Hi liebe Forumsmitglieder,
vorab, dies ist mein erster Beitrag. Zuerst wollte ich unter "Histologie" posten, aber dort kann ich leider kein neues Thema öffnen...daher nun hier. Ich hoffe das ist in Ordnung.
Ich bin relativ neu im Thema Histologie, zumindest was das Praktische angeht. Mein Ziel ist es, Blutegelproben (mehrere kleine Stücke, ca. 5 mm x 5 mm x 3 mm) in Paraffin einzubetten, zu schneiden, und dann mit der Trichrom-Färbemethode nach Mallory anzufärben, um Muskel- und Bindegewebe klar voneinander unterscheiden zu können.
Die Einbettung hat wider Erwarten beim ersten Versuch ganz gut geklappt, ebenso das Schneiden. Klar ist dort angesichts meiner bisher sehr geringen Erfahrung sowohl mit der Einbettung als auch dem Schneiden noch viiiiel Luft nach oben, aber dafür brauche ich wohl einfach Zeit und Training.
Nun bin ich gerade an den Färbeschritten und hätte dazu eine kleine Detailfrage zur Entparaffinierung und der anschließenden Rehydrierung, auf die ich bisher keine für mich befriedigende Antwort gefunden habe:
Wie oft wechselt ihr eure Alkohol- bzw. Entparaffinierungs-Lösungen? Zu diesem Thema habe ich in Protokollen/Büchern bisher immer nur Details zu Xylol gelesen, à la "Die Xylolbäder zum Entparaffinieren müssen regelmäßig gewechselt werden".
Ich verwende zum Entparaffinieren Roti-Histol, 3x10 Minuten, gefolgt von einer absteigenden Alkoholreihe 2x5 min EtOH 99,8%, 2x5 min EtOH 96%, 2x5 min EtOH 80%, 2x5 min 70%, 3x5 min Aq. dest.(die Schritte werden so von der Firma ROTH empfohlen, wenn man Roti-Histol verwendet).
Bei meinen ersten zwei Färbeversuchen habe ich die Flüssigkeiten direkt entsorgt, aus Bedenken, sie könnten schon zu sehr verschmutzt sein. Nun wurde ich aber wegen des hohen Verbrauchs doch etwas nachdenklich und habe beim letzten Färbeversuch nur das erste Roti-Histolbad und das erste Bad Absolut-Ethanol verworfen, den Rest möchte ich gerne mehrfach verwenden. Über das erste Alkoholbad nach dem Entparaffinieren, sei es nun mit Roti-Histol oder Xylol, habe ich gelesen, dass es so rein wie möglich sein soll, da sich Xylol/Roti-Histol nicht mit Wasser mischen lassen.
Die einzige Verunreinigung, die ich mir für das erste Alkoholbad vorstellen könnte, wäre jedoch "nur" durch Roti-Histol, was ja eigentlich (zumindest in Maßen) nicht weiter schlimm sein sollte. Und auch das erste Roti-Histolbad kann ja eigentlich nur durch Paraffin "verunreinigt" werden, wobei beim nächsten mal dort ja auch wieder nur Objektträger mit Paraffin reinkommen. Die weiteren Alkoholbäder können ja durch das Überführen der Objektträger eigentlich nur stärker werden, was sich wieder ausgleichen würde, wenn man sie vor dem Eindeckeln für die aufsteigende Alkoholreihe wiederverwendet.
Habt ihr da irgendwelche Erfahrungswerte, die ihr mit mir teilen könnt/wollt? ;D
Viele Grüße
Lukas
Hallo Lukas,
du hast völlig recht.
Dier erste Stufe Rotihistol wechselt man wenn sie mit Paraffin gesättigt ist, das hängt natürlich davon ab mit welchem Volumen Du arbeitest. Dann kannst Du das zweite Gefäß mit Rotihistol an die Spitze setzen und am Ende neu auffüllen. Genau so ist es mit dem 99,8% EtOH, wenn da zu viel Rotihistol in die zweite Stufe gelangt entstehen in 96% weiße Schlieren.
Wenn Du nur kleine Schnittserien machst empfehle ich Objektträgertransportbehälter
https://www.laborbedarfshop.de/kunststoffprodukte/proben-und-versandgefaesse/objekttraeger-transportbehaelter?sPartner=googleshoping?&ordernumber=GT00347&gclid=EAIaIQobChMIsvijp7Xm6gIVieN3Ch2iMQAfEAQYASABEgJUg_D_BwE
Ich würde auch nicht mit Trichrom beginnen, sondern erst einmal mit HE.
Hier ist mein Färbeprotokoll:
HE Färbeprotokoll
1. Tissue-Claer 4 min
2. Xylol 4 min
3. Xylol 4 min
4. Isopropanol 4 min
5. Bioethanol abs 4 min
6. Ethanol 96% 4 min
7. Ethanol 85% 4 min
8. Etanol 70% 4 min
9. Ethanol 50% 4 min
10. AQ dest 4 min
11. Hämalaun 2 min
12. AQ dest gut spülen
13. Ammoniak eintauchen
14. Leitungswasser 15 min
15. AQ dest 5 min wenn zu blau, HCl Alk
16. Eosin mit spur Essig 5 min
17. AQ dest gut spülen
18. Ethanol 70% max 1 min
19. Ethanol 96% 4 min
20. Isopropanol 4 min
21. Isopropanol Küvette 4 min
22. Xylol 4 min
23. Xylol 4 min
viel Erfolg, und zeig mal Deine Schnitte.
LG Ralf
Guten Abend
Eine andere Lösung ist Regeneration, dabei ersetzt du z.b. 20% der Flüssigkeit durch neue.
Ich verwende 2 Bäder Rotihistol und im dritten Schritt das klassische Xylol. Damit habe ich gute Ergebnisse erzielt👍
Der Tipp habe von einem Arzt bekommen der hauptberuflich In der Histo arbeitet und das funktioniert seit vielen Jahren.
Liebe Grüße
Gerhard
Hallo Lukas,
auch von mir ein Tipp für eine kleine Schnittserie: Ich verwende eine Brotbox mit zwei Bohrungen auf jeder Seite durch die Gewindestangen geführt sind welche durch kleine Muttern in Position gehalten werden. Darauf finden bis zu 4 Objektträger gleichzeitig Platz und die Reagenzien werden mit einer Tropfflasche direkt auf den Objektträger geträufelt. Mit einer Präpariernadel/Pinzette lässt sich der Objektträger anheben und das Reagenz abgießen. Die Gewindestange verhindert dabei ein wegrutschen des Objektträgers. Die Idee für diese Reagenziensparende Methode habe ich von Bodo Braunstorfinger.
Viele Grüße
David
Hallo zusammen,
Thorns hat die Versandbehälter für 2 Mikropräparate auch:
https://www.biologie-bedarf.de/products/386151/
Falls woanders nicht verfügbar. 40 ct das Stück.
Viele Grüße
Sven
Hallo Lukas,
Ist das eine private oder eine akademische Versuchsreihe? Ueber wie viele Objekttraeger reden wir hier? Im Chemikalienhandel kosten Isopropanol und Xylol unter 5 Euro pro Liter, da sind Geschwindigkeit bei der Arbeit und optimale Faerbeergebnisse wichtiger als die Kosten der Loesungsmittel (obwohl, die fachgerechte Entsorgung ist vermutlich teurer als der Kauf?).
Wenn die Steuer auf Ethanol ein Problem ist, dann kann man die Ethanolreihe durch eine Isopropanolreihe ersetzten (die Verweilzeit erhoert sich dabei). Bei HE-Faerbung ist Isopropanol kein Problem, bei Trichrom kenne ich mich nicht aus.
Die klassischen Glasbehaelter und Edelstahlgestelle sind fuer schnelles Arbeiten bei hohen Stueckzahlen ideal. Ich lege ueber Nacht zwei Lagen Frischhaltefolie zwischen Glasbehaelter und Deckel, was die Verdunstung sehr stark reduziert. Wenn der Chemikalienverbrauch verringert werden muss, wuerde ich Behaelter dieser Art empfehlen, die fallen nicht so leicht um (fuer die kleineren kann man sich eine Schaumstoffplatte kaufen, in die man passende Loecher schneidet, in welche die Behaelter gesteckt werden):
https://assets.fishersci.com/TFS-Assets/APD/product-images/F80396~p.eps-650.jpg
https://www.polysciences.com/media/catalog/product/cache/1/image/9df78eab33525d08d6e5fb8d27136e95/0/8/08415.jpg
https://assets.fishersci.com/TFS-Assets/CCG/product-images/52684-01~p.eps-650.jpg
Beste Gruesse,
Jon