Hallo zusammen,
Ich habe versucht, die Chlorophyllfluoreszenz mit einer Blaulicht-LED mit 450-460 nm Emission, im Durchlicht und einem orangefarbenen Sperrfilter anzuregen, aber ohne Ergebnis. Können Sie mir den Grund für den Ausfall erklären? Ungeeignete Lichtfrequenz, zu geringe Leistung oder etwas anderes?
Danke und viele Grüße.
Enzo
Hallo Enzo,
Die Wellenlänge ist schon geeignet. Mögliche Gründe für den Fehlschlag sind:
Lichtleistung zu gering.
Umgebungslicht zu hell.
Probe zu dick oder dicht.
Wenn Du zum Beispiel ein Blatt unter das Mikroskop legst, wird die Unterseite angeregt. Das rote Fluoreszenz-Licht müsste nun das Blatt durchdringen. Versuche es in diesem Fall mal mit Auflicht. Durchlicht-Fluoreszenz eignet sich eher für sehr dünne Proben.
Viele Grüße
Alexander
Hallo Alexander,
danke für den Tipp, jetzt ist einiges klarer.
Ich werde versuchen, die Lichtleistung zu erhöhen.
Leider habe ich nur ein manuelles Mikrotom und mein Mikroskop ist nicht für Auflicht ausgelegt.
Mir fehlt die passende Optik und vor allem fehlt mir die Möglichkeit Prismen mit dichroitischem Filter einzusetzen. Ich habe höchstens eine Epival 1 ohne Prismen und Sperrfilter.
Ich werde es noch einmal versuchen und wir werden die Ergebnisse sehen.
Danke und viele Grüße.
Enzo
Hallo Enzo,
Auflicht kann man mit einfachen Mitteln basteln. Mit der blauen LED seitlich von oben das Präparat beleuchten. Das klappt ganz gut, solange die Objektive genug Arbeitsabstand haben. Wichtig ist auch die Verdunklung des Arbeitsraums, damit das Umgebungslicht nicht das Fluoreszenz-Licht überstrahlt.
Viele Grüße
Alexander
Hallo Alexander,
Zitat von: Aljoscha in August 19, 2022, 12:29:16 NACHMITTAGS
Wichtig ist auch die Verdunklung des Arbeitsraums, damit das Umgebungslicht nicht das Fluoreszenz-Licht überstrahlt.
Daran hatte ich nicht gedacht. Eventuell ist die gleiche Beleuchtung im Durchlicht ungünstig.
Im Durchlicht habe ich kein Dunkelfeld, sondern einen Hintergrund, den der Orangefilter von Blau nach Grün umwandelt.
Schließlich hat der Fluoreszenzkondensor eine Gruppe von Einsetzlinsen, aber die Gebrauchsanweisung habe ich nicht. Es scheint zu komplex, um nur ein ein großer Feldbeleuchter sein.
Danke und viele Grüße.
Enzo
Hallo Alexander,
Ich habe einen Test gemacht und, um eine geringe Dicke zu haben, habe ich eine Grünalge Scenedesmus untersucht.
Ich melde ein Foto in Weißlicht und eines in Blaulicht mit einem orangefarbenen Sperrfilter.
Es gibt einige rote Emission, insbesondere von unten zum Kondensator. Dies deutet darauf hin, dass die Leistung der LED nicht ausreicht.
Wenig rote Emission im Vergleich zum sehr grünen des Fotos mit weißem Licht.
Beim Vergleich der beiden Fotos habe ich Zweifel, dass das Rot auf dem zweiten Foto im Blaulicht keine Fluoreszenz ist, sondern nur die seitliche Farbe der Optik.
Irgendwelche Vorschläge?
Danke und viele Grüße.
Enzo
Hallo Enzo,
In diesem Fall hätte ich den Sperrfilter im Verdacht. Der lässt offensichtlich auch kürzere Wellenlängen als orange durch.
Viele Grüße
Alexander
Hallo Alexander,
Den Blockfilter habe ich von einem Durchlicht-Fluoval1 genommen, der allerdings eine Beleuchtung mit einer UV-Quecksilberlampe hatte.
Es hatte auch einen tiefblauen Anregungsfilter und dafür dachte ich, es könnte auch mit blauen LEDs funktionieren.
Können Sie mir eine Referenz für den Kauf eines geeigneten Sperrfilters geben?
Danke und viele Grüße.
Enzo
Hallo Enzo,
Ich habe mal ein paar Versuche mit Durchlichtfluoreszenz an meinem Leitz Dialux gemacht. Als Anregungsfilter habe ich einen BG12 (4 mm) von Zeiss eingesetzt und als Sperrfilter verschiedene Leitz-Filter durchprobiert. Als Lichtquelle diente eine ordinäre weiße LED (6 V, 1,25 A) von Stephan Hiller. Hellfeld-Kondensor NA 0.9. Als Probe habe ich Euglena gracilis verwendet. Ich erhalte starke rote Fluoreszenz vom Chlorophyll der Einzeller. Mit dem K510 als Sperrfilter hat der Hintergrund noch einen Grünstich. Ab dem K530 aufwärts ist der Hintergrund schwarz wie die Nacht. Der BG12 ist ein Kantenfilter, der UV, Violett und dunkles Blau durchlässt und alle längeren Wellenlängen sperrt. Die Dicke dieses Anregungsfilters ist relevant. Ist er zu dünn, kommt Licht längerer Wellenlängen durch und stört das Bild.
Deine Probleme liegen wohl irgendwo bei Lichtquelle und Filtern.
Viele Grüße
Alexander
Hallo Alexander,
Vielen Dank für Ihre Vorschläge. Vielleicht habe ich den BG12 Filter im Zubehör eines Fluoval1. Die Sperrfilter wurden vom selben Mikroskop genommen und sollten gültig sein, hoffe ich zumindest. Als Blaulichtbarriere wurde der Filter vom Typ CZJ OG1 mitgeliefert, der zusammen mit dem GG9 (Autofluoreszenzblock) montiert wurde, der Ihrem K510 entsprechen sollte. Ich habe kein Weißlicht und keinen Emissionsfilter verwendet, sondern direkt das Licht einer CREE XLM2-T6 Led, die blau 450-460 nm emittieren sollte. Möglicherweise wird das LED-Emissionsband nicht eingehalten. Ich werde weitere Tests machen.
Danke und viele Grüße.
Enzo
Hallo Alexander,
das sind die Ergebnisse der Tests:
- mit der blauen LED ohne Filter habe ich ein Bild in grünem Licht bekommen
- mit der weißen LED und dem Emissionsfilter Zeiss BG12 habe ich ein Rotlichtbild bekommen.
In beiden Fällen kein Hinweis auf Fluoreszenz.
Zur Visualisierung der Chlorophyll-Fluoreszenz muss ich die blaue LED und zusätzlich den BG12-Emissionsfilter verwenden.
Ich verstand nicht warum. Hängt es von der LED oder dem Kamerasensor ab? Sollte die blaue LED oder der Weißlichtfilter nicht ausreichen?
Danke und viele Grüße.
Enzo
Hallo Enzo,
Die Kamera würde ich weglassen, stattdessen mit Augen und Okularen arbeiten, solange ich am Set-up experimentiere. Die Kamera bringt zusätzliche Probleme rein. Steht sie auf Belichtungsautomatik?
Die blaue LED ist kein Saphir-Laser, der kohärentes Licht in einem ganz engen Band von ca. 10 nm abstrahlt, sondern sie produziert eine hübsche Glockenkurve mit Maximum bei 460 nm. Im Auflicht ist das kein Problem, im Durchlicht schon. Deshalb sind keine Ergebnisse mit zusätzlichem BG12 besser. Frage: wie dick ist der? Bei 4 mm sollten auch die weiße LED oder eine Halogenlampe funktionieren, darunter ist es schwierig.
Die 3 Bilder deuten für mich darauf hin, dass die Kamera ein nicht unbedeutendes Teil des Problems ist.
Viele Grüße
Alexander
Hallo Alexander,
der BG12-Filter ist etwa 2 mm dick. Ich kann durch die Okulare nichts sehen, sondern nur mit der Kamera bei einer Belichtungszeit von ca. 1,5 s und mit erheblichem Rauschen, wie man durch Vergrößerung des Bildes sieht.
Filter und insbesondere BG12 habe ich bei Ebay nicht gefunden. Ich habe bei Ebay keinen BG12 Filter mit 15mm Durchmesser für den episkopischen Arm und zum Testen im Auflicht gefunden.
Ehrlich gesagt bin ich entmutigt.
Danke und viele Grüße.
Enzo
Hallo Enzo
hast Du eventuell noch einen Polfilter dauerhaft als Analysator eingebaut?
Mit dem hat die Fluoreszenz bei mir überhaupt nicht funktioniert. Ohne Polfilter ganz prima, auch mit einer blauen LED
vG
Peter mikropit
Hallo Peter,
Ja, ich habe einen Polarisationsfilteranalysator.
Ich hatte Zweifel, aber ich habe sie verworfen, weil ich keinen Grund finden konnte. Deine Erfahrung bestätigt mir das Gegenteil.
Vielen Dank und schöne Grüße.
Enzo
Hallo Peter,
Ich habe den festen Polfilter aus der Röhre entfernt, aber leider sind die Ergebnisse gleich geblieben. Mit nur der blauen LED erhalte ich ein grünliches Bild.
Meine Led ist wohl nicht geeignet.
@Alexander
Ich habe mich in Bezug auf die Dicke des BG12-Filters geirrt. Meins ist auch 4 mm dick, aber anscheinend reicht es nicht aus, um die Chlorophyllfluoreszenz von weißem Licht zu erhalten.
Ich hoffe, mit Ihren Anregungen eines Tages zum gewünschten Ergebnis zu kommen.
Danke an alle und beste Grüße.
Enzo