Hallo Protozoenfreunde,
beim Fotografieren kommt man um das Standart-Tierchen nicht herum.
Ich hab mal versucht beim Pantoffeltier in einer Ebene unterschiedliche Bestandteile zu bestimmen. Wie man sieht war das Viehch schon etwas plattgedrückt.
Mich würden vor allem zwei Dinge interessieren:
1. Handelt es sich bei den länglichen Organellen über dem Makronukleus um Extrusome oder doch um Mitochondrien? Die Schärfeebene liegt ja eher im Inneren der Zelle.
2. Was hat es mit den kleinen gelblichen Punkten auf sich. Vesikel, Basalkörper der Cilien oder was sonst?
Die Aufnahme wurde im DIK mit dem 50x 0,95 gemacht.
(https://i.postimg.cc/vTr3kmVM/Paramecium-07-caudatum-Pantoffeltier-Beschriftung-DIK-50-Z7.jpg) (https://postimg.cc/sG2YZsm0)
LG KlausZ
PS: Ich habe das Bild nochmal mit korrigierter Beschriftung eingestellt.
Hallo Klaus,
die Organellen die optisch über dem Makronukleus liegen sind Extrusome (= Trichocysten). Um die Mitochondrien zu sehen, muss man noch ein paar Scheibchen Vergrößerung drauflegen, also 100 X.
Die gelben Körper sind Kristalle, die praktisch in jedem Exemplar zu finden sind. Oft werden sie als Vorratskristalle bezeichnet, aber die genaue Funktion ist meines Wissens unbekannt. Viele andere Protozoen haben aber ebenfalls Kristalle im Plasma. Z.B. viele Amöben. Sie scheinen also eine wesentliche Funktion zu haben.
Noch etwas Bildkritik! Das Foto erscheint mir wie abgeblendet, als wenn nicht mit der nötigen Beleuchtungsapertur gearbeitet wurde. Du hast ja ein 50/0.95 verwendet. Da sollte wesentlich mehr drin sein. Die sichtbaren Details entsprechen eher der Auflösung eines 20X Objektives. Eventuell liegt es daran, dass Du immer versuchst streng nach Vorschrift köhlerst. Ich würde mal einen Versuch machen (falls nicht schon geschehen), dass Du nicht köhlerst sondern nur das Bild im Okular betrachtest und bei voll geöffneter Aperturblende (und Leuchtfeldblende) die Stellung des Kondensors suchst, bei dem das optisch beste Ergebnis entsteht. Am besten mit Testdiatomeen, zur Objektivierung. Eventuell ist die Köhler-Einstellung nicht die beste für eine optimale DIK-Einstellung.
Martin
Hallo Martin,
herzlichen Dank für deine Replik.
Bei den Zellorganellen wieder was dazu gelernt.
Ich denke, deine Anmerkung zur Bildqualität ist zutreffend.
Ich hab das Bild relativ schnell geschossen. Die Leuchtfeldblende war schon offen, aber ich hab beim Objektivwechsel nicht aufgepasst, die Aperturblende ganz zu öffnen. Ich weiß, dass das Köhlern beim DIK nicht so sinnvoll ist.
LG KlausZ
Hallo Klaus,
ich hatte Dir ja geantwortet, dass es zur Sichtbarmachung der Mitochondrien in Paramecium caudatum eine höhere Vergrößerung bedarf. Ich habe heute abend noch ein paar Foto von P. caudatum gemacht und die Mitochondrien beschriftet. Zuerst in lateraler Sicht. Man darf nicht zu stark quetschen, sonst denaturieren die Mitochondrien zu Bläschen. Deshalb nur gebremste Auflösung, aber man kann sie erkennen:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures012/323273_47096010.jpg) (https://postimages.org/)
EX = Extrusome
Mi = Mitochondrien
Die Mitochondrien erscheinen im DIK homogen, rund, oval oder wurstförmig. Ca. 2 µm groß.
Man kann sie auch in Aufsicht erkennen, wenn man den Fokus knapp unter die Pellikula legt. dort finden sich die meisten Mitochondrien für die Bewegungsenergie der Cilien. Die Extrusome sieht man jetzt rund in Aufsicht, hochbrechend. Dazwischen eingestreut die Mitochondrien:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures012/323273_21210914.jpg) (https://postimages.org/)
EX = Extrusome
Mi = Mitochondrien
Ich hoffe, das hilft Dir bei Deinen eigenen Beobachtungen weiter.
Martin
Es
Hallo Martin,
danke für deine vertiefenden Bilder. Wie immer große Klasse im Detail.
Im Querschnitt sind Extrusomen und Mitochondrien relativ gut zu unterscheiden.
In der Aufsicht wird das aber schon schwierig, weil viele Mitochondrien auch rundlich sein können.
Am deutlichsten sind die Extrusomen wahrscheinlich an ihrer Lichtbrechung zu erkennen. So viel ich gelesen habe, sollen das Kalziteinlagerungen sein.
Das Tier wird ja bei solchen Fotos möglichst still liegen müssen, um die Schärfenebene zu finden und kurz beizubehalten. Wie erreichst du das, ohne das Viech allzu sehr zu quetschen. Oder ist es einfach Schnappschuss-Glück?
Liebe Grüße
KlausZ
Hallo Martin,
ich habe heute versucht, deinen Vorschlag umzusetzen und ein Paramecium unter das 100 x "gedrückt".
Wie du siehst ist die Auflösung natürlich besser als im 50x, ohne an die lichte Feinheit deiner Aufnahmen heranzukommen. Die Bilder sind Ausschnitte, aber weniger stark wie bei dir.
Die etwas stumpfere, kontraststärkere Wirkung ist wahrscheinlich auch eine Frage der Bearbeitung.
Die Extrusomen kann man (vor allem im Querschnitt) auch in der Form ganz gut erkennen. Und ich meine, ganz schwach am Rand auch die rundlichen Formen der Mitochondrien zu sehen.
Ob bei der Aufsichtsaufnahme vor dem Zellkern außer den Extrusomen auch Mitochondrien dabei sind, bin ich mir nicht sicher. Vielleicht habe ich auch die Schärfenebene nicht genau erwischt oder das Tierchen schon zu sehr gequetscht.
(https://i.postimg.cc/R0hKK0Ch/Paramecium-24-caudatum-Pantoffeltier-Caudal-Cilien-Extrusome-DIK-100-Z7.jpg) (https://postimg.cc/yJqDzsZC)
(https://i.postimg.cc/3x7PKs8n/Paramecium-35-caudatum-Pantoffeltier-Mundfeld-Makronukleus-DIK-100-Z7.jpg) (https://postimg.cc/N5JNDPrH)
Schönen Abend
KlausZ
Hallo Klaus,
tut mir leid, wenn ich Dir das sagen muss, aber auf Deinen Aufnahmen sind die Mitochondrien nicht zu erkennen (auf beiden nicht). Man erkennt nur die Extrusomen und hochbrechende Vesikel. Die Mitochondrien sind "weicher" und nicht so hochbrechend. Du musst Deine Bilder mehr aufzoomen und schauen, ob noch genug Auflösungsreserve vorhanden ist, um die Strukturen, wie von mir eingezeichnet, zu erkennen. Ich sehe aber schon an Deinen Bildern, das dies wahrscheinlich nicht der Fall sein wird. Das Exemplar ist auch noch nicht flach genug. Dann geht die Auflösung mit dem 100X exponentiell schnell runter! Da zählt jedes µm Schichtdicke! Ich mache es so, dass ich ein Paramecium isoliere (da darf kein Dreck oder Staub mit drunter sein) und es durch vorsichtiges Absaugen erstmal festlege (ich nehme Kaffeefilter). Dann kann man in Ruhe das 100 X reindrehen und alles schön immergieren und justieren. Jetzt einfach abwarten und immer wieder Fotos machen. Den Schrott kann man ja später wieder löschen. Du wirst sehen, das die Auflösung dabei laufend zunimmt, aber irgendwann wirds dem Paramecium und den Zellorganellen zu bunt und sie denaturieren oder zerlaufen. Und das letzte Foto, bevor das passiert, ist dann das bestmögliche.
Schönen Abend
Martin
Hallo Martin,
danke für deine Beurteilung.
Das ist überhaupt kein Problem und macht die Suche nach feineren Details bzw. Organellen so spannend.
Im zweiten Bild sehe ich eigentlich auch nur die Extrusomen.
Im ersten glaubte ich am Rand die schwachen rundlichen Gebilde zwischen den Extrusomen als Mitochondrien ansprechen zu können. Aber das können auch tieferliegende Vesikel sein, wo man die Lichtbrechung nicht erkennt.
Ich hab dir nochmal einen Bildausschnitt angehängt, was ich meinte.
(https://i.postimg.cc/R0hKK0Ch/Paramecium-24-caudatum-Pantoffeltier-Caudal-Cilien-Extrusome-DIK-100-Z7.jpg) (https://postimg.cc/yJqDzsZC)
Jetzt gleich noch ein zweiter Versuch:
Ich merke allerdings, dass die die Paramecien aus meiner Milchkultur nicht ganz ideal, weil ziemlich dicht vollgefressen sind.
Was meinst du zur Aufnahme vor der Kontraktilen Vakuole?
Ich hab mal drei Beispiele nummeriert
(https://i.postimg.cc/59BYHz5p/Paramecium-40-caudaum-Pantoffeltier-Extrusome-ev-Mitochondrien-KV-und-MA-DIK-100-Z7.jpg) (https://postimg.cc/s12DqvNZ)
Kann man eigentlich beim Paramecium caudatum die gefelderte Pellicula lichtmikroskopisch darstellen oder ist das bereits jenseits der gängigen Möglichkeiten?
Die Felderung ist zwar prinzipiell erkennbar, kann man aber auch die Längs- und Querleisten sehen?
Herzliche Grüße
KlausZ
Hallo Klaus,
tut mir leid, auf beiden Aufnahmen kann man die Mitochondrien nicht erkennen. Die Strukturen 1 und 2 im letzten Bild sind auch Extrusome. 3 könnte ein Mitochondrium sein, aber arg verschwommen. Da fehlt noch ein Schäufelchen Auflösung! Du siehst es an den Extrusomen. Die schafft schon ein 40X ganz gut darzustellen. Bei Dir erscheinen sie mit dem 100 X noch verschwommen. Da geht bei Dir irgendwo Apertur verloren. Hast Du alles immergiert und durchjustiert? Bei der letzte Aufnahme mit der KV scheint es mir auch so, als wenn der DIK nicht gut eingestellt ist (zu "flach"). Hast Du geprüft, ob die Polarisatoren 100% auf schwarz sperren (oder zumindest dunkelgrau)?
Ja, das Lichtmikroskop kann die Felderung der Pellikula von Paramecium caudatum eigentlich locker auflösen. Allerdings gilt es auch hier den richtigen Zeitpunkt für das Foto zu finden. Wenn zu stark gequetscht wird, verschwindet die Felderung. Ich musste also etwas "locker lassen" für das Foto unten. In jedem Feld sitzt ein Basalkörper aus dem eine Cilie entspringt. ZUfällig habe ich auch noch eine Versammlung von Mitochondrien oben links mit erwischt:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures012/323403_2863675.jpg) (https://postimages.org/)
MO = Mundöffnung
Mi = Mitochondrien
Schönen Abend
Martin
Hallo Martin,
ich finde es gut, das du mir diese klare Rückmeldung gibst.
Das Problem mit der mangelnden Auflösung hatte ich an meinem Jenaval Kontrast von Anfang an und hielt es zunächst nur für meinen Mangel an eigener Erfahrung (Was ja auch sicher der Fall ist).
Letzte Woche hat mir Kurt, der schon seit langem mit dem gleichen Gerät arbeitet, einige weitere Tipps zur Justierung gegeben. Im Kontrasttubus sind die DIK-Modulatoren nun sicher richtig justiert (waren auch nur geringfügig verstellt).
Kondensorseitig ist das schon schwieriger. Auf schwarz sperren die Polarisatoren sicher nicht, bestenfalls ein dunkles Grau, am Jenaval ist das dann eher ein dunkles Blau.
Alle Aufnahmen sind zwischen Deckglas und Objektiv immergiert, Aperturblende offen,
Schichtdicke sehr gering (kurz vor dem Platzen), Blitz mit 1/16.
Soweit ich es beurteilen kann, sollte das stimmen. Und jetzt kommt das Problem, das ich schon seit Monaten bemerke. Es fehlt mir ein gutes Stück an Feinauflösung, übrigens auch zu den Aufnahmen von Kurt mit seinem Jenaval.
Ich finde es gut, dass du meinen Verdacht, den ich schon länger habe, bestätigst.
Die Frage ist jetzt nur, wo ist die wesentliche Fehlerquelle?
Da stehe ich nun ein wenig auf dem Schlauch.
Schönen Abend
KlausZ
Hallo Klaus,
ja, das Problem scheint auf der Beleuchtungsseite zu liegen. Du hast es bestimmt hier im Forum schon geschrieben, aber kannst Du nochmal sagen, welchen Kondensor Du betreibst. Ich meine jetzt die angegebene Apertur. Du schreibst, dass Du nur das Objektiv immergierst. Daher nehme ich an, Du hast einen Trocken-Kondensor mit n.A 0,9. Ist es der gleiche wie Kurt hat? Wenn ja, muss das Problem sogar noch weiter vorne liegen.
Martin
Guten Morgen Martin,
mein Kondensor ist der Standart (aplanatisch achromatisch 0,9), der gleiche wie bei Kurt.
Allerdings benützt Kurt objektivseitig nicht die Schleife über den Kontrasttubus, sondern eine kleine DIK-Einrichtung direkt hinter dem Objektiv. Dadurch hat er mehr Licht. Er meint aber, dass der Kontrasttubus (eine jenavalspezifische Konstruktion mit einem langen Glasweg) keinen Einfluss auf die Auflösung habe.
Ich habe versucht die Justierungen von Kurt unter seiner Anleitung nachzuvollziehen, aber bislang keine wesentliche Verbesserung der Auflösung erzielt.
In meinen Okularen ist der Bildeindruck für meine Begriffe ganz gut und relativ klar.
Auf dem Chip sind die Bilder dann eher flau und flach. Bei mehr Licht wird alles einfach nur überbelichtet. Meinen Aufnahmen fehlt grundsätzlich die Leuchtkraft und Feinheit vor dem blauen oder grauen Hintergrund. Wenn ich einen möglichst dunklen Hintergrund einstelle, sind die Objekte sehr schnell dunkelfeldähnlich überstrahlt.
Und, wo im Original keine Strukturen sind, kann man sie auch nicht durch die Bildbearbeitung hervorzaubern.
Kurt und ich haben mit dem gleichen 100x Objektiv dieselbe Diatomee (ich habe ihm meine Amphipleura geschickt) im DIK fotografiert. Seine Auflösung ist einfach besser.
Bei mir sind ziemliche Überstrahlungen und Chromasien zu sehen.
Also jetzt stehe ich wieder am Anfang und habe erneut den Verdacht, es könnte sich in meinem Jenaval Kontrast eine systematische Fehlerquelle im Strahlengang befinden.
Grüße KlausZ
Hallo Klaus,
es ist in der Tat so, dass sich meine und Deine Ergebnisse auf dem Foto vom selben Präparat (ich hatte ja dein Präparat hier in Freiberg) unterscheiden.
Da ich beide Möglichkeiten für DIK realisieren kann (mit Kontrasttubus KT über Modulatoren und ohne KT über den kurzen Lichtweg mit DIK-Prismen zwischen Objektiv und Revolver) kann ich mit Sicherheit sagen, dass die Bildqualität über den KT nicht gemindert wird!
Der KT verlängert den Lichtweg deutlich, bringt eine Farbverfälschung (leichtes "Flaschengrün") und einen Lichtverlust mit sich. Die Verfärbung lässt sich mittels Blaufilter beheben und der Lichtverlust beträgt weniger als einen Blendenwert, d.h., wenn ich unter gleichen Bedingungen ein Foto mache und die Belichtungszeit beträgt über den KT 1/30 sec, dann ist sie ohne KT 1/60 sec.
Der große Vorteil des KT mit den Modulatoren für DIK und Phako ist, man kann die normalen Hellfeld-Objektive für Phasenkontrast einsetzen und ich brauche keine Zwischenstücke (Stühlchen) zwischen Revolver und Objektiv für das DIK-Verfahren! Weiterhin besitzt der KT noch einen Vergrößerungswechsler 0,8 - 1,0 - 1,25! Alles Zusammen eine tolle Konstruktion ohne Verlust an Bildqualität!!!
Die kleine DIK-Einrichtung gab es zum "normalen Jenaval", ich habe sie mir zugelegt, als ich 1999 noch mit der 25 W-Halogenlampe gearbeitet habe, da war das Licht beim 100er-Objeltiv über den KT etwas schwach...., heute mit LED kein Thema mehr!
Der 0,9er Kondensor bildet die Leuchtfeldblende wie einen Scherenschnitt, absolut ohne Farbsaum ab und genügt bei Objektiven bis Apertur 1,0 den allerhöchsten Ansprüchen!
Bei Immersionsobjektiven ist es leider so, dass man die n.A. von 0,9 kondensorseitig nicht nutzen kann, da das DIK-Prisma kleiner ist als die offene Blende des Kondensors. Die Fassung des Prismas begrenzt die Apertur auf ca. 0,65. Das ist so gemacht, weil das Jenaval auf Kontrast getrimmt wurde.
Es gibt einen sehr guten 1,3er Pol-Immersions-Kondensor...., aber dafür sind die DIK-Prismen und Modulatoren nicht geeignet und andere Prismen gibt es nicht - das ist das Problem bei Untersuchungen an der Auflösungsgrenze der Lichtmikroskopie mit dem Jenaval!
Diese Ausführungen habe vor allen für die Mikroskopiker gemacht, welche das Janaval nicht "persönlich" kennen.
Klaus, deswegen mein Vorschlag: lass erst mal die Mitochondrien ruhen und versuche Bilder mit Objektiven bis n.A. 0,95 zu machen, die richtig, richtig gut sind. Wenn ich Martins Erfahrung und Geduld bei der Herstellung von Präparaten sehe, glaube ich, da haben wir alle noch viel Luft nach oben...
Viele Grüße aus FG
Kurt
Hallo Kurt,
schönen Dank für Deine Erläuterungen zum Jenaval - das ist für mich, der ich das Gerät nicht kenne, sehr hilfreich.
Dass die Apertur des 100er Immersionobjektives systembedingt im DIC nicht voll genutzt werden kann, muss ja nicht immer so stark ins Gewicht fallen wie man meinen könnte. Deine Bilder beweisen dies regelmäßig!
Schöne Grüße
Ole
..... danke Ole, genau das war mein Anliegen!
Es wird in letzter Zeit, hier im Forum öft über das Jenaval geschrieben. Jedoch sind es wohl deutlich weniger als 10% der Foristen, die das Gerät wirklich kennen. Ich kenne es seit 1992 und besitze es seit 1997 und bezeichne es als das beste Mikroskop, welches jemals in der DDR gebaut wurde..., gefolgt von den Modellen Lumipan und Nf-Mikroskop mit pankratischem Kondensor aus der 160 mm - Aera. Diese Geräte kenne ich bis zur letzten Schraube, alles noch C.Zeiss Jena-Original....
Viele Grüße
Kurt