Mikro-Forum

Foren => Mikrofoto-Forum => Thema gestartet von: CaDi in Oktober 10, 2009, 14:50:22 NACHMITTAGS

Titel: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: CaDi in Oktober 10, 2009, 14:50:22 NACHMITTAGS
Hallo,

hier ein Foto einer Rattenniere die ich auf 0,5µm am Rotationsmikrotom geschnitten habe (eingestellte 0,5µm). Wegen der Stabilität musste ich den Block (Paraffin) bei -25°C einfrieren, weswegen er sich anschließend auch etwas ausgedeht hat, um das Problem klein zu halten habe ich mich beeilt.

Gefärbt wurde mit KK, der Kernechtkombinationsfärbung, die ich von Klaus Herrmann bezogen habe. Diese eignet sich m.E. sehr gut dafür da sie sehr stark färbt und so selbst dünne Strukturen dargestellt werden können.

Das Foto entstand aus 2 Sichtfeldern, bei denen ich jeweils 4 Schärfebereiche  mit CombineZ5 kombiniert habe. Anschließend über Autostitch zusammengefügt und in Corel Photopaint 12 etwas aufgehellt etc.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/20911_39345664.jpg)

Man sieht einen Glomerulus mit dem Kapillarknäuel und der Bowman Kapsel. Sogar Podozyten können von Endothelzellen unterschieden werden. Wer genau hinguckt kann auch die Podozytenfortsätze sehen. Die Basalmembran erscheint knallig blau als Begrenzung der Kapillarlumen.
Der Harnpol mündet im proximalen Tubulus, der Bürstensaum ist deutlich zu erkennen.

Viele Grüße,
Carsten
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: Bernhard Lebeda in Oktober 10, 2009, 15:04:38 NACHMITTAGS
Hallo Carsten


sehr interessant! Ich fände es noch informativer für Nicht Histologen, wenn Du die beschriebenen Sachen im Bild mit Pfeil kenntlich machen könntest. Ich fühle mich sonst an meinen Lehrer im Mathe LK erinnert: " Wie man leicht sieht, folgt daraus..." Ich hab immer nie was gesehen  ;)


Mal zum Thema Rotationsmikrotom: so ein Teil wiegt doch locker 30-35 Kilo. Wo bewahrt man denn so was auf? Ich schätze mit meinem Spannplattensarbeitstisch hätte ich wohl eher schlechte Karten ???


Viele Grüsse


Bernhard
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: CaDi in Oktober 10, 2009, 15:23:20 NACHMITTAGS
Hallo Bernhard,

hier ein beschriftete Foto. Ich schau mir das mit den Tubuli nochmal an, dann beschrifte ich die auch.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/20913_25724423.jpg)

Die Präparate habe ich nicht zuhause geschnitten. Man braucht auf jeden Fall einen stabilen Tisch. Aber wenn man eine harte Platte auf einen normalen stabilen Tisch legt dürfte das eigentlich auch funktionieren.

Viele Grüße,
Carsten
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: Segu in Oktober 10, 2009, 15:37:06 NACHMITTAGS
Hallo Carsten

ich war bisher der Meinung, mit Paraffin könnte man nur bis 3-4my schneiden. Darunter gehe nur mit Histowachs.
Aber 0.5my ist schon sehr dünn, oder?
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: CaDi in Oktober 10, 2009, 15:43:59 NACHMITTAGS
Hallo Segu,

Du hast Recht, es ist sehr dünn. Aber z.B. in der Pathologie wird routinemäßig 1,5-2µm geschnitten, ist natürlich unterschiedlich je nach Labor. Aber es wird dafür immer gekühlt. Meist mit Kühlplatten, ich benutze weil ich sowas nicht habe einen -30°C Schrank. Das Tiefkühlfach geht aber auch. Ich konnte auch immer nur 5-6 Schnitte machen, danach war das Paraffin wieder zu weich. WEnn man langsam schneidet bringt das dann auch nichts, da deht sich der Block zu sehr aus.

VIele Grüße,
Carsten
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: CaDi in Oktober 10, 2009, 16:30:15 NACHMITTAGS
Hier ein etwas größerer Ausschnitt, Kapillare quer mit Podozytenfortsätzen. (die Knubbel auf der dunkelblauen Basalmembran)

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/20922_15478206.jpg)

Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: Fahrenheit in Oktober 10, 2009, 16:34:57 NACHMITTAGS
Lieber Carsten,

vielen Dank für die interessante Darstellung. Den Schnitt und die Bilder finde ich sehr schön!
Wie Bernhard bin ich auf die Beschriftung angewiesen, um bei der Beschreibung folgen zu können.
Schön, dass Du diese nachgeliefert hast.

Herzliche Grüße
Jörg
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: Sascha in Oktober 10, 2009, 17:59:07 NACHMITTAGS
Hallo Carsten,

sehr gute Dokumentation (mehr davon!) und ein sehr gutes Bild. Wir können ja morgen den gleichen Schnitt nochmals am Axioskop und dem Plan-Neo fotografieren, mal schauen ob die Qualität noch ein wenig zu steigen ist.

Sind das die KK-gefärbten Schnitte, welche wir am Donnerstag bei mir gemacht haben? Haben wir diese Schnitte nicht auch noch (3 Std. vorher) in HE gemacht? Wenn ja bringe die Beiden bitte mit!
Musstest du den SuSa-fixierten Block nicht umblocken, bzw. ist das nicht der zerbröselte Block gewesen? Oder war das ein anderer? Hast du die BlockNr. bzw liegt der Block bei mir oder hast du den mitgenommen.
Wenn der Block morgen da ist dann sollten wir bei mir gleich noch ein paar mehr schneiden, damit wir für deinen Kurs bei der BMG ein paar Präparate zum mitnehmen haben.

Geschnittene und gefärbte Grüße Sascha
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: Ralf Feller in Oktober 10, 2009, 20:35:39 NACHMITTAGS
Hallo Carsten,
die Schnitte sind super!
Ich kenne so etwas eigentlich nur als Semidünnschnitt aus Kunststoffen. Man kann fast schon elektronenmikroskopische Details erkennen. Welches Paraffin und welches Messer hast Du benutzt? Kann man am Rotationsmikrotom auch Kältespray benutzen?

Gruß Ralf Feller
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: CaDi in Oktober 11, 2009, 02:41:31 VORMITTAG
Hallo Sascha,

das war ein Schnitt den ich am Freitag noch schnell gemacht habe, unsere haben 2µm. Aber die unterscheiden sich nicht groß, das Mikrotom ist da auch wirklich an seinen Grenzen. Ich bin gespannt was da bei Dir rauskommt, bestimmt noch etwas schärfere Fotos.

Den Block habe ich umgeblockt, das war kein Problem und das Paraffin ist glaube ich Paraplast Plus oder so, muss ich nochmal schauen. Da sind auch durch das viele Umblocken andere Paraffinreste drin gelöst.

@ Ralf Feller
Es freut mich, dass das Foto gut ankommt. Ich habe extra dieses ausgewählt da es wegen der Färbung auch etwas wie ein Semidünnschnitt aussieht. Das Paraffin müsste wie gesagt Paraplast oder Paraplast Plus sein, da werde ich mal fragen. Das Messer ist ein R35, das in einen großen Einmalklingenhalter geschoben wurde.
Das mit dem Kältespray habe ich mal ausprobiert, das funktionierte sehr gut. War glaube ich eins das bis -35->-50°C kühlen konnte. Weil man ja nicht weiß wie das reagiert kann man einen Objektträger glatt auf den Block legen und darauf sprühen.
Das wichtigste dabei waren die Einbettkasetten die man in das Mikrotom einspannen kann. So konnte ich innerhalb von ca. 30sek. den Block einklemmen, ihn anschneiden und ca. 5 gute Schnitte machen. Dabei musste ich auch viel pusten. Das sorgt u.a. auch dafür dass die Schnitte gut über die Klinge gleiten und sich nicht aufrollen. Natürlich werden die durch das Pusten auch dicker, aber man sieht ja dass er trotzdem noch sehr dünn ist.

Viele Grüße,
Carsten
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: Ronald Schulte in Oktober 12, 2009, 11:17:30 VORMITTAG
Michel,

Zitat von: Segu in Oktober 10, 2009, 15:37:06 NACHMITTAGS
ich war bisher der Meinung, mit Paraffin könnte man nur bis 3-4my schneiden. Darunter gehe nur mit Histowachs.

Habe mich auch etwas Histowachs bekommen lassen aber die Erfahrungen damit sind sehr schlecht (vielleicht kein Erfahrung!).
Wenn ich das Block Schneide wird alles wie Pulver. Mann hört das Messer auch wie ein Hobel oder wie eine Milze die zu hart geworden ist.
Schreibe bitte mal was und wie du Histowachs gebrauchst? Ich habe den Histo 3 (56-58 Grad) von Chroma.

Grüße Ronald
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: wilfried48 in Oktober 12, 2009, 12:19:42 NACHMITTAGS
Hallo CaDi,

das beschriftete Foto gefällt mir auch sehr gut, zumal ich als Physiker dann wenigstens
auch eine Ahnung davon bekomme, was zu sehen ist.

Mit Vergrösserungsmassstab (µm Balken) wäre es natürlich noch vollkommener, da ich natürlich im Gegensatz zu den Biologen und Medizinern wenig über die Grössenordnung von Zellorganellen Bescheid weis.

viele Grüsse

Wilfried



Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: CaDi in Oktober 12, 2009, 13:33:58 NACHMITTAGS
Hallo,

das mit dem Schneiden ist immer etwas kniffelig. Der Block musste wirklich immer sehr kalt sein und blieb es nicht lange. Wenn man das mal mit Kältespray ausprobiert wird man den Unterschied merken. Ich würde den Block vorher aber trotzdem ins Kühlfach legen, dann fallen die nämlich fast nie vom Stempel.
Wenn der Block eingespannt und angeschnitten wurde kommt er wieder für ca. 5min ins Eisfach. Man kann das etwas beschleunigen wenn man die glatte Seite auf einen Objektträger legt und diesen dann auf das Metall des Eisfachs.
Wenn der Block schön durchgekühlt ist kann man ihn einspannen und mit einem neuen Einmalmesser (nicht das vom Anschneiden benutzen) mit 2-5µm den Block anschneiden bis man den ihn erreicht hat.
Beim ersten Anschneiden sollte man nicht mehr als 10µm einstellen, sonst können eher Strukturen im Block zerstört werden. Außerdem "poliere" ich den Block bevor ich ihn das zweite Mal ins Eisfach stelle nochmal indem ich erst mit ca. 5µm, dann mit 2µm und zum Schluss mit 0,5µm einige Male schneide. Dann bekomme ich natürlich keine Schnitte, der Block ist aber feiner angeschnitten.
Für diese Vorgehensweise braucht man natürlich diese Schnellspannkassetten, das lohnt sich aber auch. Zur Not (bei HOlzklotz etc.) kann man nach einigen Minuten im Eisfach später nur mit Eisspray arbeiten, aber nicht den Rest des Blocks vergessen einzusprühen, sonst fällt der noch leichter ab als sonst schon (ist dann ja härter vorne). Vor allem beim Anschneiden muss man vorsichtig sein. Und ich würde den Block nicht direkt ansprühen, sondern einen OT vorhalten.

Außerdem:
- Für besonders dünne Schnitte benutze ich dann immer ein neues Messer, und da auch nur die Mitte, den Rest kann man für andere Schnitte noch verwenden, aber das ist evtl. auch etwas esoterisch.
- Wichtige Stellen von Paraffin befreien. Z.B. dort wo man die Kassette einklemmt oder den Block einspannt sollte nicht viel Paraffin sein, das ist eher weich und der Block ist dann evtl. nicht optimal stabilisiert. (gilt auch für das Einspannen des Einmalmessers)
- Das Einmalmesser sollte genau aufliegen, deswegen drücke ich es an beiden Seiten vor dem Einspannen nochmal nach unten.
- Alle Hebel kräftig anziehen damit nichts locker ist
- Der Winkel ist oft entscheidend. Auch wenn alles stimmt kann der Winkel zu schlechten Schnitten führen. Das kommt aber auf das Mikrotom an welchen man einstellt. Bei einem ist genau 6° für die meisten Schnitte am besten, bei einem anderen 0°. Da kann man mit einem Probeblock etwas spielen.
- Für gute Schnitte ist genug Paraffin um das Präparat herum wichtig, es stabilisiert und man hat etwas Spielraum um den Pinsel anzusetzen

Vorstrecken
- Ich strecke auf einem kalten Wasserbad vor, evtl. auch bei schweren Schnitten davor noch eins aus 5-10% Ethanol.
- Beim Trennen der Schnittbänder bietet sich bei sehr dünnen Schnitten ein Deckglas an, mit der "scharfen" Seite lassen sich viele Bänder zerschneiden, mit der Spitze steche ich dafür in kleinen Abständen auf die Trennlinie ein.

Strecken
- Mache ich mit Eiweißglycerin, ca. 15-30ml pro 1,6L Streckbad bei 41-45°C
- Das Eiweißglycerin verbesser eigentlich alle Eigenschaften des Wassers. Die Schnitte bewegen sich nicht mehr so schnell. Luftblasen steigen sehr langsam auf und man überträgt mit der Zeit auch immer etwas Eiweißglycerin in das kalte Vorstreckbad. Dadurch lassen sich meine Schnitte besser mit dem Deckglas trennen.
- Das Wasser vorher abkochen (danke für den Tipp Sascha :-) ). Dann hat man eigentlich gar keine Luftblasen, auch bilden sich später unter dem Schnitt meist keine.
- Mit dem Eiweißglycerin sammelt sich später kein Wasser zwischen Schnitt und Objektträger. Saubere Objektträger muss man auch nicht vorher putzen, solche gibt es (ist drin was draufsteht, leider selten so).

Ich lasse die Objektträger nach dem Aufziehen für ca. 5-10min auf einem Papier an eine Wand angelehnt stehen (hochkant). Das Wasser kann dann so ablaufen. Anschließend für 15-30min in einen Wärmeschrank. Je nachdem ob der gut durchlüftet ist oder einfach nur heizt braucht es länger oder muss auch heißer eingestellt werden. Ich benutze einen gut belüfteten Schrank bei ca. 63°C. 70°C geht aber auch. Das Ziel ist es das Wasser komplett zu verdampfen, das Paraffin anzuschmelzen (kann auch etwas nach unten laufen) und bei Eiweißglycerin das Eiweiß zu denaturieren (soweit ich weiß).
Mir schwimmen so von 1000 Schnitten evtl. 1-2 ab, dann eigentlich auch nur wenn das Präparat schlecht ist.
In den letzten 2-3 Monaten habe ich ca. 1700 Präparate gefärbt (1000 davon maschinell), und davon sind soweit ich weiß weniger als 3 abgeschwommen.

Demnächst kann ich auch einige Fotos machen wie ich eindecke, ist fast narrensicher und es gibt fast nie Luftblasen (aber eine gleichmäßige Verteilung des Eindeckmittels). Gute Erfahrungen habe ich mit Cytoseal 60 gemacht, sehr dünnflüssig, Tropfen sind mit Xylol leicht zu entfernen und es härtet schnell ohne viel Schwund.

Zusammenfassend die Punkte für dünne Schnitte:
- Alles festziehen und säubern
- Kalter Block
- Neue Klinge, am besten die Mitte benutzen
- Pusten und gleichmäßig schneiden (sollte nicht zu langsam sein, eher etwas schneller), dabei wenn nötig mit dem Pinsel den Schnitt an das Messer drücken
- Glatte, parallel zur Messerkante zeigende Blockecken
- Die Bewegung zwischen den Schnitten schnell ausführen damit der Block sich in der Zeit nicht so stark ausdehnen kann

Es kann natürlich immer sein, dass das Mikrotom für so dünne Schnitte nicht geeignet ist, 0,5µm ist für ein sehr altes Rotationsmikrotom evtl. zu dünn (für neue natürlich auch) . Aber da kann ich keine Vergleiche machen weil ich fast nur mit einem neueren Gerät arbeite.

Ich kann davon sonst auch mal ein Video machen, wird aber etwas dauern.

Nähere Angaben zum Paraffin kann ich noch nicht machen, das Umblocken beschreibe ich dann später.
Zum Grössenvergleich bieten sich die Zellkerne an, die haben meist (wenn es nicht sehr langgestreckte Muskelzellkerne sind) 5-9µm. Erythrozyten 7µm und viele Leukozyten um die 10µm.

Viele Grüße,
Carsten
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: wasilis in Oktober 20, 2009, 14:36:09 NACHMITTAGS
Hallo
Sehr schöne Präsentation!!
Das sieht ja alles hochprofessionell aus, aber auch sehr sehr komplex. Ich bin auch auf den Weg zur Histopathologie und suche eine Mikrotom. Was kostet denn was brauchbares??

Gibt es so was wie Kurse um die nötige Technick und Fertigkeit zu erlernen??

Danke für die Pfeile auf dem Foto. Bin zwar Mediziner, doch sind nicht alle Details noch abrufbar.

Beste Grüße
Wasilis
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: CaDi in Oktober 20, 2009, 21:19:52 NACHMITTAGS
Hallo Wasilis,

ein neues Mikrotom würde ich erstmal nicht kaufen, da gibt es oft brauchbare Geräte bei Ebay für 150-400 Euro, je nach Zustand. Man müsste sich entscheiden ob es ein Rotationsmikrotom oder ein Schlittenmikrotom sein soll. Hat alles seine Vor- und Nachteile. Wenn Du eine Schnellspannvorrichtung finden solltest würde ich ein Rotationsmikrotom kaufen. (Neue Geräte 1000-3000 Euro, für Hobbyleute, die ganz guten entsprechend ein Vielfaches)
Ein Schlittenmikrotom hat aber eine Technik die man besser selbst reinigen kann. Da muss man sich entscheiden.

Von solchen Kursen weiß ich nichts. Aber es gibt das Treffen am Wohldenberg:
http://www.kg-bruegmann.de/9227.html?*session*id*key*=*session*id*val*

Man könnte hier im Forum mal versuchen etwas zu finden oder selbst zu organisieren. Aber es ist vielleicht auch möglich in einem MTA-Labor zu fragen ob man einmal vom Schnitt bis zum Eindecken alles selbst machen kann. Das konnte ich in Bremen machen, hat aber auch für 3 Std. ca. 70 Euro gekostet.
Es gibt hier in Berlin aber eine sehr aktive berliner mikroskopische Gesellschaft:
http://www.berliner-mikroskopische-gesellschaft.de/
Wenn Du mal in der Stadt bist könnten wir Dir das vielleicht mal zeigen.

Es ist aber auch nicht verkehrt sich selbst etwas einzuarbeiten, aber am besten nach einer kleinen Einführung von z.B. einem solchen MTA-Labor. Die Klingen sind wie Du bestimmt weißt sehr scharf und man kann eine Menge falsch machen.
Wo wohnst Du? Vielleicht findet sich im Forum hier jemand der Dir das mal vorführen kann.

Viele Grüße,
Carsten
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: Jürgen H. in Oktober 20, 2009, 21:30:09 NACHMITTAGS
Hallo Wassilis

Ein wohl professioneller Kurs, nicht ganz billig:

http://www.morphisto.de/unternehmen/aktuelles/news/artikel/27.html

Ich würde mich als Arzt eher an ein großes Krankenhaus wenden.

Mikrogrüße

Jürgen  Harst
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: CaDi in Oktober 20, 2009, 21:51:00 NACHMITTAGS
Hallo Herr Harst,

an dieses Angebot habe ich nicht gedacht, stimmt, die kannte ich auch. Leider sehr
teuer. Ich hatte schon Kontakt zu denen, sehr freundlich (telefonische Beratung, gratis).
Wenn man das als Weiterbildung abrechnen lassen kann bestimmt sehr gut :-)
Aber sonst...das Krankenhaus, ein MTA-Labor oder ein Mikroverein in der Nähe.

Viele Grüße,
Carsten
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: CaDi in Oktober 22, 2009, 23:44:17 NACHMITTAGS
Hallo,

nun nähere Angaben zu dem Paraffin...
Es handelt sich um Paraplast Plus welches nicht höher als 62°C erhitzt werden soll.
Das kann ich aber bei meiner Vorgehensweise nicht immer ganz ausschließen. Ich gehe so vor beim Umblocken.

1) Alten Block der umgeblockt werden soll für 2-4 Std. in Wärmeschrank legen, in ein Gefäß mit flüssigem Paraffin.
2) Einbettkassetten mit Bleistift beschriften, diese mit den Einbettförmchen in den Wärmeschrank legen
(es bietet sich an Metallflächen im Schrank mit Papiertüchern zu isolieren, denn die sind oft zu heiß)
3) Flüssiges Paraffin aus Vorratsbehälter im Wärmeschrank bei geöffneter Tür in Förmchen füllen und mit vorgewärmter Pinzette das Gewebe mit der Schnittfläche nach unten hineinlegen.
4) Förmchen aus dem Wärmeschrank nehmen und in der Luft halten. Nun hat man etwas Zeit um mit der Pinzette (oder so) das Gewebe auszurichten.
5) Vorsichtig (ohne dass das Gewebe aus der gewünschten Position verschwindet) das Förmchen mit dem flüssigen Paraffin und dem Gewebe auf einen flachen Untergrund legen. Es bietet sich an eine kalte Stahlplatte zu benutzen, da kühlt das Paraffin schneller ab.
6) Es bildet sich ein weißer Niederschlag am Boden des Förmchens, das Gewebe ist nun fixiert und man kann die warme Einbettkassette auflegen. Vorher tauche ich diese aber immer noch in flüssiges Paraffin ein damit sie später besser hält.
7) Nach und nach Paraffin nachfüllen bis der Rücken der Kassette ordentlich gefüllt ist.
8) 2-3min abkühlen lassen. Dann ganz vorsichtig am besten in die Kühltruhe (wenn man das ohne große Erschütterungen schafft, zur Not 15-20min stehen lassen). Wenn das Paraffin Stöße bekommt kann es unter Spannung geraten und später leicht aufplatzen wenn man es stark kühlt.
Es soll besser zu schneiden sein wenn man es schnell abkühlt...habe gute Erfahrungen damit gemacht und in der Pathologie gibt es dafür auch Kühlplatten (-4°C oder so)
9) Nach 5-10min in der Kühltruhe den Block umdrehen. Nach weiteren 2-5min den Block aus dem Förmchen lösen und die Gussränder abschneiden.

Diese Schritte habe ich mir nicht alle selbst ausgedacht, ich habe mir einiges in der Uni abgeschaut...
Den Block kann man gut aus der Form lösen indem man mit einer steifen Rasierklinge (diese mit Rücken) vorsichtig zwischen Paraffin und Metall der Wulst einschneidet und leicht hebelt. Wenn man lange genug kühlt kann man ihn oft schon ohne Weiteres herausheben.

Vor dem Schneiden umbedingt den Block in die Kühltruhe oder wenigstens den Kühlschrank stellen. Seitdem ich das auch vor dem groben Anschneiden mache ist mir kein Block abgefallen.
Nach 2-3min bei -18°C trimme ich den Block und schneide grob an (höchstens 10µm, Achtung, Block ist gekühlt sehr viel härter!-> fällt auch leichter ab wenn man dick anschneidet).
Nach dem Anschneiden Block in die Truhe (3-10min), Messer wenn nötig wechseln.
Nun Block in Schnellspannvorrichtung einklemmen, am besten schnell (aber mit kontrollierten Bewegungen + Messerschutz und festgestelltem Messer, vorsicht scharf) und mit wenigen Schnitten an dem Block antasten. Mit 3-5µm anschneiden und dann bei gewünschter Schnittdicke schneiden.

Achtung: Wenn man das Messer nach dem Anschneiden verschiebt ist die Klinge oft nicht mehr parallel zum Block, deswegen wenn es darauf ankommt lieber ein neues Messer nehmen und mittig schneiden (bei sehr wertvollem Gewebe z.B.).

Beizeiten mache ich evtl. eine kleine Fotodoku :-)

Viele Grüße,
Carsten


Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: Ronald Schulte in Oktober 23, 2009, 10:54:05 VORMITTAG
Carsten,

Sehr guten Beitrag. Ich gieße jetzt auch mit Einbettförmchen und Kassetten und Arbeite ungefähr gleich.
In Punkt 6. muss Mann richtig aufpassen das jetzt das Gewebe wirklich nicht mehr aus zu richten ist (fixiert is also fixiert, das Gewebe bricht an sonst absolut und Zwei Wochen Arbeit ist weggeworfen).
Abkühlen mache ich im Kühlschrank und geht gut. Das Block löst sich unproblematisch vom Gussform ohne zu Schneiden, Wricken usw (nach ungefähr 15 Minuten abkühlen).
Das grob anschneiden mit das Mikrotom mache ich zwar mit 15µm oder sogar 20µm aber mehr sicher nicht. Mann bricht hier schnell schönes im gewebeblock kaputt.
Schneiden ist bei mir auch nicht immer dasselbe. Manchmal kann ich ein ganzen Abend problemlos alle Geweben schneiden, nächstes mal lauft da niks mehr (Falten, Risse usw).
Luftfeuchtigkeit und Temperatur ist von Größe Einfluss. Luftfeuchtigkeit zu niedrig, wird alles magnetisch. Gute schneidetemperatur ist rund 19-20 Grad.

Bin auch schon dabei eine Fotoserie zu machen von die ganze Histologie. Gewebe Nehmen bis zu das Farben. Wird hier im Forum z.z. publiziert.
Einen Link zum mein Mikrotom schneiden ist hier zu finden. http://www.youtube.com/watch?v=qGyE4p9XanA&feature=related

Grüße Ronald
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: Sascha in Oktober 25, 2009, 20:49:10 NACHMITTAGS
Hallo liebe Forenmitglieder,

Carsten (CaDi), Günther Zahrt und ich sind schon seit ein paar Wochen am überlegen in Berlin wieder ein Schnippel-Wochenende zu organisieren.
In den letzten Jahren hat dieses Wochenende immer Robin Wacker als "Schnippel- und Färbeguru" in Berlin begleitet. Von Robin habe ich sehr viel gelernt und es ist immer eine Freude solch einem Meister seines Faches über die Schulter zu schauen - falls du mitliest DANKE nochmals Robin. Wir sind natürlich bereit im Rahmen eines Wochenendes diese Erfahrungen zu teilen und auch dem ambitionierten Anfänger die Möglichkeit zu geben an Mikrotomen der unterschiedlichen Bauarten zu üben. Vielen von dem was Carsten mittlerweile kann, ist allerdings die wirklich hohe Schule und selbstverständlich nicht an zwei Tagen zu lernen. Der Anfänger sollte sich im histologischen Bereich vielleicht erstmal an 5~10µm dünnen Schnitten versuchen (das ist auch schon verdammt dünn :-)). Das gibt auch sehr gute, informative und schöne Ergebnisse. Später kann man sich langsam an die wirklich dünnen Sachen wagen. Solch ein Wochenende bei der BMG wäre natürlich kostenlos, ihr wärt unsere Gäste, allerdings ist es gerne gesehen wenn Teilnehmer Material (Objektträger, Deckgläser, Einschlussmittel) und Chemie (Aqua dest., Xylol, Iso99, etc.) mitbringen. Das ist zwar kein Muss, gebietet allerdings die Fairness, denke ich. Allerdings kann man das auch telefonisch klären, denn wer einen längeren Anfahrtweg hat, muss sich nicht noch mit Litern von Chemie herumplagen. Ebenso sollte der sorgsame Umgang mit Chemikalien keine Probleme bereiten und etwas mikroskopische Erfahrung wird ebenfalls vorausgesetzt.
Im Rahmen solche eines Wochenendes kann dann natürlich auch gefärbt werden. Es werden dann natürlich nicht nur histologische Blöcke geschnitten sondern es können auch Pflanzenanatomische Schnitte angefertigt werden. Ich könnte mir vorstellen das Eckhard, wenn er Zeit hat, den einen oder anderen Färbe-Trick (bei pflanzlichen Material) zeigt und erklärt. Ein Hotel in unmittelbarer Umgebung kann auch empfohlen werden. Leider ist die Planung noch nicht komplett aber ich bin mir sicher, dass wir im nächsten Programm der Berliner-Mikroskopischen-Gesellschaft solch ein Schnippel-Färbe-Wochenende anbieten. Erfahhrungsaustausch garantiert!
Da hier die Frage nach solch einer Veranstaltung auftauchte möchte ich trotz des noch offenen Termines, stellvertretend für die ganze BMG eine Einladung aussprechen.
Wenn Interesse Besteht wäre eine Anmeldung (z.B. bei mir - Email gibt es immer auf der BMG-Webside) zwar keine Pflicht macht es uns aber leichter zu planen. Bei Fragen bin ich natürlich auch telefonisch zu erreichen die Nummer bekommt der erfahrene "Googler" selbst herraus oder ich schicke Sie ihm gerne per Mail. Tipps zur Unterkunft im Hotel gibt es ebenfalls gratis.
Wenn Interesse besteht, wird der Termin sobald er fest steht gerne hier bekannt gegeben.

So genug geschrieben (ich lese ja sonst nur :-)).

Gruß aus Hidden… ach ne bin ja wieder daheim - Gruß aus Berlin
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: Klaus Herrmann in Oktober 25, 2009, 20:55:03 NACHMITTAGS
Halo Sascha,

tolles Angebot von Euch! Wünsche gutes Gelingen!

ZitatVon Robin habe ich sehr viel gelernt und es ist immer eine Freude solch einem Meister seines Faches über die Schulter zu schauen - falls du mitliest DANKE nochmals Robin.

Hierzu kann ich auch nur sagen: Robin ist ein Meister! Und: er liest sicher nicht mit - er ist nicht im Internet vorhanden. Geht nur im direkten Gespräch, per Telefon, oder per Schneckenpost.
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: Sascha in Oktober 25, 2009, 21:05:55 NACHMITTAGS
Zitat von: Klaus Herrmann in Oktober 25, 2009, 20:55:03 NACHMITTAGS
Halo Sascha,

tolles Angebot von Euch! Wünsche gutes Gelingen!

ZitatVon Robin habe ich sehr viel gelernt und es ist immer eine Freude solch einem Meister seines Faches über die Schulter zu schauen - falls du mitliest DANKE nochmals Robin.

Hierzu kann ich auch nur sagen: Robin ist ein Meister! Und: er liest sicher nicht mit - er ist nicht im Internet vorhanden. Geht nur im direkten Gespräch, per Telefon, oder per Schneckenpost.

Lieber Klaus manchmal habe ich das Gefühl du schläfts/lebst im Forum ;-), so schnell wie du reagierst. Das Robin nicht im Netz der Netze ist habe ich mir gedacht aber man weiß ja nie....

Danke für die Wünsche.

Gruß Sascha
Titel: Re: Rattenniere, SuSa-Fixiert, KK-Färbung
Beitrag von: Sascha in Oktober 26, 2009, 17:00:37 NACHMITTAGS
Kurzes Update:

Ich habe mit Carsten(gestern) und Eckhard(heute) telefoniert. Beide sind mehr als gerne bereit (wenn es zeitlich passt) mit Tipps & Tricks in ihrem Gebieten den Wochenendteilnehmern zur Seite zu stehen. Der Termin wird noch ein wenig auf sich warten müssen ich bin mir aber sicher das wir dieses Wochenede mitte/ende 2010 organisieren.

Carsten zeigt und erklärt dann das Schneiden am Rotationsmikrotom.
Eckhard zeigt und erklärt Handmikrotom und Möhrenschnitte - Er färbt dann mit W3A (Wackerfärbung) in diversen Variationen (und da bin ich ebenfalls gespannt)
Ich würde dann das Schneiden am Schlittenmikrotom zeigen und mich ein wenig um das Entparafinieren, Aufziehen und Färben kümmern bzw. meine Tipps und Tricks zum besten geben.

Mit Günther Zahrt habe ich noch nicht telefoniert aber ich bin mir sicher, er zeigt ebenfalls einiges von seinem Können und steht hilfsbereit den Teilnehmern mit Rat und Tat zur Seite.

Sicher ist für jeden was dabei. Natürlich können die Teilnehmer nach Herzenslust selber Schneiden und Färben.

Gruß aus Berlin Sascha