Guten Abend geschätzte Runde,
Das Thema ist: Acridinorange bei einem Abstrich der Mundschleimhaut. Für Fluoreszenz mit Blauanregung. Verwendet wird ein ZEISS GFL mit aufgesetztem ZEISS Epi-Illuminator IV FL (46 63 01 – 9901). Filter: FT 510, LP 520. Lichtquelle: Ein umgebautes ZEISS Lampenhaus 60 mit einer 3 Watt LED.
Welche Konzentration der Farbstofflösung ist bitte angebracht? Teilweise schwanken die Angaben dazu, die man im Web oder auch Büchern findet, deutlich.
Wie sollte man also bitte die Lösung ansetzen? Wie ist das mit dem pH-Wert und dessen Auswirkung auf das Fluoreszenzverhalten?Was möchte ich? Die Epithelzellen mit (evtl.) etwas Strukturen erkennen. Ebenso Bakterien der Mundhöhle. Im Idealfall mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarben
Kremer (,,Das große Kosmos-Buch der Mikroskopie") beschreibt eine recht einfache Rezeptur: 0,1 g Acridinorange in 500 ml Leitungswasser. In der Folge wird kurz beschrieben, dass man den Ausstrich weder trocknen lassen, noch eine Fixierung durchführen soll.
Meine bisherigen Ergebnisse sind meiner Meinung nach nicht so, wie sie sein sollten. Wenig Unterschiede der Farben z. B.
Wie könnte man dies bitte besser machen?
Die Bildbeispiele:
Die (alle Beispiele wurden mit einem LOMO 40 × Planapochromat erstellt) gelblich erscheinenden Bilder zeigen Ergebnisse (in verschiedenen Stufen der Bildbearbeitung), bei denen Acridinorange nach Kremers Anleitung verwendet wurde. Allerdings mit einer vorangegangenen (2 Minuten) Methanol-Fixierung. Ich habe es auch mit einem Frischpräparat (nach der Anleitung Kremers) versucht. Das zeigt verschiedene Fluoreszenzfärbungen. Soweit ja gut, nur: das Präparat trocknet innerhalb von Minuten ein und erscheint dann einheitlich blassgelb und wird unansehnlich/unbrauchbar ...
Niedriger pH einer Färbelösung, Variante:
Das grünlich erscheinende Bildbeispiel wurde nach einer Färbung gemäß (siehe unten) fotografiert. Abgesehen von der Zugabe von Essigsäure ist vielleicht erwähnenswert, dass der pH-Wert des destillierten Wassers schon etwas angesäuert war (6,35).
Die Rezeptur dazu: (aus https://tinyurl.com/yscahmzw (https://tinyurl.com/yscahmzw) )
ZitatPreparation of reagent: 50 mg acridine orange is dissolved in 10 ml of distilled water to prepare a stock solution and stored in the refrigerator.1 ml of acridine orange stock solution and 0.5 ml of glacial acetic acid is added to 50 ml of distilled water to prepare a working solution.
Deutsch:
ZitatReagenzaufbereitung: 50 mg Acridinorange werden in 10 ml destilliertem Wasser gelöst, um eine Stammlösung herzustellen und im Kühlschrank aufzubewahren. 1 ml der Acridinorange-Stammlösung und 0,5 ml Eisessig werden zu 50 ml destilliertem Wasser hinzugefügt, um eine Arbeitslösung herzustellen.
Da die Aufnahmen auch bei exakter Fokussierung unscharf wirken, habe ich ein klein wenig die Bildbearbeitungshinweise von Dr. Robert Berdan ( https://www.canadiannaturephotographer.com/epifluorescencemicroscopy.html (https://www.canadiannaturephotographer.com/epifluorescencemicroscopy.html) ) nachempfunden. Teilweise, denn seine Ergebnisse wirken auf mich manchmal zu überschärft. Wobei dies natürlich auch Geschmackssache ist.
Was ist bitte Eure Meinung dazu?Ich würde mich wirklich über Tipps, Hinweise, Meinungen und auch Kritik von Euch freuen!
Liebe Grüße
Jakob
Hallo Jakob,
Ich würde die Probe immer fixieren. Eine einfache Hitzefixierung reicht dabei völlig.
Die angegebenen Farbstoffkonzentrationen sind recht hoch. Die Lösung 0,1 g auf 500 Wasser ist an der oberen Grenze für fixierte Proben. Für die Lebendfärbung von Einzellern müsste mindestens um den Faktor 100 verdünnt werden. Acridinorange wirkt auf Einzeller extrem toxisch.
Zum Einfluss des PH-Wertes auf die Färbung habe ich schon einmal Bilder eingestellt:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=45777.msg337604#msg337604
Wie Du sieht, erhält man bei PH 7 das attraktivste Ergebnis. Zellen hellgrün, Zellkerne dunkelgrün, Bakterien orange bis rot.
Bei PH 13 sind die Zellen unnatürlich verformt da sollte man wohl nicht höher gehen als PH 10, bei PH 4 nimmt der Farbkontrast ab und die Zellen selbst werden nicht mehr gefärbt, nur die Zellkerne und Bakterien.
Was ich dazusagen sollte: Ich verwende nicht das Zinksalz sondern das Hydrochlorid. Das dürfte aber nicht so viel Unterschied machen. Außerdem verwende ich extrem lichtstarke Immersionsobjektive. Das macht einen großen Unterschied.
Viele Grüße
Alexander
Zitat von: Aljoscha in Juli 25, 2023, 10:24:34 VORMITTAG
Hallo Jakob,
Ich würde die Probe immer fixieren. Eine einfache Hitzefixierung reicht dabei völlig.
Die angegebenen Farbstoffkonzentrationen sind recht hoch. Die Lösung 0,1 g auf 500 Wasser ist an der oberen Grenze für fixierte Proben. Für die Lebendfärbung von Einzellern müsste mindestens um den Faktor 100 verdünnt werden. Acridinorange wirkt auf Einzeller extrem toxisch.
Zum Einfluss des PH-Wertes auf die Färbung habe ich schon einmal Bilder eingestellt:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=45777.msg337604#msg337604
Wie Du sieht, erhält man bei PH 7 das attraktivste Ergebnis. Zellen hellgrün, Zellkerne dunkelgrün, Bakterien orange bis rot.
Bei PH 13 sind die Zellen unnatürlich verformt da sollte man wohl nicht höher gehen als PH 10, bei PH 4 nimmt der Farbkontrast ab und die Zellen selbst werden nicht mehr gefärbt, nur die Zellkerne und Bakterien.
Was ich dazusagen sollte: Ich verwende nicht das Zinksalz sondern das Hydrochlorid. Das dürfte aber nicht so viel Unterschied machen. Außerdem verwende ich extrem lichtstarke Immersionsobjektive. Das macht einen großen Unterschied.
Viele Grüße
Alexander
Hallo Alexander, hallo liebe Runde,
ein herzliches Dankeschön für Deine Tipps bzw. Links. Das hat mir zweifellos geholfen. Gut war auch der Hinweis, dass eine einfache Hitzefixierung hinreichend ist. Bei Bakterien-Ausstrichen ist es ja üblich; dass allerdings die dünnen Plattenepithelzellen mit ihrer zarten Membran dies aushalten, hat mich fast schon gewundert. Immerhin bekommen sie fast immer Falten und/oder falten sich teilweise beim Ausstreichen.
Ich hab das Kremersche Rezept auf das Doppelte verdünnt, damit konnte ich zumindest rötliche, orangefarbene und grüne Färbungen erreichen. Bakterien konnte ich nur einmal erkennen. Aber das wird schon. An der Färbedauer muss ich auch noch etwas ändern. 5 oder 6 Minute ist wohl zu lange.
Was ich unbedingt machen sollte, ist den pH-Wert exakt einzustellen, sonst bleibt es bei Zufallsergebnissen. Ich werde mir zuerst mal Phosphatpufferlösungen herstellen, damit wird die Angelegenheit kontrollierter.
Mit stärker verdünntem Acridinorange konnte ich relativ fein abgestufte Bänderungen erkennen. Dabei ist es mir nicht klar, was hier unterschiedlich hell erscheint. Zufällig durch Falten in der Membran abgegrenzte Bereiche oder vielleicht doch Filamentstrukturen in den Zellen.
Übrigens brauche ich manchmal (3 Watt LED) mehrere Minuten Belichtungszeit. Das zieht sich ganz schön. Drehe ich die Empfindlichkeit (eigentlich ist es ja nur eine Verstärkung) hoch, schrumpft der Dynamikumfang sehr schnell. Und: sehr starkes Rauschen tritt auf. Dies kann man beherrschen, aber nur mit Einbußen der Bildqualität.
Den viel, viel helleren HBO-Brenner mag ich am ZEISS GFL nicht so gerne einsetzen, da merkwürdigerweise die Fixierung des Epi-Illuminators nur leicht wackelig möglich ist. Mit dem schwereren Lampenhaus (50 Watt) ist mir das zu gefährlich.
Vielleicht lässt sich das mit Papierstreifen am Schwalbenschwanz pfuschend :) ;) beheben. Sonst nehme ich ein anderes STANDARD. Leider braucht das 14er eine Wartung (der Feintrieb ,,spinnt" ...), bliebe noch ein KF2, ein Junior und ein chin. STANDARD-Nachbau.
Schwierige Wahl ... ;D ;D ;D ;)
Danke nochmals, liebe Grüße
Jakob