorstellungen zunächst das Rezept (Technik unverändert und das Ausgangsmaterial ist weiterhin der Blütenstängel des Lavendels in 25 µm Schnitten von Rolf-Dieter Müller):
- Testfärbung mit Chrysoidin statt Acriflavin (Lavendel Stängel quer in 70% Ethanol)
- BKB 0,125%
- Chrysoidin 0,1% für 3 min
- Eosin/Nelkenöl für 20 min
- Wässern (2-mal wechseln)
- Färben in BKB 0,125% für 5 Minuten
- Wässern (2-mal wechseln)
- Färben mit Chrysoidin für 3 Minuten
- Wässern (wechseln bis kein Chrysoidin mehr im Spülwasser)
(Lupenkontrolle: Sklerenchym grün, restliches Gewebe blass gelb, Cuticula orange)
- Entwässern in Isopropanol (4-mal wechseln, insgesamt 10 Minuten, 2 Schnitte zu
Vergleichszwecken zurückgehalten)
- Färbung in Eosin/Nelkenöl für 20 Minuten (Ansatz wie oben)
- Überführen der Schnitte in Xylol, vorsichtig mit dem Pinsel bewegen, um
das Eosin/Nelkenöl zu entfernen (10 Sekunden)
- Abziehen und Xylol nachgeben, Zugabe der Vergleichsschnitte
(3-mal wechseln, insgesamt 15 Minuten)
- Einschließen in Kanadabalsam
Bild 30: Lavendelstängel quer, Vorfärbung BKB und Chrysoidin, Vergrößerung 100x, Stapel aus 7 Bildern
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/21248_27937384.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Bild 31: Lavendelstängel quer, komplette Färbung "ChrysoBEN", Vergrößerung 100x, Stapel aus 8 Bildern
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/21248_49222740.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Im Vergleich zur AcriBEN Färbung (Bilder 24 und 25) kommen alle Farben viel verhaltener heraus. Auffällig ist, dass die Farbkombination sowohl in der Vorfärbung als auch in der Komplettfärbung klar zwischen Parenchym (blassgelb bzw. pink) und Endodermis / Hypodermis (dunkelblau) unterscheidet.
Die Cuticula wird schön orange an gefärbt.
Nun noch eine Ausschnittsvergrößerung, wieder in beiden Varianten.
Bild 32: Lavendelstängel quer, Vorfärbung BKB und Chrysoidin, Vergrößerung 200x, Stapel aus 8 Bildern
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/21248_430818.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Bild 33: Lavendelstängel quer, komplette Färbung "ChrysoBEN", Vergrößerung 200x, Stapel aus 6 Bildern
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/21248_19386821.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Hier kann man schön erkennen, dass das Phloem zunächst dunkelblau gefärbt ist, dieses aber dann vom Eosin verdrängt wird, womit das Phloem pink erscheint.
Sklerenchym und Xylem sind olivgrün bzw. dunkelgrün an gefärbt, die Tüpfelkanäle sind auch hier erkennbar, werden aber nicht so stark hervorgehoben, wie in der Kombination "AcriBEN".
In den Palisadenzellen bleiben die Chloroplasten dank der dezenteren Färbung deutlich erkennbar - dies ein Vorteil zur Kombination mit Acriflavin.
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo liebe Färberzunft,
da Klaus Herrmann mich freundlicherweise mit etwas Erythrosin (Dinatriumtetraiodfluoresceinat. E127) versorgt hat, kann ich heute noch einmal nachlegen.
In der folgenden Färbung habe ich das Eosin durch das Erythrosin ersetzt. Dies macht die Stufe mit dem Nelkenöl überflüssig, da mit Erythrosin in wässriger Lösung gefärbt werden kann. Nach der Färbung kann also mit Isopropanol entwässert und in Euparal eingeschlossen werden - schwubs ist auch das Xylol aus dem Rezept verschwunden.
Erythrosin ist übrigens ein Lebensmittelfarbstoff (E127), der zum Beispiel zum Färben von Cocktailkirschen, Fruchtstückchen in den gesunden Früchtemüslis und diversen Medikamenten genutzt wird. Er ist in letzter Zeit etwas in Verruf geraten - also das Müsli lieber selber frisch ansetzen. ;D
Wie gewohnt zunächst das Rezept (Technik unverändert und das Ausgangsmaterial ist weiterhin der Blütenstängel des Lavendels in 25 µm Schnitten von Rolf-Dieter Müller):
- AcriBER Färbung mit BKB, Acriflavin und Erythrosin (Dinatriumtetraiodfluoresceinat, E127) in wässrigen Lösungen
(Lavendelstängel quer in 70% Ethanol)
- BKB 0,125%
- Acriflavin 2% für 30 Sekunden
- Erythrosin für 10 Minuten
- Isopropanol/Euparal und Xylol/Kanadabalsam
- Wässern (2-mal wechseln)
- Färben in BKB 0,125% für 5 Minuten
- Wässern (2-mal wechseln)
- Färben mit Acriflavin für 30 Sekunden
- Wässern (wechseln bis kein Acriflavin mehr im Spülwasser)
(Lupenkontrolle: Sklerenchym grün, restliches Gewebe gelb-orange)
- Färben mit Erythrosin in wässriger Lösung (Ansatz einige Kristalle in 10 Tropfen Aqua dest.)
- Wässern (Wechseln bis kein Erythrosin mehr im Spülwasser)
- Entwässern mit Isopropanol (2-mal wechseln nach 10 und 30 Sekunden)
- 2 Schnitte weiter Entwässern in Isopropanol (2-mal Wechseln für jeweils 5 Minuten)
- Einschließen in Euparal
Bild 34:Lavendelstängel quer, Färbung "AcriBER", Vergrößerung 100x, Stapel aus 10 Bildern
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/21291_50351926.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Bild 35:Lavendelstängel quer, Färbung "AcriBER", Vergrößerung 200x, Stapel aus 7 Bildern
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/21291_51244177.jpg) (http://img5.imagebanana.com/)
Die AcriBER - Kombination besticht durch kräftige Farben. So erscheint das Palisadenparenchym in einem satten Rotton, während die Epidermis und die Hypodermis orange eingefärbt sind.
Das Stützsklerenchym und das Xylem hier wieder in grün, die Tüpfelkanäle sind erkennbar, aber nicht besonders hervorgehoben.
Somit lassen sich auf der Basis von Brillantkresylblau (BKB) mit den Farbstoffen Acriflavin, Chrysoidin, Eosin und Erythrosin einige interessante Färbungen für botanische Schnitte erstellen, denen alle gemeinsam ist, die übliche Farbverteilung zwischen 'lebendem' und 'verholztem' Gewebe quasi auf den Kopf zu stellen.
Bei der Vielzahl verfügbarer Farbstoffe ist hier sicherlich noch Luft für Experimente. Interessant wäre auch, das im bisherigen Rezept eher 'ereignislose' Chrysoidin in einer Nachfärbung in Alkohol oder Xylol (?) einzusetzen.
Herzliche Grüße
Jörg