bitte löschen, danke !
Many years ago I was facing the task of counting platelets in a counting chamber with phasecontrast. An Ortholux with PhV objectives and Heine condenser could not handle the problem with a thick counting chamber and a thick coverglass. I ended up with using a Zetopan with Reichert Semplan objectives and a Polyphos condenser. This combination allowed plenty of working distance.
Hallo ADi,
ich denke Du kannst hier keine Objektive mit so hohen Na's verwenden.
Mit Deinem Mitutoyo 4x, oder 10x/0,28 oder ggf. 20x solltest Du brauchbare Ergebnisse erzielen können.
Vielleicht mal mit schiefer Beleuchtung probieren, oder hast Du eine Dunkelfeld-Möglichkeit?
Bei Bernstein-Inklusen kann man o.g. Objektive auch anwenden, und die Inklusen sind oft nicht plan.
LG Frank
Hallo Adi,
das gleiche Problem hab ich auch :-( Die dickeren Objekte (Käfer, Zikaden, Raupen) sind schwierig einzubetten. Ich lege da einen handelsüblichen O-Ring 22mm°, 1,3mmdick auf einen Objektträger, fülle mit Malinolauf, bette das Objekt ein und deckel mit einem 24mm° Deckglas ein. Trotz sorgfältiger und sauberer Arbeit bilden sich doch immer wieder kleinste Bläschen im Einbettungsmittel, welche dann bei der Betrachtung stören. Beste Bildergebnisse hab ich mit einem Euromex Stativ mit Zeiss/J Epiplan Objektiven im DF-Auflicht erzielt; bei stark aufgehellten Objekten auch im HF-Durchlicht, wobei da die Bläschen weniger störend sind.
Grüße
Wolfgang
Hallo Adalbert,
es gibt von Lomo den 40er Wasserimmersionsachromaten, NA 0,75; der hat einen derart großen Arbeitsabstand, dass es bei "normaldicken" Präparaten manches Mal schwierig ist, genügend Wasser drunter zu bekommen. Vielleicht wäre das eine Option
Hallo ADi,
ich denke die Störungen durch das Deckglas und durch das Eindeckmittel lassen bei der Tiefe des Objektes nicht mehr Details erkennen, als mit dem 20x /0,42. Da bist Du ja schon theoretisch unter 1 µm Auflösung, das reicht eigentlich locker für die Krallen.
Mit Immersion kann man natürlich noch etwas mehr Details herausholen, denke ich. Aber ob es das dann bringt?
Der Tip von Jürgen könnte in die richtige Richtung gehen, vgl. z.B. https://www.edmundoptics.de/f/olympus-water-immersion-objectives/15074/ Die aktuellen Olympus Objektive haben alle über 3 mm Arbeitsabstand, da braucht es schon einen dicken Tropfen am Anfang. ;D
Bin gespannt, ob Du da noch etwas mehr herauskitzeln kannst.
LG Frank
Hallo ADi,
warum bemühst du dich mit so schlechten Präparaten ab? Für deine Projekte kommst nicht um ein zielgerichtetes präprieren herum. Hier ein Beispiel: http://www.thrips-id.com/en/
Gutes Gelingen!
Arnold
Hallo Adi,
Zitatdas Präparat ist schon toll, nur ich habe keine passenden Objektive dafür.
Manchmal ist es einfacher, das Präparat an erhältliche Objektive anzupassen .... ;)
Zitatbin immer noch auf der Suche nach Informationen, welche Rolle die Immersion und das Deckglas beim Stacken spielen.
Natürlich eine große Rolle bei diesen etwas unrealistisch hohen NA bis zu 0.95. Da sind dann zehntel mm Deckglasdickenabweichung relevant, oder man verwendet ein Objektiv mit Korrekturring.
Hubert
Hallo ADi,
gib in der Suchfunktion einfach Deckglasdicke ein, da wirst Du fündig in allen Richtungen.
LG Frank
Hallo Adi,
ZitatFotos der Inklusen zeigen doch auch tiefe Objekte in einem ,,Einschlussmittel". Man muss aber zugeben, dass die meisten in kleinen ABMs abgebildet sind.
die Gesetze der Optik gelten nun einmal, unabhängig von Wunschvorstellungen. Entscheidend ist die bei zunehmender NA sprunghaft ansteigende Empfindlichkeit bezüglich der Eigenschaften des optischen Mediums, das durchleuchtet wird. Außerdem muss das Einschlussmittel stimmen. Ich habe ausdrücklich von NA im Bereich bis zu 0.95 gesprochen, Dein wiederholtes Beispiel mit dem 20x hilft da nicht weiter.
Beim Stacken gelten nicht grundsätzlich andere optische Gesetze. Wenn man dabei im relevanten Umfang die dazwischen liegende Schichtdicke verändert, ändert sich auch von Bild zu Bild die Abbildungsqualität. Und wenn jedes Bild sowieso schon unscharf ist, kann auch Stacken daran nichts verbessern.
Hubert
Hallo Adi,
Hubert hat es ja schon dargelegt: da gibt´s nichts zu probieren, das kann man berechnen. Es ist nun einmal so: Je höher der Korrektionsgrad und je höher die NA eines Objektives, umso empfindlicher reagiert es auf Abweichungen der Deckglas(Schicht)dicke. Die höheraperturigen Trockenobjektive mit der von Dir anvisierten NA zwischen 0,75 und 0,95 sind praktisch immer als Korrektionssysteme ausgeführt. Die stellt man ein, indem man sich in einem Präparat kleine, möglichst dunkle Punkte sucht und durch Drehen am Korrekturring auf höchsten Kontrast einstellt; das bedeutet, man kann die falsche Deckglasdicke visuell wahrnehmen!
In der alten Version Mikroskopieren von Anfang an von Zeiss wird auf S 42 ein Vergleichsbild gezeigt von korrekt und falsch eingestellter Deckglasstärke bei einem Planachromaten 63 / 0,9 korr.
Hallo Adi,
Mit Stacken habe ich mich noch nicht beschäftigt.
Nur um die Größenordnungen zurechtzurücken: Der Verstellbereich eines Objektives 63 / 0,9 geht von 0,11 bis 0,21 mm. Weit kommt man da nicht. Drei mm überbrücken selbst die LD-Objektive nicht, wie sie für Kulturflaschen an inversen Mikroskopen verwendet werden. Diese Objektive sind wirklich schwierig handzuhaben. Ich bevorzuge bei diesen hohen NA Immersionsobjektive.
Hallo Adi,
ZitatWenn man das alles berücksichtigt, wird etwas klarer, warum ich nach der Relation zwischen dem Stacken und dem Deckglas gefragt habe.
ich verstehe nicht was Du damit zum Ausdruck bringen willst, zwischen Einzelbildern und Stacken besteht kein Unterschied. Es wurde schon erwähnt dass Stacken nichts an der Unschärfe verändert, die durch eine Fehlanpassung des Deckglases bzw. des Einschlussmittels bei Objektiven hoher NA entsteht. Solange die gesamte Stacktiefe aber noch innerhalb der Fehlertoleranz des Objektives für falsche Anpassung des Mediums zwischen Objektiv und Objekt liegt, ist alles in Ordnung.
Das Thema Deckglasdicke wurde hier schon wiederholt diskutiert, und u.a. erwähnt dass ganz grob gesagt bei einer NA=0.40-0.45 eine falsche Kombination Objektiv-Deckglas störend sichtbar wird. Natürlich hängt das auch von der Anpassung der Kamera an die Objektivauflösung ab, das muss ich sicher nicht erwähnen. Die zulässige Abweichung vom optimalen Wert der Deckglasdicke reduziert sich etwa mit der 4. Potenz der NA des Objektives, das Bild wird also ab einen bestimmten Wert sprunghaft schlechter. Ich hatte das hier https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=35840.msg262378#msg262378 (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=35840.msg262378#msg262378) auch einmal an zwei gerechneten Beispielen demonstriert (erste Reihe Vergleich ohne-mit Deckglas 0.17 mm, zweite Reihe Vergleich Fehlanpassung 0.02 mm). Ähnliches gilt natürlich auch wenn das Medium hinter dem Deckglas vergleichbar dick ist oder einen falschen Brechungsindex besitzt.
Hubert
Hallo Adi,
ich weiß wie Stacken funktioniert. ::) Ich habe mich natürlich auf das "Deckglasproblem" bezogen, da besteht kein Unterschied zwischen Einzelbildern und Stacken. Ein Stapel unscharfer Bilder bleibt auch nach dem Stacken unscharf. Es genügt also, das Problem für jedes Einzelbild aus dem Stack zu betrachten. Und da wurde in den früheren Diskussionen zu dem Thema Deckglasdicke doch das Wesentliche erläutert.
Hubert
Hallo ADi,
Du suchtest Bilder, die die Zusammenhänge zeigen.
Aus der Suche nach "Deckglasdicke" begrenzt auf die letzten 999 Tage, sind sehr gute Treffer dabei, die das von mehreren Seiten erläutern.
Hier, https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=38335.msg282092#msg282092, sind auch schöne Vergleichsbilder eines Testobjektes mit und ohne Deckglas.
oder hier https://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/immersion.html viel Info, auch bei den Treffern gefunden
Wie schon Hubert schrieb bleibt ein unscharfes Einzelbild auch im Stack unscharf, somit der gesamte Stack.
Ich übersetze das für mich mal so:
Ich brauche eine Brille mit Korrektur meiner Sehschwäche (z.B. Hornhautverkrümmung, Astigmatismus).
Wenn ich keine Brille nehmen möchte, dann sehe ich alles verschwommen, egal wie nah oder wie weit ich weg bin.
Nehme ich die falsche Brillenstärke kann ich immer noch nicht scharf sehen auch wenn die super vergrößern kann und bei meinem Bruder bestens funktioniert.
In wieweit Dir eine Dekonvolution Funktion helfen könnte kannst Du ja mal probieren und uns zeigen. Ich meine die Planeten-Fotografen machen das.
Du bist ja sehr experimentierfreudig, probiere es mal an der Klaue , oder einer tiefer liegenden Struktur aus, wäre sicherlich interessant. Vielleicht erfindest Du damit das Rad neu? (ernst gemeinter Vorschlag)
Das eingedeckte Insekt hat vermutlich mind. 3 Fakten, um die man nicht herumkommt.
1. Die Stacktiefe um alles erkennen zu können beträgt 2 mm + unbekannte Deckglasdicke >>> das geht nur mit Arbeitsabstand von >2mm besser 3 mm, also bei hoher n.a. nur mit den schon vorgeschlagenen Wasserimmersionsobjektiven, die kommen bis zu 3 mm tief.
2. Das Deckglas hat wohl eine n.a. von ca. 1,515 >>> da geht definitiv nix mit Objektiven ohne DG-Korrektur, s.o. >>> also idealerweise eines mit einstellbarer Korrektur verwenden.
3. Das Medium in dem der Käfer eingebettet ist, ist Dir unbekannt. Auch hier kann kein Trockenobjektiv hoher n.a. klar durchsehen.
Alles nichts neues
LG Frank
Hallo Frank,
das Deckglas hat die vorgeschriebenen 0,17mm und das Medium ist Malinol.
Grüße
Wolfgang
Zitat von: Adalbert in Oktober 04, 2022, 21:29:39 NACHMITTAGS
Die ursprüngliche Frage war nach den Objektiven, die für sehr dicke Dauerpräparate geeignet sind.
Wie ich sehe ist Diskussion in die Richtung Deckglasdicke gelaufen, was in diesem Thread nicht gefragt war.
ADi
Hallo ADi,
das Thema Dauerpräparat steht für mit Deckglas abgedeckten Objekträger. Daher sind m.M.n. die geeigneten Objektive, welche Du ja mit
hoher n.a suchst, direkt damit und mit dem Einbettmedium in Verbindung zu bringen.
Verschiedene Objektive mit einem passenden Arbeitsabstand hast Du ja schon aufgelistet.
Die fehlenden Infos zu Deckglasdicke und Einbettmedium hat Wolfgang auch geklärt, die n.a. kannst Du nachlesen.
Gut Stack.
Gute Nacht wünscht Frank
Guten Morgen
Für mich sind Dauerpräparate nicht immer mit Deckglas verbunden, im Auflicht-Bereich gibt es die Dauerpräparate fast immer ohne Deckglas. z.B. Gefügeätzungen, Kunststoff oder Lackoberflächen, Stoff und Gewebemuster, Papiergefüge usw.
Damit ist der 1:1 Bezug zum Deckglas meiner Meinung nach nicht korrekt, auch wenn das für den Durchlicht-Bereich durchaus zutreffend ist ...
Liebe Grüße
Gerhard
Hallo Gerhard,
Du hast natürlich recht.
Danke für die Richtigstellung.
LG Frank
Hallo,
das Deckglas mit seinen 0,17 mm ist hier das kleinere Problem, aber Adi will ja bis zu 2mm tief in die eingebettete Probe reinschauen. das ist bei angenommen etwa gleichem Brechungsindex wie Glas nochmal der über 10 fache optische Weg n x d und da stimmt dann die Korrektur bei weitem nicht mehr egal ob mit oder ohne Deckglas.
Was man bräuchte ist ein Ölimmersionsobjektiv (homogene Immersion) mit großem Arbeitsabstand und die gibt es nicht.
Es gibt aber Wasserimmersionsobjektive mit großem Arbeitsabstand wie z.B. das schon erwähnte Olympus LUMPlanFl 40x/0.80 W . Das ist zwar nach Werksangaben angeblich auf Deckglasdicke 0
korrigiert, aber nach meiner Erfahrung haben die auch mit Deckglas 0,17 mm keine merkliche Einbuße in der Bildqualität sowohl im Auflicht bei Beleuchtung durch das Objektiv als auch im Durchlicht. Ich habe mit diesem Objektiv auch schon durch 2mm dickes Einbettmittel (für die Elektronenmikroskopie) auf Retinazellen auf einem Mikrochip geschaut und gute der hohem Apertur entsprechende Bildauflösung erhalten. Das Objektiv ist für 3,3 mm Arbeitsabstand in Wasser mit Brechungsindex von 1,33 gerechnet und es ist offensichtlich noch nicht so sehr erheblich ob davon 2mm Eindeckmittel mit etwas höherem Brechungsindex sind.
Selbst das LUMPlanFl 60x/1.0 W mit einem Arbeitsabstand 2mm liefert bis ca. 1mm tief ins Einbettmittel ein der hohen Apertur entsprechendes tadelloses Bild.
Sie kosten natürlich neu einige tausender und sind auf dem Gebrauchtmarkt schwer erhältlich.
Sie sind auch tolle Objektive um tiefliegende Bernstein Inklusen mit hoher Auflösung zu beobachten.
viele Grüße
Wilfried
Hallo Adi,
definitiv dunkel!
Grüße
Wolfgang
Hallo Adi,
mir gefällt auch die dunklere Version des Bildes besser.
Viele Grüße!
Rainer
Hallo ADi,
das Bild mit dem dunklen Hintergrund sieht klasse aus. Die anderen mit den hellen Hintergründen sehen wie überbelichtet aus.
Das Bild mit dem Olympus UMPlanFl 50x/0.80 finde ich jetzt nicht gerade gut, ich bin nach wie vor der Meinung, dass diese hohe Apertur ohne Deckglas Korrektur nur breiige Bilder liefern kann.
Etwas OT
Zwischenzeitlich habe ich von Wolfgang ein Lomo 40x/0,75 Wasserimmersionsobjektiv bekommen und unter Wasser mal meinen Bernstein angesehen. Anfangs war das ganz gut, doch dann hat sich der Bernstein (Gesamtdicke 1,7 mm), den ich mit Tesaband am Boden der Petrischale festgeklebt hatte, gelöst. Da suche ich noch eine Lösung, ohne den Bernstein zu beschädigen.
LG Frank
Zitat von: Adalbert in Oktober 11, 2022, 17:00:45 NACHMITTAGS
ob man das so generell sagen kann?
Oder liegt das eher an der Tiefe des Präparates?
Hallo ADi,
es wurden ja so einige Beispiele genannt, die zum gleichen Ergenis kommen. Ich habe es selber auch probiert.
Aaaaber, sollte es nicht möglich sein mit einem elektronischen Filter eine Deckglaskorrektur nachträglich ins Bild einzuarbeiten???? Diese Frage könnte mal ein versierter Objektivhersteller beantworten, schließlich werden ja irgendwie die Daten (Linsen) für eine Deckglaskorrektur auch berechnet. Andererseits ist der Brechungsindex deutlich höher, als bei Luft, wo nix ist kann man nix berechnen????
Das meinte ich ja mit "das Rad neu erfinden". 8)
Die Stacktiefe wird da wohl ebenfalls eine weitere Begründung sein, warum es nur
mit Wasserimmersion geht, so tief ins Glas / Einbettmedium zu schauen.
Bin gespannt wie es mit den
3mm weiter geht.
LG Frank
Zitat von: Adalbert in Oktober 12, 2022, 12:58:59 NACHMITTAGS
welche Berechnungen meinst Du genau?
LG, ADi
Hallo ADi,
die Antwort ist im Prinzip die Berechnung eines kompletten Objektivs, bzw.
das Delta von Objektiven mit und ohne Deckglaskorrektur. Dieses Delta müsste dann eine Software auf das Bild berechnen. (das Rad neu erfinden, wie gesagt)
Bild 1 Aus Lichtmikroskopie der Uni Wien
Bei Olympus bin ich auf Broschüren von Objektiven gestoßen, die ggf. etwas Licht ins Dunkle bringen, bzw. die Zusammenhänge darstellen. Wobei dort verschieden Immersionen verglichen werden, also Deine Versiion Luft nicht dargestellt wird. Aber das Prinzip schätze ich ähnlich ein -- es kann kein sauberes klares Bild entstehen.
Bild 2 aus "Anwendungsspezifische Objektive"
Dann noch eine Animation zur variablen Deckglaskorrektur im Objektiv --> das wäre wohl ideal für diesen Zweck.
https://www.olympus-lifescience.com/de/microscope-resource/primer/java/aberrations/slipcorrection/
Vielleicht geht auch diese aufschraubbare Kappe, die gibt es in verschiedenen Versionen, da ist die Korrektur dann quasi nach außen gelegt, wenn ich es richtig einschätze.
https://wie-tec.de/Olympus-Mikroskop-Correction-Cap-P2-Objektiv-Deckglaskorrektur
Noch eine Frage zu Deinem letzten Bild, mit den beiden Schuppen. Findest Du das Bild mit dem 50x/0,80 scharf und aussagefähig?
LG Frank
Zitat von: Adalbert in Oktober 14, 2022, 20:01:41 NACHMITTAGS
Bei den Silicone Immersion Objectives,
würde sich um den Fall Focus at the sample's center handeln.
....
Dann habe ich noch die gleiche Stelle mit Auflicht (extra für Dich) belichtet aber es hat nicht viel gebracht :-(
LG, ADi
Hallo ADi,
oberhab der 3 verschiedenen Objektivklassen sind die Objekt-Kugeln (Resulting XZ, in grün dargestellt). Darum ging es mir, (und auch Olympus in der Werbung). Da wird dargestellt, das es Verzeichnungen gibt, so habe ich das verstanden. Nur beim Silicon nicht. Bei Luft, so wie bei Deinem Bild, würde ich die grüne Kugel als flache Scheibe einschätzen. Ist aber nur Spekulation.
Die Schuppen nochmal mit den 50x aufzunehmen brachte keine weiteren Details, da gebe ich Dir recht. Aber mit etwas geringerer Apertur ....?
Trotzdem danke das Du das nochmal "extra für mich" abgebildet hast.
Was wäre, wenn man einfach die Luft aus dem System herausnimmt?
Sehr durchsichtige Folie (dicke Folie vom Blumenhändler, o.ä.) ums Objektiv binden, ein paar Tropfen destilliertes Wasser auf das Deckglas und nochmal mit dem 50x/0,80 stacken. Damit kommst Du wahrscheinlich nicht tiefer, aber die beiden Schuppen sollten detaillierter werden. Natürlich auf eigene Gefahr, ist ja nicht unbedingt ein billiges Objektiv.
LG Frank