Mikro-Forum

Hallo,

Ich habe ein seltsames Problem bei der Firma Färbung. Wenn ich den kommerziellen Giemsa Farbstoff von Roth verdünne, bekomme ich eine schillernde Haut an der Oberfläche und einen lila Niederschlag in der Küvette, die sich sofort an die Oberfläche des Objektträgers anlegen wenn man ihm aus der Lösung zieht. Das resultiert dann in hässlichen Artefakten.
Ich habe ein bisschen mit dem Hersteller kommuniziert, aber die wissen auch nicht was da passiert. Erst war die Idee, es könnte am zu kurzen Stehenlassen liegen oder an Verschmutzungen der beteiligten Reagenzien und Gefäße. War es aber nicht. Egal ob Plastik oder Glas, egal ob A dest oder Puffer, es fällt immer aus. Nächste Idee war, Charge defekt. Auf Arbeit habe ich aber zufällig eine andere Flasche, exakt das gleiche Problem.
Filtrieren bringt nichts, da dann alles im Filter hängen bleibt und ich mit bläulichem Wasser dastehe.
Ich habe jetzt Mal eine Verdünnungsreihe gemacht, mit interessantem Ergebnis: 1:100 und 1:50 zeigen keinen Niederschlag. Ab den empfohlenen 1:20 des Herstellers bis hin zu knapp 1:1 gibt es denn Niederschlag. Bei ca 1:5 ist er am gröbsten. Wenn weniger Puffer als Stammlösung verwendet wird, gibt es ebenfalls keinen Niederschlag.
Hast jemand eine Idee was da passiert? Der Niederschlag ist vollständig wasserlöslich, aber nur in homöopathischen Dosen.
Leider habe ich keine andere Giemsa Lösung als Vergleich...

Hallo,

Instinktiv wuerde ich sagen, der Puffer ist das Problem. Messen Sie doch mal den pH Wert der Pufferloesung (1x und 1/20x; sollte identisch sein).

Beste Gruesse,

Jon

Hi,

PREPARATION OF GIEMSA WORKING SOLUTION:

,, Do not make up a single batch of Giemsa stain for use or re-use throughout the day or longer. Giemsa stain quickly absorbs water vapour in the air, and, when diluted with de-ionized, distilled or any form or water, it rapidly loses its staining properties, so that slides stain poorly after just a short time. The iridescent scum on the surface of made-up Giemsa stain adheres easily to the blood film, making identification of structures difficult."

https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/274382/MM-SOP-04-eng.pdf?sequence=6&isAllowed=y
(https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/274382/MM-SOP-04-eng.pdf?sequence=6&isAllowed=y)

LG Helmut

Hallo,
im alten Romeis (16. Aufl von 1968), Ziffer 1396 ff, wird auf dieses bekannte Problem mehrfach hingewiesen:

"Fällt der Farbstoff kurz nach der Herstellung der Vedünnung aus, so ist die verdünnte Lösung unbrauchbar.... Die Ursache dafür kann in ungeeignetem dest. Wasser, unsauberen Glasgefäßen oder in zu alter, verdorbener Stammlösung zu suchen sein. Verdünnt wird da mit abgekochtem oder gepuffertem dest. Wasser; 10 ml davon + 0,3 ml Stammlösung (Giemsa-Hollborn-Original-Stammlösung von Dr. K. Hollborn u. Söhne, Leipzig; Fa. dürfte uralt sein und evtl. nicht mehr existieren), nur umschwenken, nicht schütteln in einem Becherglas, das ausschließlich dafür verwendet wird.
"Die Stammlösung muß sehr gut verschlossen werden, da sowohl Verdunsten des Methanols wie Wasseraufnahme des Glyzerins eine Ausfällung des Farbstoffs (Anm. es sind mehrere: Methylenazur, Methylenviolett, Methylenblau und Eosin. Nach anderen Quellen Azur II und Eosin) zur Folge hat. Luftdicht verschlossen ist sie unbegrenzt haltbar."
Das Ergebnis der Färbung ist offensichtlich stark pH-abhängig.
Es wird auf eine Schnellfärbemethode verwiesen, bei der eine 1 : 1 Mischung aus der o.a. Stammlösung und reinstem Methanol verwendet wird, also kann man die Stammlösung wohl damit verdünnen.
Aber ich nehme an, ihr habt alle den Romeis.
Bei Bruno P. Kremer wird die Merck Lösung 1.09203 mit Leitungswasser 1 : 9 mit etwa pH 7 verdünnt oder einem Phosphatpuffer.
Was ich allerdings nicht weiß, ob die im Handel befindlichen Lösungen dieselbe Rezeptur haben, vermutlich nicht.

Viele Grüße, Jochen.

Danke für die Tipps! Also an dem Gefäßen liegt es nicht. Ich habe alles mögliche probiert. Das fällt immer aus. pH ist ebenfalls ok. 6.80 mit dem Weise Puffer. Wie gesagt, in A bidest passiert das gleiche (pH 6.4 nach Verdünnung). Die Schnellfärbung ist eine Möglichkeit, richtig. Ich wollte aber schauen, ob ich es erst vernünftig hin bekomme. Im neuen Romeis steht nicht mehr so viel dazu. Nur das mit dem filtrieren. Aber da bleibt dann alles im Filter... Das Problem bei der Färbung ist, dass es dutzende Vorschriften gibt. Davon müssen schon logisch viele falsch sein.
Das Problem mit dem Niederschlag habe ich schon oft an Präparaten im Krankenhaus etc gesehen, ich vermute, Probleme mit der Färbung sind häufig, es kümmert sich nur keiner drum. Ob der Patient eine Leukämie hat sieht man ja auch so.

Grüße,
Micha

Der Puffer sollte leicht alkalisch sein. Testen Sie doch mal, ob bei pH 7.2 auch der Farbstoff ausflockt. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC540181/

Hallo Micha,

hast Du Methanol? Probier doch mal, die Stammlösung vorher mit etwas Methanol zu verdünnen.

Jochen

Ich habe auch PBS mit 7.2 probiert, das war besser aber immer noch nicht gut, leider. Nützt mir auch nichts, da ich die Farbgebung bei 6.8 brauche, die der Standard ist.
Methanol habe ich da, aber das ist doch eh in der Stammlösung, oder? Wie viel sollte ich den zugeben?

Hallo Micha,

was in der Stammlösung wirklich drin ist, ist ja nicht veröffentlicht, aber ich würde mal genauso viel Methanol wie Stammlösung ausprobieren und dafür die gleiche Menge Wasser weglassen.

Jochen

So Methanol ist probiert. Damit erreiche ich zumindest bis 1:20 eine niederschlagsfreie Lösung. Leider löst es aber nicht das Problem der schillernden Haut, die dazu tendiert sich beim rausziehen an die OT zu lagern...

Grüße,
Micha

Hast eigentlich jemand die Originalarbeiten von Giemsa oder Pappenheim als digitale Version?

Hallo Micha,

wenn Du die bibliographischen Daten der Originalarbeiten von Giemsa oder Pappenheim hast, kann ich versuchen, sie zu besorgen. Ansonsten kann ich Dir nur subito (https://www.subito-doc.de/) empfehlen: schnell, zuverlässig und preiswert.

Viele Grüße

Rainer

Also die Versuche mit hoher Konzentration Giemsa und MetOH im Verhältnis 1:1 und auch zusätzlich noch mit Puffer haben beide versagt. Zwar löst sich alles, aber die Kerne werden blau statt lila und das Zytoplasma bleibt farblos, außer in eosinophilen.
In der 1:20 plus 5% MetOH Lösung werde ich den Niederschlag los, aber die Färbung hat ebenfalls das Problem, die Granula nicht anzufärben.
Färbetechnisch das beste Ergebnis gibt die Färbung so wie sie von Thomas Binder et al. Beschrieben ist: May Grünwald 1:1 mit Puffer, Giemsa 1:6 mit Puffer und dann in 3 Stufen Puffer differenzieren und spülen. Aber da ist der Niederschlag halt eine Katastrophe. Ich gebe erstmal auf und warte auf den noch versprochenen Rückruf des Chemikers vom Hersteller und die Lieferung einer anderen Giemsa Lösung von Morphisto.

Hallo,

ich habe in "Ullmanns Enzyklopädie der Technischen Chemie" im Kapitel "Mikroskopierfarbstoffe" neben dem bereits erwähnten "Romeis" noch ein paar ältere Literaturstellen gefunden:

- H. Adam, G. Czihak: Arbeitsmethoden der makroskopischen und mikroskopischen Anatomie. G. Fischer Verlag, Stuttgart 1964
- H.-Ch. Burck: Histologische Technik. Thieme. Stuttgart 1966
- H. J. Conn: Biological Stains. 9. Aufl., Williams & Wilkins Comp., Baltimore 1977
- H. Harms: Handbuch der Farbstoffe für die Mikroskopie. Staufen Verlag, Kleve 1965

Vielleicht finden sich diese Werke ja noch in der einen oder anderen Institutsbibliothek, falls jemand darauf Zugriff haben sollte. Vielleicht sind da sogar Rezepte drin.

Viele Grüße, Jochen.

Giemsas Arbeit ist diese hier: Gustav Giemsa: Eine Vereinfachung und Vervollkommnung meiner Methylenblau-Eosin-Färbemethode zur Erzielung der Romanowsky-Nocht'schen Chromatinfärbung. In: Centralblatt für Bakteriologie I Abteilung 32 (1904), S. 307–313.

Keine Ahnung wie man da rankommt, hier hat die Unibibliothek zu wegen Corona...

Die erste Seite ...
https://www.researchgate.net/publication/8480974_Editorial_100_Years_ago_-_Giemsa's_solution_for_staining_of_plasmodia/figures

oder hier

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1111/j.1365-3156.2004.01278.x

Hallo,

die Originalveröffentlichung von 1904 ist leider nicht digitalisiert zugänglich, aber über subito kannst Du Dir sie für kleines Geld bestellen. Achtung: 1905 schreibt sich die Zeitschrift mit "Z".

Viele Grüße

Rainer

Hallo,

zur Auswertung von Jochens Literaturstellen:
- H.-Ch. Burck: Histologische Technik. Thieme. Stuttgart 1966:  negativ
- H. Adam, G. Czihak: Arbeitsmethoden der makroskopischen und mikroskopischen Anatomie. G. Fischer Verlag, Stuttgart 1964
   S.228 Farblösung 15Tr. der Stammlösung auf 20ml Aqua dest.
             Färbung: Trockene Ausstriche werden... mit Methanol 5min.vorfixiert, im feuchten Zustand mit frischer GIEMSA-Färbelösung bedeckt, Färbedauer bis 30min, danach mit dest. Wasser abspülen und trocknen.... Zum Spülen bei Mißlingen der Färbung Pufferlösung(ph 6,4-6,8) verwenden.

Eine weitere ergibigere Quelle ist:
- L.Hallmann, Klinische Chemie und Mikroskopie, bei mir: Thieme, Leipzig, 6.Aufl. 1950, S.356 f.
  "Zur Herstellung derGiemsa- Gebrauchslösung wird die Stammlösung im Verhältnis 1Tr. Farblösung auf 1ccm Wasser verdünnt.... Das Farbgemisch im Mischgefäß soll nicht länger und stärker geschwenkt werden, als zur Erzielung einer homogenen Mischung erforderlich ist, da anderenfalls leicht Ausscheidungen von Farbstoff auftreten und das Farbgemisch unbrauchbar werden kann... Zur Erzielung richtiger Farbwirkung ist unbedingt erforderlich, daß das zur Verdünnung verwandte Wasser keinerlei freie Säuren... enthält. Das zur Verdünnung benötigte Wasser muß daher durch vorheriges 10 Minuten langes Kochen kohlensäurefrei gemacht werden. ...
Technik: 2. ...färben der waagerecht auf Färbebrücke liegenden Objektträger mit verdünnter Giemsa-Lösung
3. Farblösung mit Wasserstrahl von der Seite her abspülen ( nicht abkippen! ) Um besonders schön differenzierte Färbungen zuerhalten, läßt man die Präparate  mit klarem unabgekochten Wasser bedeckt ca. 1 Minute stehen"
Der Hallmann war lange Zeit das "Kochbuch" der Ärzte und brachte erprobte Methoden, zusammen mit den kleinen Tricks, die das Gelingen fördern: Hier das abgekochte, kohlensäurefreie dest.Wasser. Auch das waagerechte Färben und Abspülen statt abkippen scheint erprobt und wichtig zu sein.
Ausprobiert habe ich die Methode jedoch nicht aus Mangel an Giemsa- Stammlösung.
Viele Grüße
Helmut

Hallo Helmut,

das ist sehr interessant. Immer wieder wird auf die Qualität des verwendeten Wassers Bezug genommen: Auskochen zur Entfernung von CO₂ (und O₂), Verwendung von bidest. Wasser, nicht stark rühren, nur leicht umschwenken. Zur Differenzierung nimmt man wieder nicht ausgekochtes Wasser.
Der pH-Wert von Wasser, das im Gleichgewicht mit dem CO₂ aus der Luft steht, ist etwa 5,6. also ganz leicht sauer.

Viele Grüße, Jochen

Bei OT Färbungen ist das ganze viel weniger problematisch. Dann kann man die grüne Schicht abspülen. In der Küvette hat man den Luxus leider nicht... Da zieht man den OT zwangsläufig durch.
Ich vermute langsam, dass der Niederschlag das Salz aus Eosin und Azur ist...
Kochen ist ja nett, aber bis das kalt ist, ist es wieder mit CO2 gesättigt...

Hallo Micha,
das wieder Auflösen von CO₂ in Wasser geht relativ langsam, da es ein diffusionskontrollierter Prozeß durch die Phasengrenzfläche gasförmig/flüssig ist und diese Diffusionsprozesse sind langsam. WEnn man das wasser in einer fast vollen Flasche oder einer fast vollen Sritzflasche aufbewahrt, ist oberhalb kaum noch Luft und CO₂ .

Viele Grüße, Jochen

Hi Michael, Jochen, et al.,

falls noch nicht bekannt:
http://thomas-rh-binder.de/Downloads/pappenheimfaerbung.pdf (http://thomas-rh-binder.de/Downloads/pappenheimfaerbung.pdf)

"Lösungen
1.  May-Grünwald (Merck - Nr. 1424). Angebrochene Flasche binnen max. 4 Wochen aufbrauchen oder
kleinere Flasche verwenden.
2.  Giemsa (Merck - Nr. 9204). Angebrochenes Gebinde max. drei Monate haltbar.
3.  Methanol  (Merck  -  Nr.  6009).  Achtung!  Methanol  ist  hygroskopisch: sofort wieder
verschließen; große Flaschen evtl. in mehrere kleine Flaschen aufteilen.
4.  Puffer
a)  aqua demineralisata 10 l
b)  NaOH (Merck Nr. 9140)  0.2 mol : 125 ml
c)  KH₂PO₄ 0.2 mol: 290 ml
d) Puffer auf pH 6.8 einstellen; etwa 2 Wochen haltbar

Färbung
Dieses  Rezept  berücksichtigt  die  1992  von  der  Firma  Merck  vorgenommene Änderung
Zusammensetzung der Giemsa-Stammlösung.
1.  10 min   Methanol (länger ist unschädlich, nicht kürzer!)
2.  7 min   1 ( bis 2) Teile May-Grünwald + 1 Teil Puffer, dann filtrieren (eher mehr May-Grünwald als
weniger!): (,,alkoholische" Färbung)
3.  keine Zwischenwässerung, nur abtropfen lassen
4.  20 min  1 Teil Giemsa + 6 Teile Puffer, dann filtrieren und dann eventuell mit KH₂PO₄  auf pH
6.8 einstellen: (,,wässrige" Färbung)
5.  kurz (10 sec)   eintauchen in Puffer
6.  4 min   in Puffer (,,Differenzierung")
7.  3 min   in Puffer
Grundsätzlich und wegen der 1992 geänderten Zusammensetzung derGiemsa- Stammlösung muss in jedem
Labor gelegentlich geprüft werden, ob bei einem pH  des  Puffers  von  6.8  die  fertig  verdünnte 
Giemsa-Lösung  noch  diesen  pH hat. Sonst den pH des Puffers verändern (zumeist Korrektur zum
sauren hin erforderlich).
Angesetzte Färbelösung (z. B. 400 ml) verwendbar für 5 Durchgänge mit je 30 Präparaten. Lösungen
täglich neu ansetzen. Präparate brauchen im Bad nicht bewegt  zu  werden.  Methanol-  und 
Färbekuvetten  stets  abdecken.  Methanol täglich frisch!
Das  Färbegeschirr  nicht  mit  Spülmitteln  reinigen,  sondern  nur  mit  dem Methanolabfall, denn
Detergenzienreste in dem meist porösen Glas der Kuvetten und der Färbegestelle können fatale
Artefakte verursachen! Leichte Blaufärbung des Färbegeschirrs  nach  Reinigung  ist  ohne  Bedeutung,  da  die 
verbliebenen Farbreste keine Färbepotenz mehr besitzen."

Vielleicht kann man auch Dr. Binder noch kontaktieren.
LG Helmut

Herr Dr. Binder war so nett sich Zeit zu nehmen mit mir zu telefonieren. Ich werde seine Tipps jetzt mal umsetzen und dann berichten wie es läuft...

Ein kleines Update: ich habe es mit der Hilfe von Dr. Binder geschafft, die Färbung wiederholbar zu machen und die Artefakte loszuwerden. Ich kann allerdings nicht so lang differenzieren wie in seiner Vorschrift, da dann die Neutros entfärbt sind. Daher differenziere ich nur 2 x 1 min.
Was den Niederschlag angeht, so vermute ich mittlerweile, dass das direkt das Azur-Eosinat ist, was ja auch direkt der Giemsa-Farbstoff ist. Bei neutralem pH MUSS das ausfallen, da kaum löslich. Interessanterweise ist der Niederschlag resistent gegen basische Lösung, verschwindet aber im sauren. Eigentlich müsste er doch in beiden Fällen verschwinden. Naja.
Ich habe jetzt basierend auf den Wittekind-Arbeiten noch einige Versuche mit DMSO gemacht, was auch sehr vielversprechend aussieht. Wenn ich mit den Versuchen fertig bin, schreibe ich nochmal was umfangreicheres. Ich will jetzt nur nichts Falsches schreiben...

Hi Michael,

がんばって - ganbatte! (do your best, good luck, keep going).

LG Helmut