Hallo Histologieker,
nach der von Klaus Henkel vorgestellten Paraffineinbettungsmethode (Arbeiten mit Isopropanol statt mit Xylol) habe ich zwei Chargen der Larven mit deutlich unterschiedlichen Entwässerungs- und Paraffinierungszeiten behandelt. Im Anschnitt sieht man, die Objekte, die Larven sind voll in Paraffin eingeschlossen und das Gewebe der Larven ist voll mit Paraffin durchtränkt, kontrolliert mittels einer beleuchteten 10-fach Lupe (in einem Stativ starr gehalten).
Das Paraffin lässt sich sauber schneiden, 10 µm, aber nicht das Larvengewebe, es bröselt, und nicht nur das, wie von einer Aura umgeben, die nächste Umgebung des Objekts ist frei von Paraffin. Das Loch im Paraffinschnitt ist deutlich größer als die gebröselte Larve. Das Loch im Paraffinschnitt hat sich schon eingestellt bevor die Larve angeschnitten wurde.
Falls jemand vermutet ich hätte wohl Tomaten vor der Brille, muss ich ihn enttäuchen. Ich habe lange gezögert diesen Bericht zu senden, es kommt mir selbst unglaubhaft vor.
Gibt es vergleichbare Erfahrungen?
Mit freundlichen Grüßen, Anton
Lieber Anton
1. Wie hast Du fixiert?
2. Wenn Du Xylol scheust, nimm N Butanol.
Iso hat bei mir auch nicht funktioniert.
Schöne Grüße Jürgen
Lieber Jürgen,
ich fixiere alles und immer in AFE, üblicher Ansatz. Die Larven sammle ich in AFE aber nicht über zwei Tage hinaus, denn danach setzt deutlich der Schrumpfungsprzess ein. In den folgenden Prozessen setzt sich der Schrumpfungsprozess ohnedies fort, insofern nicht über überflüssige Zeiten hinweg.
Mit Xylol habe ich kein Problem, muss aber nicht sein. Die Klaus Henkel Methode setze ich seit Jahren erfolgreich ein (im 5. Prozess, Mischung 1 : 1 Iso / Paraffin setze ich allerdings eine um mehrere Grade höhere Temperatur an) und darhinter stecken m.E. nicht die angesprochenen Probleme.
Nun werde eine weitere Charge starten mit nochmals längeren Prozesszeiten um wenigstens die Bröselei möglichst auszuschalten.
Vielen Dank Jürgen und bis auf Weiters, viele Grüße, Anton
p.s. Vieleicht stellt Herr Henkel das von ihm als ältere Methode bezeichnete Verfahren nochmals vor?
Hallo Anton
Bei mir funktioniert die ISO Methode auch nur bei pflanzlichem Gewebe, dort sogar ausgezeichnet. Aber wie Jürgen habe ich keinen Erfolg bei tierischem Gewebe mit ISO ..
Liebe Grüße
Gerhard
Lieber Anton,
übliches AFE schreibst Du. Davidson verlangt in seinemRezept für Insekten:
3 Teile Etoh 95%
2 Teile Formol ca 38%
1 Teil Essigsäure
3 Teile a.d.
Aber daran wird es nicht liegen.
Generell dringen Fixative (und alle anderen Flüssigkeiten) schlecht in Insekten ein. Wenn Du eine ganze Larve fixiert hast, wird es nicht funktionieren. Du musst Eintrittspforten schaffen. Das Fixativ sollte nach dem Fixieren sorgfältig ausgewaschen werden. Die Larve sollte wirklich vollständig entwässert sein, bevor die Paraffineinbettung folgt. Mindestens! 2 x Iso 100. Das Paraffin sollte danach stufenweise zugesetzt werden.
Im Übrigen viel Glück mit der Isomethode. (edit: Ich würde N-Butanol dem Iso - und auch dem Xylol vorziehen. ) Vielleicht hast Du die Möglichkeit, die Larven im Paraffinbad zu bewegen..
Viele Grüße
Jürgen
Lieber Gerhard,
bei mir klappt die Methode auch bei tierisch-(menschlichen) Objekten. Eigentlich möchte ich mich nicht so sehr raushängen. Anbei ein Belegfoto. Meinen Dermatologen, der mir eine Gewebeprobe entnommen hat, habe ich bedrängt das Gewebestück etwas größer zu wählen. Hier, AAB steht für Anton Aloisius Berg, ISO-Einbettungsmethode, vereinfachte AZAN-Färbung.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures012/309030_36849274.jpg)
Lieber Jürgen,
ich habe einen angeschnittenen verworfenen Block nun im Auflicht betrachtet: das Gewebe und die Kloake sind voolständig mit Paraffin infiltriert und wie beschrieben, das Paraffin lässt sich ohne Stauchungen schneiden das Objekt bröslt aber. Fals Du der Auffassung bist, die Davidson- Fixierung macht den Unterschied, werde das ausprobieren. Die Exoskelette der Insekten unterscheiden sich m.E aber erheblich von den Larvenhüllen, sehe mich hier als Laie.
Lasst uns weiter diskutieren.
Mit freundlichen Grüßen, Anton
Hallo Anton,
Wieso hast du DIK verwendet an eine gefärbte Schnitte? Beste Grüsse, Rolf
Hallo Anton,
am Fixativ wirds m.E. nicht liegen, wenn es bröselig wird.
Du könntest einmal versuchen, Deinen Block ein paar Minuten auf feuchtes Eis zu legen, so dass etwas Wasser eindringen kann und dann versuchen zu schneiden.
Was heißt ,,etwas höhere Temperatur"?
Ich sehe, wieklein Deine Larve ist. Trotzdem würde ich sie einseitig anschneiden.
Wie lang waren denn Deine Fixierung und Infiltration max und min?
Viele Grüße
Jürgen
Lieber Rolf,
warum verwende ich DIK? Das hat keine besondere Bewandtnis, der Schnitt wirkt in der Ansicht einfach nur plastischer.
Lieber Jürgen,
Deinen Tipp, mit Eis zu arbeiten werde ich folgen. Ein Versuch mit einem Ethanol/GlycerinGemischAufstrich war leider nicht erfolgreich.
Ich verwende Paraplast X-tra. Gemäß der Beschreibung liegt der Schmelzpunkt bei 52 °C, fahre selbst aber im Normalfall mit 55 °C, beim ParaffinISOGemisch allerdings mit 60 °C. Bei der Temperatur von 60 °C löst sich das Paraffin problemlos in ISO.
Anschneiden kann kein Fehler sein.
Die Fixierdauer liegt zwischen wenigen Tagen und einigen Stunden, in Abhängigkeit von der Beschaffung der Objekte, sie sollten aber nicht Durchhärten. Aufs Pröbeln habe ich bisher verzichtet.
Für weitere Anregungen bin ich sehr dankbar.
Viele Grüße, Anton