Hallo Leute,
ich bin dabei eine Fluoreszenzeinrichtung für mein Axiostar selber zu bauen und bin nun an einem Punkt, wo ich hoffe, dass Ihr mir weiter helfen könnt.
Zu den Eckdaten:
Ich habe ein Axiostar (unendlichoptik). Bei diesem kann unterhalb des Tubusses eine Fluoreszenzeinheit eingebaut werden. Da ich die nicht habe und sie für mich deutlich zu teuer ist, habe ich die Einheit im 3D-Druck selber gedruckt.
Ich habe mir außerdem einen Fluoreszentfilterhalter mit Fluoreszenzfiltern gekauft. Enthalten ist der Filtersatz von Zeiss 09 (450-490, FT 510, LP 520). Das ist das was auf dem Halter steht. Ich habe das Set gebraucht gekauft und hoffe, dass es auch stimmt.
Dann habe ich eine Blaue LED gekauft (3W 455-460 nm) und habe die regelbar an einen Kühlkörper gebaut und dort angebaut, wo auch sonst die Lichteinheit ist. Die LED kann direkt ins Loch der Fluoreszenteinheit gesteckt werden (wie auf dem Foto) oder ich habe auch eine Zeiss Lampeneinheit mit Sammellinse und Blende, in die die LED gesteckt werden kann. (kann man im Hintergrund sehen). Aber das Ergebnis ist bei beiden Varianten gleich.
Zu dem Ziel:
Ich möchte hauptsächlich die Eigenfluoreszenz von Pflanzen untersuchen. Ich durfte vor kurzen dafür mehrere Versuche an einem Axiolab machen und war über die Eigenfluoreszenz begeistert bei 470 nm. Ich habe nun die gleichen Präparate verwendet, die dort sofort zu tollen Erfolgen geführt haben und war enttäuscht.
Zu den Problemen:
- Ich habe zuerst ein Fluoreszenzdauerpräparat verwendet und ich konnte Fluoreszenz mit meinem Aufbau sehen. Ich kann auch sehen, dass blaues Licht auf dem Präparat ankommt. Es erscheint aber deutlich schwächer als das was die LED abgiebt.
- Nun kamen die eigenen Präparate. Zum einen hatte ich von einer Wasserpflanze ein Blättchen abgezupft und unters Mikroskop gelegt. Ein Bild vom Axiolab kann man unten sehen. Dort kann man deutlich die Fluoreszenz der Chloroplasten sehen. Bei meinem Aufbau sehe ich nichts! Keinerlei rotes Leuchten. Gar nichts. Dann habe ich Farn drunter gelegt und die Sporangien fluoreszieren eigentlich auch sehr toll. Aber auch hier ist nichts zu sehen! Habt Ihr irgendeine Idee, was ich anders machen muss?
- zweites Problem, was mir aufgefallen ist. Der Hintergrund um das Präparat soll ja eigentlich schwarz sein, aber bei mir ist er immer gleichmäßig grün leuchtend, egal ob ich ein Präparat drunter habe oder auch nicht. Wie gesagt ich habe keine Farbstoffe verwendet. Könnt Ihr mir das erklären? Kann ich das auch irgendwie beheben?
Was mir noch aufgefallen ist: Es kommt mir so vor als wenn viel Licht zurück zur Lampe reflektiert wird. Ist das immer so?
Den Aufbau könnt Ihr als Fotos unten sehen. Das Fluoreszentbild ist nicht von meinem Aufbau sondern von einem Axiolab.
Stimmt mit meinem Aufbau oder den Filtern etwas nicht? Habe ich irgend einen anderen gedanklichen Fehler?
Falls ich irgendetwas nicht verständlich ausgedrückt habe oder irgendwelche Informationen fehlen, dann fragt bitte. Ich komme gerade nicht weiter und bin mit meinem Latein am Ende.
Viele Grüße
Kirsten
Hallo Kirsten,
tolle Idee, einen solchen Illuminator selbst zu bauen! Ein paar Kommentare:
- Aus meiner eigenen Erfahrung mit gebrauchten Filtersätzen weiss ich, dass Beschriftung und Inhalt nicht immer zusammenpassen müssen, weil Vorbesitzer schnell mal andere Filtersätze eingebaut haben, ohne die Beschriftung anzupassen oder Teile von einem Filtersatz ausgebaut haben. Ich würde testen, ob der Grossteil vom LED-Licht wirklich reflektiert wird, in dem du den Filtercube & LED ausserhalb vom MIkroskop zusammen testest und visuell mit einem Stück Papier vergleichst, ob vor und nach dem Teilerspiegel Licht gut reflektiert wird
- Was bei dir das Problem sein kann, ist eine fehlende oder unvollständige Zwischenoptik: Im Prinzip ist ein Fluoreszenzilluminator ähnlich eines Durchlichtstrahlengangs aufgebaut (Stichwort Köhlerbeleuchtung), d.h. die LED sollte zuerst grob kollimiert werden (ungefähr paralleler Strahlengang) und dann in die Aperturblende vom Objektiv abgebildet werden (auch "back focal plane" / "BFP" / "hintere Brennebene" / "aperture stop" genannt). Es kann sein, dass bei deinem Aufbau viel vom LED-Licht am Objektiv vorbeigeht oder ungekehrt auf eine zu kleine Fläche abgebildet wird.
- Der gleichmässig grüne Hintergrund kann durch Streulicht kommen, welches vom Filter nur unzureichend geblockt wird, z.B. weil der Filtersatz nicht passt.
- Reflexe zurück zur LED sind an sich noch kein Grund zur Sorge. Wenn der Grossteil reflektiert wird, dann passt der Erregerfilter / excitation filter wahrscheinlich nicht. Auch das kann man leicht beim Test ausserhalb vom Mikroskop sehen.
Viele Grüsse,
Fabian
Hallo Kirsten, wenn ich Deine Photos richtig deute, hast Du die LED bzw.
die Zeisslampe an einem Laborständer befestigt. Bist Du sicher, dass der Strahlengang exakt horizontal verläuft und zentral auf den Filter trifft? Hast Du versucht, wie sich die Entfernung von der LED bzw. der Lampeneinheit von Filter auswirkt? Hast Du Deine Filtereinheit am Axiolab ausprobiert?
LG Jürgen
Es klappt!!!
Also ersteinmal Danke an Fabian und Jürgen. Ihr habt noch ein paar Aspekte angesprochen, die ich überprüft habe und dadurch bin ich erst auf die Lösung oder das Hauptproblem gekommen.
Zurest habe ich noch einen Reflektor an die LED gebaut. Dadurch ist schon noch mehr Licht auf dem Präparat angekommen, aber das grüne Leuchten war nun so stark, dass ich vom Präparat nichts sehen konnte, schon gar nicht etwas leuchtendes. Also habe ich mich auf die Suche nach dem Grund des grünen Leuchtens gemacht. Auch ohne Präparat leuchtete es stark grün. Also dachte ich, dass es an irgend einer Optik oder Filter liegt. Also habe ich den ganzen Aufbau Stück für Stück abgebaut und immer geschaut, ob das grüne Licht noch da ist. Tja, und was soll ich sagen, dabei habe ich eine vergessene Polfilterfolie im Tubus direkt vor den Objektiven wiedergefunden. Und siehe da, ohne das Ding ist das grüne Leuchten nur noch minimal und was noch viel wichtiger ist, die Chloroplasten leuchten und ich kann sie sehen! Seht selbst. Ich habe ein Foto mit hochgeladen.
Was für mich auch noch eine wichtige Erkentnis ist: Ich benötige keine weitere Linse oder Blende. Ich habe nur die LED und den Reflektor um die LED. Das System für Fluoreszenz muss wohl nicht zwingend köhlerbar sein. Wenn ich auch noch Auflicht realisieren möchte, dann muss ich mich aber damit beschäftigen.
Auch für mich wichtig, meine Filter scheinen wohl doch die zu sein, die ich für die Wellenlänge benötige. Ich war ja schon stark am Zweifeln.
Um die gleichmäßige Ausleuchtung muss ich mich aber noch kümmern. Die Abschattungen an den Ecken des Bildes kommen aber vom Kammeraausschnitt am Tubus. Das ist bei meinen Fotos normal. Ich habe das Bild nicht weiter bearbeitet.
Aber ersteinmal genieße ich und verbuche das als erfolgreiches Wochenende. Nun habe ich das Gefühl, dass ich einen großen Schritt weiter gekommen bin.
Danke Euch nocheinmal für die Hilfe.
Viele Grüße
Kirsten