Liebe Mitglieder,
ich möchte das Gehirn einer Stubenfliege zeigen. Zur Anfärbung habe ich das von Ronald hier (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=6416.0 (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=6416.0)) beschriebene Protokoll verwendet. Dabei handelt es sich um eine Variante der Bielschowsky Färbung. Zur genauen Beschreibung der zu sehenden Strukturen bin ich aus Zeitmangel noch nicht gekommen weshalb ich vorerst nur die Bilder zeige. In nächster Zeit möchte ich noch als Vergleich eine Bodian Färbung ergänzen, hatte aber bis jetzt keine Zeit das Silberreagenz bei der Bodian Färbung über Nacht einwirken muss.
Die Fliege wurde zum Fixieren in für 24 Stunden AFA (dasselbe wie AFE nur mit Ameisensäure statt Essigsäure, AFE funktioniert sicherlich genauso gut, oder Formalin 4%). Zum besseren Eindringen des Fixans und der Entwässerung wurde der Kopf abgetrennt. Im Anschluss wurde entwässert und in Paraffin eingebettet.
Geschnitten wurde auf einem Rotationsmikrotom 5um und 10um dick. Bei den meisten Silberimprägnationen sollte die Schnittdicke ~8um betragen und nicht zu dünn sein. Die Schnitte wurden mit Glycerin-Eiweiß beschichteten OT aufgeklebt und anschließend entparaffiniert und in dest. Wasser hydriert und im Anschluss nach oben genannten Protokoll gefärbt. Ich habe die Schnitte aus Spargründen nicht in 20% Silbernitrat Lösung eingestellt, sondern die Schnitte in einer feuchten Kammer mit Silbernitrat 20% überschichtet. Mit 2,5 ml 20% Silbernitrat Lösung konnten so 3 Präparate hergestellt werden. nach den 3h wurde das Silbernitrat vorsichtig abpipettiert und dieselbe Lösung für die anschließende ammonialkalische Imprägnation herangezogen. Dadurch lässt sich einiges an Silbernitrat sparen. Auch die Goldlösung wurde durch Überschichten aufgebracht und im Anschluss abgegossen und separat gesammelt. Dadurch lässt sich die sehr teure Lösung sammeln und wieder aufbereiten.
Bei einem Präparat habe ich als Gegenfärbung eine Kernechtrot Färbung versucht. Theoretisch sollten fast alle Gegenfärbungen funktionieren, da das angelagerte Silber kaum mehr zu entfernen ist.
HINWEIS: die ammonialkalische Silbernitrat Lösung darf nicht aufbewahrt werden da sich beim Eintrocknen explosive Rückstände bilden können! (Man kann mit etwas Glucose-Lösung Zusatz einen schönen Silberspiegel gießen, oder man fällt das Silber mit Glucose einfach so aus und kann es dadurch auch rückgewinnen, oder man entsorgt es nach Reduktion gesammelt im Schwermetall Abfall da Silberionen für Wasserorganismen sehr giftig sind)
Diskussion/Probleme/Verbesserungen:
*) wie bei vielen Insektenschnitten neigen sie sehr stark dazu vom OT abzuschwimmen auch wenn man sehr vorsichtig mit ihnen umgeht. Ich habe versucht die Schnitte auf unimprägnierten OT zu Färben, es sind jedoch alle Schnitte schon beim hydrieren unbrauchbar geworden/abgeschwommen. Es sind auch Schnitte von den Glycerin-Eiweiß OT abgeschwommen. Am besten man legt mehrere Schnitte auf einen OT wodurch am Ende ein paar brauchbare übrig bleiben sollten. Vor allem dickere Schnitte sind fast immer abdiffundiert.
*) Leider entstehen Niederschläge am OT, hauptsächlich nach dem ersten Schritt (3h überschichtet in Silbernitrat). Das kann natürlich am Glycerin-Eiweiß liegen, oder an einer zu langen Überschichtung (3h sind lange, evtl. reicht 1h auch aus, in vielen Protokollen zur Bielschowsky Färbung liest man von 15 Minuten bei ca. 40°C).
*) Die Schnittdicke von 5um (wie auf den Bildern) ist bei Insekten anscheinend ausreichend. von den 10um Schnitten hat keiner am OT gehalten, die Anteile die übrig waren, waren fast schon zu dunkel. Vielleicht sind im Gegensatz zu Säugetieren 5um bei Insekten ohnehin die bessere Schnittdicke.
LG
Lieber Alf,
das ist Dir ganz hervorragend gelungen und ich bin Dir für Deinen Beitrag sehr dankbar. Die Silberimpregnierung steht seit langem auf meiner to do Liste, bisher habe ich mich noch nicht getraut und nun sehe ich, dass sie durchaus klappen kann. Wunderschön kommt die retinotope Anordnung in der Medulla zum Ausdruck: Ich bin begeistert und kann mir sehr gut vorstellen, wie kniffelig die Arbeit ist und vor allem auch, wie sauber man arbeiten muss, damit das Ergebnis so schön klar wird!
Viele Grüße
Jürgen
Hallo Alf,
erst einmal: grandiose Schnitte (5µm!), tolle Versilberung!
Zum Abschwimmen der Schnitte, trocknest du sie auf einer Wärmeplatte (40°)? Schon einmal Poly-L-Lysin (0,01%ige Lösung in Nacl oder PBS) probiert? Beides habe ich lange (beruflich) bei Cryoschnitten gemacht, die Schnitte wurden kurz fixiert und danach noch in heftigen Lösungen bei 42° über Stunden inkubiert/hybridisiert ohne abzuschwimmen.
Ja Eiweiß lässt sich mit Silbersalzen färben, sogar sehr gut (Eiweißelektrophoresegele selbst damit roütinemäßig gefärbt), um diesen "Hintergrund" nicht zu bekommen wäre Poly-L-Lysin evtl den Versuch wert (leider keine Erfahrungen damit bei Versilberungen, mein Silber kam durch Fotoemulsion auf die Schnitte, welche widerum von beta-Strahlern "belichtet" wurden ;))
Beste Grüße Stefan
Hallo,
vielen Dank!
ZitatDie Silberimpregnierung steht seit langem auf meiner to do Liste, bisher habe ich mich noch nicht getraut und nun sehe ich, dass sie durchaus klappen kann.
Solange die Präparate nicht abschwimmen ist das Protokoll sehr gut und die Versilberung gelingt überraschend problemlos! Nur beim zweiten mal Eintauchen in die Entwickler Lösung, nach dem ammonialkalischen Silber Reagenz kann variiert werden, die Reduktion läuft schnell ab und da könnte es zu dunkel ausfallen (hier könnte man zum Unterbrechen in eine 1% Ammoniak Lösung tauchen laut anderen Modifikationen der Färbung).
ZitatZum Abschwimmen der Schnitte, trocknest du sie auf einer Wärmeplatte (40°)? Schon einmal Poly-L-Lysin (0,01%ige Lösung in Nacl oder PBS) probiert?
Ja die Schnitte werden bei RT getrocknet für ca. 1 Stunde und dann nochmal bei ca. 55°C auf der Wärmplatte sodass das Paraffin glasig wird. Polylysin Lösung wäre vermutlich das beste, aber als Privatperson leider nicht erhältlich zu vernünftigen Preisen..
Als nächstes würde ich gerne eine Golgi Färbung versuchen und werde davon berichten.
LG,
Alf
Alf,
Schön, mal wieder etwas Histologisches zu lesen.
Ich finde, die Versilberung ist sehr schön geworden. Ich weiß selbst, wie schwierig es sein kann, die richtige Differenzierung zu finden, damit die Strukturen fein sichtbar sind. Meistens ist es entweder viel zu viel oder einfach zu wenig, und eine Wiederholung ist fast nie möglich, weil die Färbung so lange dauert.
Mach weiter so, Grüße aus die Niederlanden Ronald