Hallo Leute, ich bin neu hier... das als erstes :-) und hab natürlich gleich eine Frage.
Und zwar hab ich kürzlich versucht meine Mikroben in einer "Neubauer improved"-Zählkammer unter einem 100x Phasenkontrast-Ölimmersionsobjektiv (effektiv also 1000x vergrößert) auszuzählen. Mikroskop: Zeiss-Axiophot. Allerdings Fehlanzeige - die Objektebene ließ sich einfach nicht richtig scharfstellen. Man hat auch die hellen Linien des Zählrasters höchstens stark verschwommen wahrnehmen können.
Wenn ich mir das ganze unter dem 20x Phasenkontrastobjektiv angesehn habe, ließ sich das Raster sehr einfach finden und ordentlich scharf stellen. Leider ist diese Vergrößerung für meine Mikroben zu klein (Stäbchenbakterien, max. 3 µm groß).
Nun frage ich mich, ob eventuell der Phasenkontrast am 100x Objektiv nicht richtig eingestellt ist... also ob vielleicht der Phasenring des 100x Objektivs nicht genau mit dem Bild der Ringblende zentriert ist.
Hatte jemand von euch schon ein ähnliches Problem?
Ciao
Hallo,
die Probleme dürften mit der unüblich großen Dicke des Deckglases und der Wasserschicht der Zählkammer zusammenhängen. Ich glaube nicht, dass da mit dem 100 x PH eine vernünftige Abbildung zu erhalten ist.
Herzliche Grüße
Detlef Kramer
Hallo Detlef,
danke für deine schnelle Antwort. :-) Das Deckglas hatte ich auch schon in Verdacht. Das Originale zur Zählkammer ist 0.4 mm dick. Damit habe ich tatsächlich gar kein Bild zustande gebracht.
Ich habe dann dünnere Wegwerf-Deckgläschen probiert - schätze so 0.2 mm, mit denen hab ich die Linien dann halt wenigstens schemenhaft wahrnehmen können.
Mhm - andererseits hat mir ein Kollege letztens gesagt, dass man unter Phasenkontrast 1000-fach vergrößert in partikelfreien Medien wunderbar Zellen auszählen kann. Im Sommer war ich in Bozeman an der Uni, und dort hab ich mit einer Hausser-Zählkammer gearbeitet, auch bei 100x Phaco, allerdings mit Floureszensmodus. Das hat auch funktioniert. Deswegen wundert es mich, warum es hier so gar nicht gehen soll.
Kannst du mir was empfehlen - gibt es eventuell andere Zählkammern, mit geringerer Wasserschichtdicke? Bzw. sollte ich versuchen noch dünnere Deckgläschen heranzubekommen? So bis 0.16 mm gibts glaub ich noch...
Ciao
Hallo,
es hat keinen Zweck dünnere Deckgläser zu nehmen, als die vorgeschriebenen - also die dicken, weil sonst die Wasserschichtdicke nicht stimmt. Die dünnen sind viel zu elastisch. Hast du das Deckglas immergiert? Aber selbst wenn, die Chancen sind schlecht, denn PH ist nunmal nur für sehr dünne Schichten geeignet. Ich bin kein Bakteriologe. Es gibt bestimmt geeignetere Methoden für diesen Zweck. Fluoroszenz ist auf jeden Fall gut; evtl. auch DIC. Oder, was man auch probieren kann: Hellfeld mit stark zugezogener Aperturblende. Das reduziert die Auflösung, zeigt aber die Zähllinien besser.
Ich habe gerade den Eingangsbeitrag noch einmal gelesen. Das ist möglicherweise schon an dem zu kleinen Arbeitsabstand des 100 x gescheitert, d.h. das Objektiv ist aufgesessen. Was ich machen würde: das 20 x hat doch wahrscheinlich eine hohe N.A. von ca. 0,8. Und das Mikroskop einen Optovar. Dann kann man doch eine Vergrößerung 20 x 10 x 2.0 = 400 x einstellen. Das sollte zum reinen Zählen reichen.
Viel Erfolg
Detlef
Hallo Detlef,
danke für die Tips, ich werds mal mit der 400x-Vergrößerung versuchen. Mal sehn, was sich da machen lässt :-)
Danke nochmal.
Conny
Hallo Conny,
wenn ich mir das so durchlese, kann das irgendwie gar nicht klappen bei dem dicken Deckglas, was 0,4mm haben soll. Die gängigen Objektive sind auf eine Deckglasdicke von 0,17mm abgestimmt. Es steht auf dem Objektiv auch drauf. Dazu müssen sich die Objekte, seien es dein Bakterien oder die Striche der Zählkammern sehr dicht hinter dem Deckglas befinden. Ist das nicht der Fall, haut das auch mit der Fokussierung nicht hin. Ich setze mal voraus, daß du das Objektiv auch mit Öl immergiert hast und das vor allem BLASENFREI. Denn wenn das auch nicht der Fall ist, hat man ähnliche Schwierigkeiten. Und erst wenn das Bild scharf eingestellt ist, kannst du dich um den Phasenring kümmern.
Viel Erfolg und verzähl dich nicht! ;)
Bernd