Hallo
Ich hab da eine Frage zur Auflösung des Lichtmikroskopes. In einem Artikel fand ich folgendes
"In 1873, Ernst Abbe discovered that features closer than ~200 nm cannot be
resolved by lens-based light microscopy. In recent years, however, several new far-field
super-resolution imaging techniques have broken this diffraction limit, producing, for
example, video-rate movies of synaptic vesicles in living neurons with 62 nm spatial
resolution. Current research is focused on further improving spatial resolution in an effort
to reach the goal of video-rate imaging of live cells with molecular (1–5 nm) resolution"....
puplished in nature
Wie kann man das verstehen?? Sind die 200nm nun die Grenze der Auflösung oder nicht. Wenn nicht kann man diese hohe Auflösung auch mit "einfachen Methoden" überwinden??
Beste Grüße Wasilis
Hallo Wasislis,
die Antwort auf Deine Frage ist ein klares Jein. Es gibt seit ein paar Jahren Verfahren, die alle auf der Fluoreszenzmikroskopie beruhen, mit denen dadurch erzeugte selbstleuchtende Strukturen (z.B. Proteine) mit einer Auflösung von bis zu 20 nm lokalisiert werden können. Die Bildgebung erfolgt mit hohem mathematischem Aufwand durch den Computer. Es sind durchweg eher indirekte Methoden. Die Physik, die dahinter steckt ich ziemlich kompliziert und ich bin nicht in der Lage die einzelnen Verfahren hier sauber darzulegen. Jedenfalls ist das Abbe'sche Gesetz nicht augehebelt.
Detlef
Hallo Wasilis,
ich betreibe etwas UV-Mikroskopie mit einer UV-LED als Quelle. Mit allen erdenklichen Hard- und Softwaretricks erreiche ich damit gerade 160 nm bis 170nm als Auflösungsgrenze, also nur gering unter der üblichen 200nm Marke.
Mehr ist sicher mit bezahlbarer Technik kaum zu machen.
Gruß
Peter
Hallo,
oft wird ja bei der Vorstellung solcher hoch-auflösender Verfahren reiserisch vermerkt, dass die Abbe´schen Gesetze überlistet worden seien. Das ist natürlich nicht richtig. Herr Kramer hat es ja angedeutet: die Abbe´sche Theorie gilt ausschließlich und weiterhin uneigeschränkt für Nicht-Selbstleuchter, also Objekte, die über eine Beleuchtungseinrichtung illuminiert werden und nicht von selbst, von innen heraus selbst leuchten. Für Selbstleuchter- wie sie im Falle der Fluoreszenzverfahren vorliegen - gelten andere Gesetze, hier ist die theoretische Auflösungsgrenze dtl. niedriger.
Beste Grüße !
JB
Hallo JB,
der Knackpunkt ist also, ob das Objekt ohne Fremdlicht leuchtet oder nicht. Objekte im Dunkelfeld erfüllen diese Prämisse also nicht?
Gruß - E. Nowack
Präzisierung:
Fremdlicht muß also höherfrequente Lichtemissionen am Objekt induzieren? Normales Dunkelfeld ermöglicht also keine höhere Auflösung?
Lieber Eckhard,
die Sache ist leider etwas komplizierter. Zum Prinzip der Fluoreszenzmikroskopie: entsprechende Farbstoffe werden an die zu lokalisierenden Proteine (z.B.) gekoppelt. Durch bestimmte Manipulationen gelingt es nun, dass Licht (im sichtbaren Bereich) nur von diesem, sagen wir 30 nm messenden Molekül ausgeht. Dieses Signal liegt natürlich auch auf einer Zeitskala. Das Signal würde ein Bild ergeben, das 200 nm Durchmesser entspricht. Aber das kann man heraus rechnen, wenn man weiß, wie die Helligkeit im Abstand von eben 30 nm ist. Wie, frag mich nicht, das ist auch mir zu kompliziert und es gibt auch ganz unterschiedliche Methoden. Das ist wirklich keine physikalisch ordentliche Erklärung, aber die ist verfügbar, nur leider nicht leicht verständlich.
Zum Dunkelfeld: hier bekommst Du ein Signal, das fast völlig unabhängig von der Größe des Objekts ist. Aber das Bild ist immer ein Beugungsscheibchen, das einem Durchmesser von 200 nm entspricht. Wenn du aber wüsstest, wie die Helligkeit eines solchen Objektpunktes in einem geringen Abstand reduziert ist, kannst Du auf die Größe schließen. Das geht beim Mikroskop natürlich nur mit einem gerasterten Laser-Strahl und eben viel Mathematik. Ich habe es bis heute nicht wirklich verstanden - es ist halt kompliziert und es gibt sehr unterschiedliche Verfahren.
Herzliche Grüße
Detlef
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Ohne viel von der Mathematik zu verstehen,
erkennt man auf dieser Tabelle den Unterschied zwischen der maximalen Auflösung und der Grenze der Erkennbarkeit.
Bis auf den Anwendungsfall der geraden Beleuchtung ist der Nenner in den Formeln gleich, man kann sich also auf den Multiplikator der Wellenlänge λ konzentrieren.
Selbstverständlich zeigen unterschiedliche Beleuchtungswellenlängen und numerische Objektivaperturen ihren bereits bekannten Einfluss.
Die Angaben stehen nur für aberrations- und reflexlichtfreie Mikroskope mit sehr gut korrigierten Optiken bei monochromatischem Licht.
aus: Einführung in die neueren Methoden der Lichtmikroskopie / M.Françon / 1967
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures006/22473_22616502.jpg) (http://www.fotos-hochladen.net)
Freundliche Grüße
Frank
Lieber Frank,
How can I understand a 'gerade noch erkennbaren schwarzen Scheibchen/Linie auf hellem Grund' for a Selbstleuchter oder fluoreszierendes Objekt?
Interestingly though, the Grenzauflosung of darkfield is similar to that of brightfield. Also, it seems Linien are easier detectable then Scheibchen, does that imply diatom striae would be easier to detect then rows of pores? (assuming same thickness of silica in striae and in between pores).
Questions, questions. My intuition needs a boost.
ZitatIch habe es bis heute nicht wirklich verstanden - es ist halt kompliziert und es gibt sehr unterschiedliche Verfahren.
Glad I'm not the only one, Detlef, I was starting to doubt myself on the matter of darkfield.
Grüße
René.
Hallo zusammen,
entschuldigung, dass ich mich erst jetzt melde (nachdem ich ja ein bisschen "mitschuld " bin, dass diese Diskussion losgetreten wurde).
Zum Dunkelfeld: Es dürfen hier zwei Begrifflichkeiten nicht durcheinander geworfen werden: Auflösung und Erkennbarkeit.
Auflösung beschreibt den Umstand, dass zwei eng beiananderliegende Objekte noch als zwei getrennte Objekte differenziert optisch wahrnehmbar sind; nur dann sind sie "aufgelöst". Wenn zwei Objekte zu nahe beieinander liegen, werden sie als eine einheitliche Struktur abgebildet bzw. wahrgenommen, sie sind dann nicht aufgelöst. Das Auflösungsvermögen hängt nach den Abbe´schen Gesetzen ab von Wellenlänge, Apertur des abbildenden Systemes und Apertur des beleuchtenden Systems. Rechnerisch lässt sich zeigen, dass das maximal mögliche Auflösungsvermögen für alle Beleuchtungsverfahren gleich, also auch für die Dunkelfeldbeleuchtung nicht höher ist. Abbe ging dabei von dem Idealfall einer monochromatischen Beleuchtung und abberationsfreiser Abbildung aus. Unter diesen Bedingungen beträgt das maximal erreichbare Auflösungsvermögen, angegeben als kleinstmögliche gerade noch trennbare Distanz d = Wellenlänge / (2 x num. AperturObjektiv). Realiter ist das Auflösungsvermögen schlechter, da zum einen in aller Regel die Apertur des beleuchtenden System niedriger gehalten werden muss als die des abbildenden Systemes, desweiteren es vollkommen abberationsfreie Abbildung nicht gibt und unter anderem auch die Kontrastverhältnisse eine Rolle spielen (Airy´sche Abbildungstheorie).
Erkennbarkeit beschreibt den Umstand, dass erkannt werden kann, dass überhaupt ein Objekt da ist. Eine solche Abbildung muss absolut keine Ähnlichkeit mit dem eigentlichen Objekt haben, insbesondere dann nicht, wenn das Objekt sehr klein ist. Dass ein Objekt, sozusagen überhaupt etwas vorhanden ist, kann am besten dann erkannt werden, wenn zwischen dem Objekt und der Umgebung ein möglichst großer Kontrast vorhanden ist (am günstigsten schwarzer Hintergrund, helle Objekte). Unter idealen Bedingung eines möglichst großen Kontrastes hängt die Erkennbarkeit letztlich nicht mehr von der Größe des Objektes, sondern nur noch von der Beleuchtungsstärke ab. Man erkennt dann ein hell leuchtendes Pünktchen, genauer Airy´sches (Beugungs-) Scheibchen. Sind in dieser Situation zwei solch kleine Objekte näher beieinander als das Auflösungsvermögens des verwendeten optischen Systems hergibt, werden sie eben als ein Objekt wahrgenommen, man sieht nur ein helles Pünktchen / Scheibchen. Deshalb funktioniert diese Art der Beleuchtung auch nicht mehr, wenn zuviele Objekte zu dicht liegen.
Zu den Verfahren mit den Selbstleuchtern hat , so denke ich, Herr Kramer die anschaulichste Erklärung gegeben. Genaueres mit theoretischem Hintergrund und für mich auch verständlich Nachvollziebares habe ich bis jetzt auch nicht finden können.
Beste Grüße !
JB
Hier wurde viel unterschieden zwischen Selbstleuchtern und nicht-Selbstleuchtern. Auf der Tabelle, die Frank Donat eingestellt hat, sieht man aber, dass der Einfluss nicht so gravierend ist. Zwar gibt es tatsächlich einen theoretischen Unterschied, ob ein Objekt koherent oder inkoherent beleuchtet wird (Selbstleuchter dürften wohl immer inkoherent leuchten). Die so berechneten Auflösungsgrenzen bleiben aber innerhalb der gleichen Größenordnung.
Verfahren, die diese Grenze um ein Mehrfaches überschreiten, benutzen ganz andere Prinzipien. Zum Beispiel Rasterverfahren, wo ein Detektor (Mini-Lochblende) mit weit höherer mechanischer Präzision bewegt wird.
Eine andere Frage ist der Kontrast des Objekts selbst. Wenn in einer Zelle nur bestimmte interessierende Teilchen (Moleküle) leuchten und alles andere stock-dunkel bleibt, sind diese natürlich viel, viel besser zu erkennen, als wenn das ganze Gewusel aus Organellen, Filamenten und Membranen Licht absorbiert und reflektiert. Egal, welches Abbildungsverfahren (mit welcher Auflösungsgrenze) man dann wählt.
Grüße Udo
Zitat von: Udo Hammermeister in November 10, 2009, 00:42:16 VORMITTAG
Eine andere Frage ist der Kontrast des Objekts selbst. Wenn in einer Zelle nur bestimmte interessierende Teilchen (Moleküle) leuchten und alles andere stock-dunkel bleibt, sind diese natürlich viel, viel besser zu erkennen, als wenn das ganze Gewusel aus Organellen, Filamenten und Membranen Licht absorbiert und reflektiert. Egal, welches Abbildungsverfahren (mit welcher Auflösungsgrenze) man dann wählt.
Genau das beschreibt die Tabelle mit dem Vergleich der unterschiedlichen Bedingungen,
wobei wir den Anwendungsfall der Fluoreszenzmikroskopie, für die Beantwortung der Frage nach der Auflösung, wohl nicht betrachten dürfen.
( dies wird in dem Beitrag von Herrn Boschert unter "Erkennbarkeit" und in der Tabelle unter "Grenze der Erkennbarkeit eines hellen Scheibchens auf schwarzem Untergrund" verdeutlicht )
Um nun der Frage nach einer hohen Auflösung mit "einfachen Mitteln" gerecht zu werden, sind doch nur die Wellenlänge der Beleuchtung und die Objektivapertur zu nennen (?) ...
... und ... vielleicht junge Augen, die mit der kurzwelligeren Strahlung noch mehr anfangen können als die alten "Äpfel" :-\ .
Liebe Grüße
Frank