Liebe Mitmikroskopiker,
Bei den Schnittbändern meiner Insekten bilde ich Schnittbänder von ca 8 Schnitten. Es passen etwa 4 Schnittbänder untereinander auf einen Objekträger; so würde ich sie jedenfalls gerne möglichst parallel anordnen.
Zum Aufkleben benutze ich nur Wasser. Leider ist die Oberflächenspannung doch recht stark, so dass das Anordnen der Schnittbänder manchmal etwas schwierig ist.
Setzt man dem Wasser - auch um die Haftung der Schnitte zu verbessern - etwas Eiweißglycerin zu, lassen sich die Schnittbänder hingegen sehr leicht anordnen. Nur: Gerade bei den Insekten gibt es oftmals ziemlich große Leerräume. Zum Beispiel der Vorderdarm vom Phyllium erscheint im Längs- bzw. Querschnitt als ziemlich großes leeres Loch. Klebe ich auch nur mit sehr wenig Eiweißglycerin auf, dann färbt sich dort der Untergrund sofort bei der folgenden H-E Färbung unschön mit an. Und im Übrigen habe ich auch Eiweißglycerin regelmäßig nicht nötig, die Schnitte haften auch nur mit Wasser meist vollständig, was einen wunderbar sauberen Untergrund ergibt. Hat jemand Erfahrung mit irgendwelchen Detergenzien, die die Oberflächenspannung herabsetzen, ohne den folgenden Entparaffinierungs- Alkoholstufen- und Färbeprozess Prozess zu stören?
Mikrogrüße
Jürgen Harst
Lieber Jürgen,
ich kenne das Problem mit der Glyceringelatine auch.
Es gibt bei Chroma ein spezielles Detergenz für so etwas, aber es geht mit jedem Spülmittel. Ich verwende weniger als einen Tropfen, d.h. ich benetze nur die Spitze einer Pipette mit Spülmittel, tauche diese dann in die etwa 100ml Wasser die ich zum Strecken verwende. Gestreckt wird auf einem Heiztisch (60°C).
Also, ich gebe ca. 1ml dest. Wasser mit Detergenz auf den geputzten Objektträger, dann das Schnittband mit dem Pinsel auf die Wasseroberfläche, dann den Objektträger auf die Heizbank, Schnitte strecken sich, Restwasser mit etwas Zewa wegnehmen und dabei die Schnitte orientieren. Auf der Streckbank sollte das Paraffin nicht anschmelzen. Wichtig bei meinen Schnitten ist dann das Trocknen im Wärmeschrank bei 40°C über Nacht, oder besser länger.
Einen schönen Sonntag,
Ralf
Hallo, lieber Ralf,
ganz herzlichen Dank für Deine Nachricht. Ich habe mir gedacht, dass das mit Spüli funktieren müsste, wollte aber nicht einfach eine Schnittserie mit einem Versuch riskieren.
Alle anderen Punkte mache ich übrigens genauso wie Du, nur dass ich mangels Wärmeschrank meine Schnitte schlicht auf dem Strecktisch lasse und die Temperatur etwas herunterregele. Dort liegen sie dann unter einer Glasglocke gegen den Stau bis zum nächsten morgen. Dann lasse ich sie nocj etwas im Präparatekasten bis ich sie weiter verarbeite.
Auch Dir einen schönen Sonntag und schönen Gruß!
Jürgen
Ich habe gute Erfahrungen mit coated Objektträgern spez. für die Histologie gemacht. Da haften die Schnitte wunderbar drauf.
Hersteller kann ich bei Bedarf raussuchen.
Hallo Herr Harst,
beim Aufkleben von Paraffinschnitten gibt es zwei Möglichkeiten. Bei der ersten Methode werden die Paraffinschnitte in einem Wasserbad gestreckt, mit einem mit Eiweißglycerin beschichteten Objektträger abgefischt und getrocknet. Bei der zweiten Methode wird ein mit Eiweißglycerin beschichteter Objektträger mit einem dünnen Wasserfilm überzogen. Die Einzelschnitte oder Schnittbänder werden auf diesem Wasserfilm orientiert, bei ca. 50 Grad Celsius gestreckt, der Überschuss an Wasser abgegossen und die Objektträger 24 Stunden bei 50 Grad Celsius im Wärmeschrank getrocknet. Letztere Methode wird von mir bevorzugt.
Nun noch ein Wort zum Beschichten der Objektträger mit Eiweißglycerin. Häufig wird das Eiweißglycerin in viel zu dicker Schicht aufgetragen. Wenn Sie käufliches Eiweißglycerin (z.B. von Chroma) im Verhältnis 1:1 oder 1:2 mit destilliertem Wasser verdünnen, diese Ansätze (wenn möglich) zentrifugieren und die Überstände zum Beschichten nehmen, dürften keine Matrixfärbungen mehr auftreten (H&E / Azanfärbung). Beim Beschichten sollten Sie einen Tropfen des verdünnten Eiweißglycerines mit der Fingerbeere gleichmäßig auf dem Objektträger verteilen. Anschließend ziehen Sie mit einem gefalteten Kosmetiktuch die beschichtete Oberfläche ab. Bei einer richtigen Beschichtung darf nur noch ein leichter "Fettglanz" im Seitenlicht zu beobachten sein. Aufgebrachtes Wasser muss sich ohne ein Zusammenfließen auf dem gesamten Objektträger (am besten aus Weißglas) verteilen lassen. Bitte achten Sie auch auf zuvor vollständig entfettete Objektträger.
Sollten in Ihren Schnitten Hohlstrukturen (z.B. nicht Paraffin-gefüllter Darm, nicht vollständig infiltrierte Muskulatur) vorhanden sein, muss das Strecken besonders umsichtig vorgenommen werden. Hierbei sollten die Schnitte dem Wasser so kurz wie möglich und bei möglichst niedriger Strecktemperatur ausgesetzt sein. Hohlstrukturen erweiteren sich ansonsten beim Strecken zu riesigen Gebilden. Nach dem Sie beobachtet haben, dass die Streckung vollständig ist, entfernen Sie sofort das Restwasser und trocknen die Schnitte bei 50 Grad Celsius. Bei Paraffinschnitten mit hohem Muskel- und/oder Kollagenanteil ist beim Strecken mit einer starken Quellung der zuvor entwässerten Gewebeanteile zu rechnen. So können Schnitte von Regenwürmern während des Streckens vollständig entarten. Auch hier ist ein umsichtiges Vorgehen, eine Beobachtung des Streckverlaufes und ein rechtzeitiges Beenden des Streckvorganges besonders wichtig.
Vielleicht helfen Ihnen diese Ausführungen bei Ihrer weiteren Arbeit.
Viele Grüße!
Dieter Stoffels
Hallo Jürgen,
ZitatIch habe gute Erfahrungen mit coated Objektträgern spez. für die Histologie gemacht. Da haften die Schnitte wunderbar drauf.
Hersteller kann ich bei Bedarf raussuchen.
Falls Du diesen Weg ausprobieren möchtest, diese speziellen Objektträger gibt es z.B. bei Roth. R. liefert aber nicht mehr an privat. Notfalls könnte ich bei der Beschaffung behilflich sein.
Gruß
Detlef
Lieber Herr Stoffels, lieber "Isoplexis", lieber Detlef,
Ganz herzlichen Dank für eure Mitteilungen, besonders für Ihre "Isoplexis" sorgfältig formulierten Anweisungen.
Allerdings kommt es mir weniger auf eine zuverlässige Aufklebemethode an. Das funktioniert, wie gesagt, bei mir mit einem gründlich geputzten Objektträger allein mit Wasser sehr zuverlässig und bestens. Auch habe ich noch soviele Objekträger vorrätig, dass ich für mein Mikroskopikerleben damit ausreichen werde und würde mich ein wenig genieren, jetzt noch eine neue Tranche Histologieträger zu ordern. Problematisch ist allein die Oberflächenspannung des Wassers beim Ordnen der Paraffinbänder, dafür hilft Eiweißglyc natürlich auch, oder eben Spüli, wie Ralf mitteilte. Wenn ich mir allerdings die Spülipolbilder nebenan ansehe....Vielleicht sollte ich nur etwas Glyc dem Wasser zusetzen. Mehr "Klebes" als Wasser brauche ich wie gesagt ansich nicht. Auch die Wässerung nach der Hämotoxfärbung im bewegten Wasser überstehen meine Schnitte gut.
Nochmals herzlichen Dank!
Jürgen Harst
Hallo Herr Harst,
wenn man etwas Eiweißglycerin in das Streckbad gibt verteilt es sich so regelmäßig und dünn auf dem OT, dass man es später bei der Färbung
fast nie sieht, kommt auch darauf an wie stark konzentriert die Farblösungen sind.
Zur Not einfach nach jedem Schnittband trocknen lassen, was natürlich sehr aufwändig wäre.
Ich habe bei dem Eiweißglycerin sogar das Gefühl, dass kleinste Mengen davon reichen. Beim Übertragen vom Vorstreckbad auf das Streckbad und zurück konnte ich merken wie die Eigenschaften des Vorstreckbads verbessert wurden. Also wenige Tropfen würde schon eine Verbesserung bringen.
Eine andere Idee:
In das Vorstreckbad etwas Eiweißglycerin (oder nur Glycerin), dann in ein zweites kaltes Vorstreckbad aus Aqua dest., danach in das warme Streckbad. So kann man es evtl. etwas abwaschen. Mache ich beim Vorstrecken mit Ethanol so.
Man könnte etwas mit den Konzentrationen und anschließenden Differenzierungsschritten spielen. Also z.B. 0,1% Eosin mit sehr wenig Eisessig, viel in Aqua dest ausspülen um die Säure herauszubekommen, und dann sehr schnell die nächsten Stufen bis zum Xylol. Schwache Farbstoffe, lange färben und schnell differenzieren und entwässern.
Viele Grüße,
Carsten
Hallo Herr Harst,
ich habe nun verstanden, dass es Ihnen vornehmlich um die Anordnung Ihrer Schnitte geht. Da ich selbst am liebsten mit einem Schlittenmikrotom schneide, fallen bei mir in der Regel Einzelschnitte, nicht Schnittbänder an. Auf einem dünn mit Eiweißglycerin beschichteten Objektträger ist es möglich, selbst kleinste Paraffinschnitte in Längs- und Querreihen (je nach Vorliebe des "Leserasters") anzuordnen. Die Beschichtung mit Eiweißglycerin dient hierbei nicht nur als Kleber, sondern ermöglicht ein lückenloses Benetzen des Objektträgers mit Wasser. Bei Paraffinschnitten mit kleiner Fläche gebe ich nur einzelne Wassertropfen in Reihe auf den beschichteten Objektträger und übertrage hierauf die Paraffinschnitte. Auf einer Wärmebank strecke ich die Schnitte in ihrem Wassertropfen und trockne sie anschließend im Wärmeschrank bei 50 Grad Celsius. Bei einer Zugabe des Eiweißglycerins in das Wasserbad oder durch ein Abfischen ist eine derartige Orientierung von Schnitten sicher nicht möglich.
Viel Spaß beim Schneiden!
Dieter Stoffels
Man kann mit etwas Übung die Schnittbänder nebeneinander anordnen, auf dem Streckbad mit Eiweißglycerin. Denn es sorgt dafür dass
sich die SChnitte darauf kaum bewegen, lediglich die Haftung ist im Wasser nicht mehr so gut.
Wenn Sie das mit der Streckplatte machen wollen umbedingt vorher das Wasser abkochen, dann bekommt man in der Regel keine (!) Luftblasen.
Viele Grüße,
Carsten
Hallo in die Runde
vielleicht erfahren die Fortgeschrittenen nichts neues, aber mir, der sich gerade in die Materie einarbeitet, hilft sehr diese Serie hier:
http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/artfeb07/yl-para2.html
Viele Grüsse
Bernhard
Hallo Bernhard,
vielen Dank für den Link, kannte ich noch nicht. Ich würde aber an Deiner Stelle versuchen so schnell wie möglich
an eine Schnellspannvorrichtung zu kommen. Die ist wirklich pures Gold wert, und m.E. reduziert es die Gefahr bei der
Arbeit mit dem Gerät enorm.
Wenn Du wertvolle Gewebe hast und die Einstellung nicht änderst geht das Anschneiden sehr schnell und ohne große Verluste
von Material.
Viele Grüße,
Carsten
Hallo Jürgen,
Zitat von: Jürgen Harst in November 15, 2009, 22:38:43 NACHMITTAGS
Problematisch ist allein die Oberflächenspannung des Wassers beim Ordnen der Paraffinbänder..
vor beinahe unendlicher Zeit habe ich Filme selbst entwickelt. Damit das Wasser sauber abläuft und keine Flecken hinterlässt, wurde ein Tröpfchen "Agepon" zugesetzt. Damals gab es das als Konzentrat. Wenn Du heute googelst, findest Du es in Litergebinden, wohl bereits gebrauchsfertig. Das könnte eventuell Dein Problem lösen.
Viele Grüße
Klaus
Mein Tipp aus dem hohlen Bauch: Triton X-100 oder ein anderes reines Detergenz aus dem Laborhandel. Das Problem mit Spüli u. Co. ist, dass sie sie Mittel zum Rückfetten der maltraitierten Haut der empfindliche Hausfrauen-Hände u a. (Parfüme) enthalten. Aus dem SB-Markt kommt dem Ideal noch am ehesten "Fairy sensitiv" nahe, glasklar und weitgehend frei von unnötigen Zusätzen. Das soll bitte keine Werbung sein, ich verdiene daran keinen cent. Wahrscheinlich gibt es Dutzende anderer Mittel, die den gleichen Zweck ebenso gut erfüllen.
Herzliche Grüße
Detlef Kramer