Hallo zusammen,
ich habe vor, die Sporen von Täublingen und Milchlingen mit Picolay zu stacken. Kann mir jemand aus dem Forenkreis mit eigenen Erfahrungen weiterhelfen?
Es geht um die Anzahl der zu stackenden Bilder und um die optimale Einstellung der Picolay-Parameter.
Bisher habe ich mit Combine und mit dem Zerene-Stacker gearbeitet. Die Ergebnisse scheinen mir aber noch verbesserungswürdig, so dass ich es jetzt mal mit Picolay versuchen möchte.
Herzliche Grüße
Bernd
Ausrüstung:
Canon EOS-600D auf Olympus BHS mit Halogenlicht
Hallo Bernd,
ich bin mir der Ornamentierung der Oberfläche dieser Sporen bewusst.- Was erwartest du für einen reproduzierbaren Gewinn an Informationen durch das stacken im Vergleich zu drei Bildern nebeneinander mit unterschiedlichen Schärfebereichen?
Gruss Arnold
Hallo Arnold,
die gestackten Sporenfotos nehme ich bei Dokumentationen, wenn ich keine Zeit zum Zeichnen habe.
Hallo ADi,
welche Maßeinheit hat dein Ergebnis für die Schärfentiefe? Wenn mein Mikroskopobjektiv eine NA von 1,3 hat, ergibt sich 0,00055/(1,3*1,3) = ...
Und spielt die Einstellung der Aperturblende nicht auch eine wesentliche Rolle?
L.G. - Bernd
Hallo ADi,
das hieße ja, dass man Höhenschritte von maximal 0,1 µm machen muss. Das kriege ich nach bestem Willen mit dem Feintrieb nicht hin.
L.G. - Bernd
Hallo Adelbert,
Zitat von: AdelbertDie Zahl der Schritte hängt von der Schärfentiefe des Objektivs ab.
Falls Du ein Mikroskop-Objektiv verwendest, dann DOF = 0,00055 / (NA*NA)
Wo hast Du diese Formel gefunden? Mir scheinen die Stakingschritte doch etwas arg klein. Ich muss aber auch zugeben, dass ich mit einen Objektiv so hoher Apertur noch nicht gestakt habe.
Michael ("sushidelic")
schreibt im Artikel über das neue hochbrechende Eindeckmittel (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=40111.msg296823#msg296823):
ZitatEine Sache war noch ganz amüsant - es handelt sich hier um Stacks, deren Einzelbilder in wenigen Nanometern Abstand aufgenommen wurden. Das wäre mit dem Feintrieb nicht zu machen gewesen, deswegen habe ich mich einer designbedingten Eigenart des Mikroskops bedient: Beim Einschalten der 100W-Halogen ist das Stativ noch kalt, wird aber dann sukzessive von der Lampe erwärmt und dehnt sich dabei aus, bis es "Betriebstemperatur" hat. In diesem Zeitraum habe ich einfach vor dem Starten der Kamerasequenz auf meine unterste Ebene fokussiert, und dann nach ca. 3 min Reihenaufnahmen war mein "Thermostacking" ganz oben auf der Kieselalge angekommen. Sobald das Mikroskop Betriebstemperatur hat, ist der Spass vorbei.
Hallo Bernd,
ich würde das einfach mal händisch probieren, den FeinFokus in möglichst kleinen Schritten durch die Schicht der Sporendicke zu führen und das mal mit PICOLAY zu verrechnen. Bei durchsichtigen Objekten besteht aber die Gefahr, dass man dann die Rückseite der Sporen mit auf die Vorderseite holt. Deshalb würde ich bei den Parametern "Prefer high" anklicken und den Wert möglichst hoch einstellen, oder nur den oberen Teil des Bilderstapels bis zur Mitte der Spore verwenden. Da muss man etwas experimentieren.
Wenn das mit dem händischen Fokussieren nichts wird, brauchst Du vielleicht eine Büchse der Pandora (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=18788.0)
Beste Grüße
Gerd
Hallo Bernd,
ich stacke Diatomeen oft mit dem 100er Objektiv.
Ich gebe zu mein Feintrieb ist sehr empfindlich, aber man sollte die Kirche im Dorf lassen.
Wenn Du versuchst in möglichst kleinen Schritten Bilder zu machen, dürfte es für diesen Zweck nicht nur ausreichen sondern auch passen. Entscheidend ist die Aussage von jeder Schärfenebene ein Bild zu machen. Falls Dein Feintrieb sehr ,,grob" reagiert, hilft es eine passende Gummikappe mit größerem Umfang um den Feintrieb zu machen, dadurch erhöhst Du etwas die Empfinflichkeit Deiner Handbewegung.
Die Ratschläge von Adi sind zwar ok, beziehen sich jedoch auf eine komplett andere Anwendung.
lg
Anne
P.S. probier's einfach aus!
Hallo Bernd
Adi hat absolut Recht, gerade die von dir angestrebten Objekte gehören nicht zu den Einfachen. Das Stacken mit NA 1,3 und darüber gehören zu den Ausschussreichen.
Bei den Objekten bist du ja beim 60x oder 100x.
Vibrationen sind das nächste Problem - da wirst du bei händischen Fokus deine Freude haben.
Die Blende bleibt bei der Anwendung offen ...
Liebe Grüße
Gerhard
Hallo Gerhard,
was meinst du mit "Das Stacken mit NA 1,3 und darüber gehören zu den Ausschussreichen."?
Das Ruckeln der Objekte beim Auslösen macht tatsächlich ziemliche Probleme, wenn man stacken möchte. >:(
Meine EOS-600D erlaubt allerdings Videofilmchen in Full-HD. Wenn ich den Feintrieb während der Videlaufnahme bewege, bekomme ich sicher genügend Einzelbilder ohne Ruckeln.
Hoffentlich kriege ich das hin!
Herzliche Grüße
Bernd
Hallo,
über Video-Clips und Bildvereinzelung ist das Ruckeln weg. Außerdem bekommt man genügend Bilder für das Stacken ("Video-Stacking"). Hier ein Ergebnis mit dem Zerene-Stacker, Methode PMax:
Sporen des Geflügeltsporigen Milchlings, präpariert in Sukfovanillin, um die stärkehaltigen Warzen und Grate hervorzuheben. Sporengröße durchschnittlich 8 x 7 µm. Objektiv Zeiss Planapo 100/1,3 Oel 160/-
L.G. - Bernd
Hallo Bernd,
das sieht verdammt gut aus! Ich weiß selbst, wie schwierig die Sporen zu stacken sind.
Wenn du das Bild ein wenig kleiner machst, sieht es schärfer aus (der Rest nach Peter Vs'. Anleitung "Photoshop für Dummies"). ;)
Liebe Grüße
Peter
Hallo Peter,
danke für den Hinweis, die sehen jetzt tatsächlich viel schärfer aus!
Liebe Grüße - Bernd
Hallo Sporenstaker,
kann es ein dass da die Browensche Bewegzng schon ein wenig Unschärfe mit rein bringt? Die mittlere Spore sieht für mich aus, als hätte sie sich über die eEnzelfotos bewegt und so Bewegungsunschärfe eingefangen. Die Anhänge sehen so verwischt aus.
Beste Grüße
Gerd
Hallo Bernd,
Videostacking ist auf jeden Fall die Methode der Wahl. Maximales Licht geben, ASA-Wert (falls beim Filmen einstellbar) so niedrig wie möglich, um das Rauschen gering zu halten, und dann ganz langsam Durchfokussieren... So bekommt man feinste Schritte.
Bei hohen Objektivvergrößerungen ist Full HD-Auflösung kaum noch ein limitierender Faktor.
Bin auf den Vergleich mit Zerene Stacker gespannt...
Und dann kann man evtl. auch mal Hologramm-Stacking mit den extrahierten Bildern versuchen - das geht aber nur mit PICOLAY ;)
Viel Erfolg und herzlichen Gruß,
Heribert
P.S: Wenn du mir ein Präparat oder auch nur Sporen schickst, kann ich's auch mal mit meiner Canon 90D und 4K Videos versuchen...
Hallo Gerd,
das sind Grate, die sich auf der unteren Kugelhälfte befinden. Die hätte ich beim Stacken natürlich wegradieren können.
Hallo Heribert,
Sporen schicke ich dir gerne zu. Du musst sie allerdings in Melzers Reagenz mikroskopieren, um die stärkehaltigen Oberflächenstrukturen hevorzuheben.
Melzers Reagenz würde ich dir dann auch schicken.
Eigentlich hatte ich vor, mit Picolay zu stacken, war dann aber mit dem Ergebnis nicht zufrieden, da ich die Strukturen der unteren Kugelhälfte nicht eliminieren konnte.
Es wäre aus meiner Sicht optimal, wenn du zum Nachvollziehen die einzelnen Schritten mit Picolay erläutern könntest. :)
Das Einzige, was mir fehlt, ist deine Anschrift.
Herzliche Grüße
Bernd
Hallo Bernd,
super - Adresse schicke ich per PN...
LG
H.
Hallo Bernd,
das Thema beschäftigt mich schon lange und mittlerweile habe ich auch gewisse Erfahrung gemacht. Mein Hauptroblem ist die geringe Positionsstabilität von Pilzsporen in Flüssigkeiten. Allein der sich minimal ändernde Fokus ändert ihr Position bzw. Lage. Die Sache wird umso kritischer, je kleiner sie sind und je mehr Sporen gleichzeitig gestackt werden.
Gruß - EFH
Hallo Eckhard,
ein allseits bekanntes Problem. Ich verwende große Deckgläser, also mindestens 20 x 26 mm und sehr wenig Flüssigkeit (Wasser, Melzers Reagenz, Kalilauge...).
Und neuerdings mache ich keine manuellen Einzelfotos mehr, sondern "drehe" ein Filmchen:
Während der Clip aufgenommen wird, muss man am Feintrieb gleichmäßig und zügig drehen, um den gesamten, relevanten Sporenbereich draufzubekommen. Danach wird mit der Freeware "Free Video to JPG Converter" in jpg-Dateien vereinzelt, die relevanten Bilder rausgesucht und gestackt. Geht eigentlich ruckzuck, viel schneller als das mühsame Vorgehen bei man. Einzelfotos.
Herzliche Grüße
Bernd
Zitat von: Eckhard F. H. in März 25, 2021, 17:46:35 NACHMITTAGSMein Hauptroblem ist die geringe Positionsstabilität von Pilzsporen in Flüssigkeiten. Allein der sich minimal ändernde Fokus ändert ihr Position bzw. Lage.
Ich nehme für Sporen und Pollen gern Glycerin statt Wasser. Glycerin ist etwas viskos und läßt die Sporen ruhiger liegen. Das Bild ist sehr klar.
Hallo Eckhard,
was mir einmal geholfen hat: dünnere Deckgläser als 0,15-0,17 µm (Stärke 1), also z.B. 0,10-0,12 µm (Stärke 0). Die sind in Kleinmengen allerdings schwar zu bekommen.
Herzliche Grüße
Bernd