Ich habe schon öfters ein Beitrag über Paneth-Körnerzellen geschrieben (HIER (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=17706.msg135204#msg135204) und HIER (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=29907)) aber noch nie ist es mir gelungen um die Körner mit Eosin kräftig an zu Farben. Meist wirkt die Färbung etwas Flau aus.
In diesen LR White Schnitt aber Färbt es sich prima.
Um die PAS Reaktion möglichkeit in LR White zu testen habe ich die auch durchgeführt und mit zufriedenstellende Resultaten.
Aufnahmen am Leitz Orthoplan mit Canon 700D Kamera.
Bild 1: Ein Übersichtsbild von den Duodenum Schnitt. Den Schnitt messt ungefähr 2x3mm. Färbung Toluidin Blau.
Objektiv: Leitz Plan Fluotar 4x
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/232890_11404313.jpg)
Bild 2: Die Körner in das Zytoplasma von die Paneth Zellen werden hier kräftig Rosa angefärbt.
Färbung Haematoxyline (Gill) und Eosine.
Objektiv: Leitz Plan Apo 63x.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/232890_64923656.jpg)
Bild 3: Die Körner in das Zytoplasma von die Paneth Zellen werden hier kräftig Rosa angefärbt.
Färbung Haematoxyline (Gill) und Eosine.
Objektiv: Leitz Plan Apo 63x.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/232890_44624228.jpg)
Bild 4: PAS Reaktion. Rechtsunten sind die Becherzellen PAS Positiv, die Paneth Zellen sind oben zu sehen und schwach Positiv.
Hier könnte ich was Hilfe gebrauchen wie es sich beim Mensch verhalt!
Objektiv: Leitz Plan Fluotar 25x.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/232890_17654054.jpg)
Bild 5: PAS Reaktion. Paneth Zellen sind schwach Positiv.
Objektiv: Leitz Plan Apo 63x.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/232890_52727599.jpg)
Bild 6: PAS Reaktion. Becherzellen sind positiv.
Objektiv: Leitz Plan Apo 63x.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/232890_14347911.jpg)
Gruße Ronald
Sehr schön, lieber Ronald. Die Eosinfärbung ist ja viel kräftiger als die in Deinen Glycolmethacrylatschnitten. Andrerseits kommt es mir so vor als sei die Hämatoxylinfärbung der Zellkerne in Deinem Beitrag von 2013 prononcierter gewesen, oder kommt mir das nur so vor? In jedem Fall tolle Schnitte!
Schöne Grüße
Jürgen
Hallo Roland,
bin hin und weg ! Saubere Schnitte, perfekte Färbung, toll in Szene gesetzt.
Gruß !
JB
@Jürgen H.,
Da hast du recht, es wäre mir auch lieber dass das Eosine etwas weniger kräftig war und das Hämatoxylin etwas kräftiger. Es ist aber meine erste HE Färbung in LR White und muss noch mehr testen. Hier habe ich mit die Gill Variante gefärbt. Mit LR White kann man auch andere Sorten Hämatoxiline nutzen so habe ich noch testen mit Ehrlich, Mayer, Harris usw im Programm.
Mit Toluidin aber Farben sich auch Schnitte von 0,5µm sehr einfach was mit Technovit 7100 schon was Flacher ausfällt. Auch das Schneiden auf ein Wasserboot finde ich sehr angenehm.
@ Jürgen B.,
Weil Sie ja Chirurg sind könnten Sie vielleicht aussagen ob sich beim Mensch die Paneth Körner auch schwach PAS Positiv reagieren und vielleicht auch ein warum das so ist?
Gruße Ronald
Lieber Ronald,
klar, dass deine Schnitte wieder klasse sind! Ist das 0,5µ?
Ich habe einige Fragen,
Bild 1 zeigt viel Krypten nebeneinander und einiges Gewebe darum herum. Ist das ein Längsschnitt, also kein Querschnitt wo man den Darm wie ein Rohr durchschneidet? Hast du ein ganzes Darmpaket herausgeschnitten weil ich viele Krypten nebeneinander sehe?
In Bild 2 und 3 sind die Paneth-Zellen super dargestellt durch ihre Eosinfärbbarkeit. Leider kannst du nur selbst als Referenz dienen, denn im Netz und auch in meinen alten Histoatlanten finde ich keine guten Beispiele.
Bei Bild 4 und 6 habe ich etwas Schwierigkeiten die Körnerzellen (Bild 5 ist klar) von den Becherzellen zu unterscheiden. In deiner Arbeit von 2013, Photo 8 sehe ich Körnerzellen neben Becherzellen, da ist mir alles klar.
Dünnschnitte vom Menschen habe ich auch im Netz nicht gefunden. Rein theoretisch sollten die Körnerzellen weil sie hauptsächlich Proteine enthalten, deutlich weniger in PAS reagieren als die glykogenhaltigen Becherzellen.
Bei Uni Basel habe ich folgendes gefunden:
https://histologie.unibas.ch/tl_files/histologie/PDFhistologie/mikroskopAnatomie/Jejunum58.pdf
,,Normales histologisches Präparat mit PAS (Perjodsäure-Schiff-Reagens) gefärbt, die vor allem Glykogen, Glykoproteine, Glykosamino-Glykane und in diesem Präparat
Becherzellen mit ihrem Schleim färbt. Die Paneth-Körnerzellen in den Krypten werden
praktisch nicht gefärbt durch diese Methode und erscheinen mehr oder weniger leer"
Da ich ja inzwischen selbst mit Technovit experimentiere interessieren mich natürlich die Unterschiede sehr. Mit dem Technovit-System kann man wohl nicht LR White gießen?
Ich denke du nimmst runde Proben und schneidest mit dem Glasmesser mit Abschwimmwännchen auf Wasser. Das würde mich für mein Mikrotom (Rundprobenhalter, Glasmesserhalter, Messerbrecher) auch gebraucht so zwei- bis drei tausend Euro kosten und ich habe viel weniger Zeit als du.
Trotzdem, was sind die Vorteile von LR White? Kann man nicht auch in Technovit die verschiedenen HE Färbungen durchführen?
Grüße nach Holland, Ralf
Lieber Ronald,
ich schließe mich einmal mit ein paar Fragen an:
ist die Fixierung Deiner alR White Proben die gleiche, wie in Deinen anderen Beiträgen zu den Paneth Körnerzellen?
Hast Du das Eosin angesäuert?
Schöne Grüße
Jürgen
Lieber Ronald,
zur Stärke der PAS-Reaktion beim Menschen habe ich folgenden, kurzen Text gefunden:
Unter dem Rubrum "Paneth´s Cells" heißt es bei Mills:
"in addition to characteristic granule staining with H&E stains, granules are conspicuously stained by periodic acid-Schiff, and phloxine-tartrazine (65); and, interestingly, Paneth´s Cells autofluorescence is elicted by eosine stain (Table 25.2) (114)".
Literatur:
Mills S E, 2007.: Histology for Pathologists. 3.ed, Lippincott p 634
Viele Grüße
Heino
@Ralf,
Den Toluidinschnitte sind 0,5µm und das färbt sich sehr gut, da könnte man auch noch runter aber das muss ich noch testen. Ich weiß von Cartsen Dittmayer das er schon LR White Schnitte von 200nm gut gefärbt hat. Das Probiere ich einfach mal ob heraus zu stellen was man dann mehr sieht wie in ein z.B. 1µm Schnitt.
Die HE und PAS sind 1µm weil sonst die Färbung zu Flau wird.
Die Orientierung von Gewebe das man in Gelatin Kapsel einbetten möchte ist nicht so einfach wie ich gewöhnt war in Technovit. Diese Kapseln werden empfohlen wenn man unter sauerstoffabschluss auf 60Grad einbetten möchte. Man kann LR White auch mit ein Beschleuniger, UV und im Mikrowave ausharten aber ich kenn bis jetzt nur noch die Warme Aushartung. Großen Vorteil davon ist das man Zeit hat um die Proben zu Orientieren. Die Aushartung fangt erst an wenn wärme dazu kommt also man kann einfach vier Stunden Einbetten oder noch langer wenn nötig. Ein Nachteil, finde ich auch erst gerade aus, ist das man das Gewebe nicht schön mit eine Flache Seite nach unten legen kann. Die Kapsel sind von unten Rund. Da ist mit mein Duodenum auch was schief gegangen und es hat sich etwas verdreht (etwas ist fast 90 Grad). Darum bin ich in die Außenschicht angefangen zu schneiden und sieht man jetzt eigentlich nur Krypten.
Um die Becherzellen und Körnerzellen zu unterscheiden ist vielleicht hier im Bild nicht ganz eindeutig, im Schnitt am Mikroskop aber ohne Zweifel.
Dass die PAS Reaktion an die Schweizer Uni Negativ ist verstehe ich auch noch nicht ganz. Vielleicht auch ist die Zusammensetzung von das Granulat nicht immer dasselbe, die Wissenschaft ist ja auch noch nicht ganz im klaren was die genaue Funktion von die Paneth zellen ist! Dann herrschen immer noch Unsicherheiten.
ZitatIch denke du nimmst runde Proben und schneidest mit dem Glasmesser mit Abschwimmwännchen auf Wasser.
Das stimmt genau, nur nehme ich kein PE Molds mehr sondern Gelatin Kapseln. PE Molds sind ungeeignet für Warme Aushärtung mit Sauerstoffabschluss, für Aushartung mit Beschleuniger wohl aber da wird die Einbettzeit stark reduziert (so hat jeder Vorteil auch was Negatives).
In Technovit kann man auch HE Färbungen durchfuhren nur werden die Färbungen immer was Flau. Zwei oder drei Mu Schnitte geht dann noch aber wenn man dünner schneidet dann hällt das Eosin nicht.
Die große Vor und Nachteile von LR White kenne ich noch nicht im Ganzen. Eins ist für mich schon sehr wichtig und zwar kann man LR White sehr bequem auf ein Wasserwanne schneiden am Ultramikrotom. Technovit Schnitte muss man mit eine Pinzette anfassen und kommt ein 2µm Schnitt noch schön wie ein Schnitt vom Messer, ein 0,5µm Schnitt staucht schon richtig auf und muss mit eine feine Dumont Pinzette erstmals entfaltet werden. Ein LR White Schnitt fließt schön vom Glassmesser ins Wasser und kann bequem mit eine Glaskugel aufgefischt werden.
Weiter müssen mehrere Farbmethoden Möglichkeiten Funktionieren aber soweit bin ich noch nicht. PAS wirkt gut und gerade festgestellt das DAPI im Fluoreszenz auch gut Funktioniert ohne das den Matrix Fluoresziert.
Auch hoffe ich das sich Insektenhaut nicht von das Harz löst sowie es geht mit Technovit.
Es ist also für noch zu früh um richtige aussagen machen zu können.
@Jürgen,
Diese Fixierung ist gleich wie mein Beitrag aus 2017 (http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=29907 (http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=29907))
Es ist Fixiert mit ein Gemisch von 2% Formalin und 2,5% Glutaraldehyde nach Karnovsky.
In LR White wird vorgeschrieben um nicht mit Glutaraldehyde zu Fixieren aber in Artikel lese ich öfters das man doch nach Karnovsky Fixiert. Ist noch zu früh um was gutes aussagen zu können.
Mit meine Zukünftige Mauser werde ich das sicher testen so auch wie es sich mit Mücken verhalt und Drosophila Larven kommen jetzt auch wieder reichlich vor.
Die Konzentration van das Eosin habe ich hier erhöht von 1% nach 5%, und das in Wasser.
@Heino,
Das ist ja interessant. Ich wusste gar nicht was ,conspicuously' bedeutet aber es ist ,leicht zu erkennen'. Das bedeutet also das die Paneth Kornerzellen beim Menschen PAS Positiv oder schwach Positiv sind. In meine zukünftige Mauser werde ich versuchen aus zu finden ob die Reaktion vielleicht abhängig ist wie es Fixiert wurde.
Gruße Ronald