Liebe Mikroskopierende,
Dauerpräparate sind für Tier- und Pflanzengewebe sehr üblich, doch für viele Einzeller und Algen aquatischer Lebensräume eher die zweite Wahl (gegenüber der Lebendbetrachtung). Dennoch gibt es die Notwendigkeit bei der Beschreibung neuer Einzeller-Arten, Dauerpräparate als "Typusmaterial" in öffentlichen Sammlungen zu hinterlagen. Mit einigen Ciliaten geht dies aufgrund der Silberfärbungen (z.B. Protargol) recht gut, wobei auch diagnostisch wertvolle Merkmale erhalten bleiben.
In meinem Labor an der Universität Köln bearbeiten wir hauptsächlich Amöben und Zieralgen. Gerne würde ich eine gute Färbemethode für diese Lebensformen erarbeiten. Die deutliche Darstellung des Zytoplasmas und ggf. auch der Zellkerne wäre ideal. Die Zellen sollen letztlich über Ethanol und Isopropanol in Euparal eingebettet werden.
Für Vorschäge, Hinweise und Färbeprotokolle wäre ich ausgesprochen dankbar. Ich denke, dass sich einige Färbungen aus der Tier/Pflanzenwelt auf Einzeller übertragen lassen dürften.
Mit besten Grüßen,
Sebastian Hess
https://zoologie.uni-koeln.de/arbeitsgruppen/ag-hess (https://zoologie.uni-koeln.de/arbeitsgruppen/ag-hess)
Moin Sebastian,
Zieralgen und andere Grünalgen schließe ich nach folgendem Verfahren ein:
1. Fixieren mit 2%iger Formalinlösung. Fixierdauer 6 - 12 Stunden. Oder mit Pfeiffers Gemisch.
Fixierdauer 2 - 6 Stunden , wenn grüne Farbe erhalten werden soll, oder 12 - 24 Stunden, wenn Nachfärbung erfolgen soll.
2. Auswaschen in mehrfach gewechseltem destillierten Wasser (12 - 24 Stunden)
3. Färbung z.B. mit Alizarinviridin in 1 : 1 bis 1 : 5 verdünnter Farblösung 2 - 24 Stunden lang.
Überfärbungen treten nicht auf !
4. Auswaschen in destilliertem Wasser bis keine Farbwolken mehr abgehen.
5. Entwässerung: In ein Glasröhrchen etwa 1cm hoch konzentriertes, chemisch reines Glycerin einfüllen und bei sehr schräg gehaltenem Glas die Algen (in destilliertem Wasser) in einer 1 - 2 cm dünnen Schicht langsam übertragen. Die Flüssigkeiten dürfen sich nicht vermischen! Gladsröhrchen
vorsichtig lotrecht stellen und abgedeckt stehen lassen. Vollständige Durchtränkung ist erreicht, wenn die Algen nach einigen Tagen auf den Boden abgesunken sind. Überstehendes Glycerin absaugen und vorsichtig (s.0.) reines Glycerin 1 - 2 cm nachlaufen lassen.
6. Dauerpräparat z.B. mit Doppel-Deckglas-Methode oder über Alkoholstufen in Harze (z.B. Caedax).
Grüße sendet
CMB
Hallo zusammen,
ich danke für die Kommentare (manche erreichten mich auch per PN).
Inzwischen hat sich ein Student von mir an die Optimierung der chemischen Fixierung von Amöben für gefärbte Dauerpräparate gegeben.
Wir benutzen erfolgreich 2,5 % Glutaraldehyd in MT-Puffer (30 mM HEPES, 15 mM KCl, 5 mM EGTA, 5 mM MgSO4; pH 7) für 10-15 minuten und schließen dann eine halbstündige Postfixierung mit Osmiumtetroxid an (etwa 0,04 %). Letzteres permeabilisiert die Membranen hinreichend, sodass es bei der Entwässerung zu kaum sichtbaren Schrumpfungen kommt.
Fixierung, Entwässerung mit EtOH (20-40-60-80-96-100%), Isopropanol and Intermedium und Einschluss in Euparal funktionieren soweit.
Leider machen wir gerade die Erfahrung, dass die Cytoplasma-Farbstoffe Eosin und Erythrosin (beide färben die Amöben in wässricher Lösung ganz hervorragend) in der EtOH-Reihe wieder ausgewaschen werden (s.u.).
Die Vampiramöbe Leptophrys vorax:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures012/328475_36849274.jpg)
Daher meine Frage: Muss man bei Eosin und ähnlichen Farbstoffen anders Entwässern und ggf. ein andere (Xylol-abhängige) Harze verwenden?
Ich bin für jeden Hinweis dankbar.
Beste Grüße,
Sebastian
Hallo Sebastian,
Ich habe es aufgegeben, Färbungen für Protisten zu verwenden, und verlasse mich auf DIC für den Kontrast. Ich kann mir aber vorstellen, dass Sie Kernfarbstoffe verwenden wollen. Haben Sie es mit wässrigem Montagemittel versucht? Ich verwende es selbst nicht, war aber letztes Jahr bei einer Demonstration überrascht, wie gut Fruktosesirup bei Algen wirkt.
Ein Tipp von mir: Sie können OsO4 vielleicht vermeiden, indem Sie eine Lugol-Aldehyd-Mischung verwenden. Bereiten Sie es jedoch frisch zu, da Lugol innerhalb weniger Stunden durch Aldehyde oxidiert (neutralisiert) wird.
Übrigens: Material auf Polylysine-Deckgläsern lässt sich bei mir problemlos von 100%igem Ethanol direkt in Euparal einlegen.
Mit freundlichen Grüßen,
René
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