Mikro-Forum

Hallo zusammen,

Es ist vielleicht nur eine Spinnerei. Aber ist es möglich einen Querschnitt durch einen Bilderstapel zu machen? Bei Piccolay und ähnlichen Programmen liegen ja die Bildinformationen im Speicher vor. Es müsste so etwas wie eine "Punktwolke" sein. Es müsste eigentlich mathematisch; wie auch immer das aussehen mag; möglich sein, einen Querschnitt aus einer bestimmten Bild(zeile?) zu generieren.
Diese würde dann den Querschnitt einer Diatomee zeigen. In etwa so wie bei CT Bildern die man ja auch aus jeder Richtung durchfahren kann.

Es kann natürlich seine, das die Überlegung, völlig daneben ist oder ich dabei ein Denkfehler habe.

Hier ist ein Beispiel zur Veranschaulichung, wie ich es meine.

Querschnitt-Bilderstapel.jpg


Gruss
Michael

Zitat von: Michael K. in März 06, 2024, 13:18:24 NACHMITTAGSIn etwa so wie bei CT Bildern die man ja auch aus jeder Richtung durchfahren kann.

Hallo Michael,

Sicher wird es irgendwo so eine Software geben, hätte ich auch gerne. Die CT-Bildersoftware kann das ja recht einfach. 
https://www.swr.de/wissen/neue-wespenart-entdeckt-artenvielfalt-100.html
Das Video ist sehr interessant.

Eine einzelne Ansicht eines Schnittes von Deinem Beispiel könnte ich mir so vorstellen:
Du Schneidest bei allen Bildern den betreffenden Bereich aus, löscht also Schichtweise  Bildinformationen aus den Einzelbildern weg. (Geht sehr gut mit XnView MP)
Dann stackt man und generiert die 3D Ansicht, die man dann ansehen kann.

Du kannst ja auch, zumindest theoretisch, die Diatome hochkant stellen und dann von oben nach unten "Scannen".  Oder wie in Deinem Bild von links nach rechts. 
Das könnte leidlich für eine einzelne Ansicht jeweils funktionieren.

Mit z.B. Helicon Fokus kann man dann einfach den Bereich des Stapels auswählen, den man scharf abgebildet haben möchte. Oder macht Teilstacks mit entsprechenden Teilansichten in 3D.

LG Frank

PS: Ich probiere mal

Hi Michael,

bei der ganzen Idee gibt es ein massives Problem: jeder einzelne Punkt, der innerhalb einer Fokus-Ebene (X/Y) scharf aussieht, hat in Z-Richtung eine deutlich geringere Auflösung und wird durch die "Point Spread Function (PSF)" in darüber-/darunterliegenden Fokusebenen massiv verschmiert eingestreut, ich habe mich während meines Studiums damit etwas näher in Hinblick auf Diatomeen beschäftigt.
Für Fluoreszenzaufnahmen ist das Rückrechnen des Einflusses der PSF (,,Deconvolution") ein übliches Verfahren, dafür wird z.B. Software wie Huygens eingesetzt, und auch die großen Mikroskop-Hersteller haben das alle gegen genügend Bargeld im Angebot, weil sich damit die tatsächliche Auflösung nochmal deutlich verbessern lässt. Für das Hellfeld ist die Sache aber leider deutlich komplizierter bis unmöglich, nach meinem eingerosteten Wissensstand ist das Ausmessen der Hellfeld-PSF nicht möglich, und die Anwendung des Deconvolution bestenfalls zweifelhaft, und zu ähnlich hoher Auflösung in der Tiefe wie innerhalb der Fokusebene führt das auch nicht.
Falls du Bilder sehen willst (meine sind in irgendwelchen alten Backups verschollen), dann schau mal hier https://epic.awi.de/id/eprint/37468/2/MSc-MKloster-2013.pdf (https://epic.awi.de/id/eprint/37468/2/MSc-MKloster-2013.pdf) auf Seite 73 (PDF Seite 80) folgende, besonders Seite 77/79(84/86).

Falls du das selbst einmal ausprobieren willst, kannst du den Bildstapel einfach im ImageJ laden und dann "orthogonal views" erstellen, siehe https://imagej.net/imaging/z-functions (https://imagej.net/imaging/z-functions).

Viele Grüße,
noch so'n Michael

Hallo,
 kurze Frage ob jemand im Hellfeld Erfahrungen mit DeconvolutionLab2 (http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/) hat? Läuft u.a. auf ImageJ oder Fiji.
Beste Grüße Stefan

Hallo Michael (Noch so´n Michael),

danke für Deine Masterarbeit, sehr interessant. Wenn auch für mich nicht wirklich alles verständlich, da fehlt mir noch "etwas" Grundwissen.  :D

Wir haben ja mit Picolay eine freie Software, die auch diese "Rocking"-Funktion anbietet. Man also auch verschiedene Parameter mitgeben kann um die max. Informationen in einem "Wackelbild" zu erhalten. Bei Anwendern habe ich schon super Ergebnisse gesehen, die m.M.n. einigen Mehrwert an Informationsgehalt bieten. Allerdings liegt ja hier der Focus anders.

Michael K.

ich habe mit meinen Mitteln (geringe NA, (noch) kein schiefes Licht am Keyence) einige Versuche gemacht.
1. bestätigt die geringe Auflösung in Z-Achse.
2. Bei meinen Diatomen-Fertigpräparaten fabriziert mein Mikroskop recht merkwürdige Erhebungen z.B. in der Mitte. Da sind trotz der eigentlichen Transparenz praktisch keine sinnvollen Strukturen mehr erkennbar.
3. Da wo auch die Außenkontur einigermaßen gut herausgearbeitet werden kann, ist eine gewisse Innenkontur erkennbar. Bei mir aber nur der Verlauf der Kontur, keine Schichtdicke der Wandungen. Das mag an der zu geringen Auflösung oder am Prinzip liegen.
4. Das Keyence hat auch eine 3D Funktion, bei der man sich von vorne nach hinten durchscrollen kann. Das hinter dem Betrachter befindliche Teil wird dabei ausgeblendet. Das kommt glaube ich Deinem Ansinnen etwas näher. Aber wie gesagt, nur eine Kontur.
5. Auch mit Helicon ging nicht mehr.

LG Frank

Übersichtsbild, die obere Diatome liegt auf der zweiten, kleinen Diatome
1500Px 2024-03-06 17-35-47 (B,Radius8,Smoothing4)720240306_162359 bearbeitet.jpg

Versuch den Querschnitt aus zuvor erstellter 3D Ansicht herauszubekommen. Kontur geht, aber keine echte Wanddicke. Die hellblaue oben rechts zeigt den betrachteten Ausschnitt, dieser ist völlig variabel. Unten wird die Kontur als Linienverlauf über die Breite dargestellt.
Querschnitt Stack Keyence 20240306_163016 2000Px.jpg

Aus der Übersicht habe ich vor dem Stacken die Einzelbilder beschnitten (nur noch überlappenden Bereich), erst anschließend neu gestackt. 
Die Idee war das ggf. die abgeschnittenen Informationen nicht mehr beim Stacken stören können.
Das Bild war schon recht klein und breiig, ich habe es etwas vergrößert, damit man es hier besser darstellen kann.
500Px vergrößert Beschnitt für Ansicht von links, bearbeitet.jpg

Zum Schluss kommt noch die 3D Darstellungen von Helicon. Auch hier ist nicht viel sehenswertes rausgekommen. 
Ansicht des Schnittes von links 3D.jpg

Soweit meine bescheidenen Versuche.

LG Frank

Hallo,

man sollte nicht vergessen dass im Gegensatz zu Objekten mit absorbierender (also sozusagen "dichter") Oberfläche wie z.B. bei Insekten, bei Phasenobjekten das Stacken nicht automatisch zu echten Tiefeninformationen führt. Das Programm selektiert ja nur die "seiner Meinung nach" schärfsten Bildbereiche der jeweiligen Ebenen. Durch Interferenzeffekte können gerade bei Diatomeen scheinbare Strukturen hervorgehoben werden, die nicht existieren, und dadurch auch falsche Tiefeninformationen erzeugt werden.

Hubert

Hallo zusammen,


Ihr habt natürlich Recht. Da fehlt mir in der Tat Hintergrundwissen wie Stapelbilddaten verarbeitet werden.
Ich hatte die Überlegungs angestellt weil bei Piccolay jedes scharfe Pixel "eingesammelt" wird. Und aus diesen Daten dachte ich halt müsste es möglich sein ein Querschnitt zu errechnen.
Aber das herausrechnen der Wanddicke dürfte in der Tat kaum möglich sein.
Da steckt mehr dahinter als ich vermutet habe. 


Gruss
Michael

Vielen Dank für dieses Zitat!

Zitat von: Lupus in März 06, 2024, 21:18:17 NACHMITTAGSHallo,

man sollte nicht vergessen dass im Gegensatz zu Objekten mit absorbierender (also sozusagen "dichter") Oberfläche wie z.B. bei Insekten, bei Phasenobjekten das Stacken nicht automatisch zu echten Tiefeninformationen führt. Das Programm selektiert ja nur die "seiner Meinung nach" schärfsten Bildbereiche der jeweiligen Ebenen. Durch Interferenzeffekte können gerade bei Diatomeen scheinbare Strukturen hervorgehoben werden, die nicht existieren, und dadurch auch falsche Tiefeninformationen erzeugt werden.

Hubert

In der Tat habe ich in den letzten 15 Jahren etliche male versucht, dies Stacking-Fans klarzumachen. Oft mit nur wenig Erfolg, weil die meist großartige Ästhetik der Darstellung alle technisch begründeten Zweifel bequem aus dem Weg zu räumen scheint. Bitte verzeiht mir, wenn ich an dieser Stelle diesbezüglich nochmal etwas Frust ablade.

Eine fokusbasierte Tiefenkarte ist nunmal keine echte Vermessung der Objektoberfläche und funktioniert selbst im Idealfall (von dem Diatomeen meilenweit entfernt sind) oft nur dank massiver Glättung der Ergebnisse. Das ist auch bei dem superteuren Auflicht-Messmikroskop eines bekannten Herstellers, das hier im Nachbarlabor steht, nicht anders, sobald statt technischer Objekte wie Frässtücken oder Leiterplatten biologische Objekte mit sehr ausgeprägten 3D-Strukturen und komplizierten (oder sehr einfachen) Texturen eingescannt werden. Deren Ergebnisse können in 2,5D mit drübergelegter Textur zwar sehr schön aussehen und überzeugend wirken, dies sagt aber leider nichts über die Qualität der Vermessung aus.

Beste Grüße,
noch so'n Michael

Hallo zusammen,

Ja dann brauch ich da gar nicht weiter drüber nach denke  ;)  War ja auch nur eine Überlegung nichts weiter.


Gruss
Michael

Zitat von: Noch so'n Michael in März 07, 2024, 12:25:32 NACHMITTAGSEine fokusbasierte Tiefenkarte ist nunmal keine echte Vermessung der Objektoberfläche

Hallo Michael,

basieren Deine umfassenden Erkenntnisse auch auf lose liegenden Diatomeen, ohne Deckglas, so wie Michael K. gerne mal tolle Bilder hier zeigt? 

Wenn ich mir in einem Dauerpräparat mit Deckglas eine zerbrochene Diatomeen in 30° Schräge ansehe, also die Bruchstelle, bekomme ich kein scharfes Bild hin. 

Wenn ich mir aber ohne Deckglas eine lose, fast transparente Struktur ansehe (z.B. Radiolarie) und ich in eine seitliche Ansicht wechsle, kann ich sehr viel sicherer auf die Strukturen im Inneren und natürlich recht sicher Strukturen außen sehen und auch Messungen durchführen. Letztendlich kann ich natürlich nicht 100% beweisen, ob die Messungen richtig sind.

LF Frank

Hallo Frank,

Zitat von: Nochnmikroskop in März 07, 2024, 19:01:50 NACHMITTAGS

Zitat von: Noch so'n Michael in März 07, 2024, 12:25:32 NACHMITTAGSEine fokusbasierte Tiefenkarte ist nunmal keine echte Vermessung der Objektoberfläche

Hallo Michael,

Wenn ich mir in einem Dauerpräparat mit Deckglas eine zerbrochene Diatomeen in 30° Schräge ansehe, also die Bruchstelle, bekomme ich kein scharfes Bild hin.

Wenn ich mir aber ohne Deckglas eine lose, fast transparente Struktur ansehe (z.B. Radiolarie) und ich in eine seitliche Ansicht wechsle, kann ich sehr viel sicherer auf die Strukturen im Inneren und natürlich recht sicher Strukturen außen sehen und auch Messungen durchführen. Letztendlich kann ich natürlich nicht 100% beweisen, ob die Messungen richtig sind.

nein, loses Material schaue ich mir höchstens mit dem Bino an, normalerweise ist bei mir alles in hochbrechende Eindeckmedien verpackt und unter Öl-Immersion, das macht aber für das zugrundelegende Problem keinen Unterschied, denn mit dem Blickwinkel hat das nichts zu tun. Natürlich wird es, je weiter du "von der Seite" ins Präparat schaust, zunehmend schwierig, das Material innerhalb des Arbeitsabstandes vor dem Objektiv zu positionieren, und auch die Schichtdicken von Deckglas, Objekt und Objektiv, durch die das Licht durchmuss, entfernen sich immer weiter von dem, wofür das Optik berechnet wurde. Aber die Ursache für die Unzuverlässigkeit von Tiefenkarten aus Fokus-Stacking ist eine ganz andere:

Nur mal ein kleines Gedankenexperiment: Du hast einen schönen kleinen Glaswürfel im Mikroformat, d.h. Material mit nahezu denselben optischen Eigenschaften wie Diatomeen, keine Oberflächenstrukturen (wie bei Diatomeen in hyalinen Bereichen) aber klaren Objektkanten (die Seiten des Würfels). Wenn du nun direkt von oben auf den Würfel auf die Oberseite des Würfels fokussierst, dann kannst du die vier Kanten ringsherum sauber sehen. Ob du tatsächlich exakt die Oberfläche des Würfels erwischt hast, oder ein paar Fokusebenen darunter oder darüber liegst, wirst du nicht sehen können, denn im Innenbereich des Würfels gibt es keine Strukturen, an denen du das festmachen könntest. Also die Tiefenkarte in unserem Beispiel nur entlang der Seitenflächen des Würfels funktionieren, nicht für die Ober- oder Unterseite.

Wie gesagt, dies nur als sehr idealisiertes Gedankenexperiment, natürliche Objekte weisen normalerweise reichlich Struktur / Textur auf. Bei Diatomeen kommen diese normalerweise in sehr unterschiedlichen Größen und in erstaunlich dreidimensionalen Strukturen vor, d.h. du hast eine große Pore, verschlossen mit einer Membran die wiederum von dutzenden/hunderten Poren durchbohrt ist, die wiederum eine Membran mit Poren haben können, und das in mehreren Schichten übereinander. Im Lichmikroskop ist vieles davon nicht direkt sichtbar, hab aber trotzem Auswirkungen auf das beobachtete Bild: Es gibt Lichbrechungseffekte durch die Objektgeometrie (d.h. unterschiedliche Weglängen, die das Licht durch das Objekt zurücklegen muss) und das Material (amorphes Silikat, sehr ähnlich wie Glas), d.h. du hat etliche "Linseneffekte". Obendrauf kommen dann noch die Beugungseffekte durch die sehr kleinen Strukturen (< Beugungslimit), die weitere Linseneffekte verursachen. Diese können Licht projizieren relativ weit weg von den Strukturen, die sie verursachen, bzw. können Strukturen vortäuschen, die physikalisch gar nicht da sind. Vergleiche mal Bilder von Diatomeen im Licht- und im Elektronenmikroskop (z.B. https://epic.awi.de/id/eprint/37468/2/MSc-MKloster-2013.pdf78 (https://epic.awi.de/id/eprint/37468/2/MSc-MKloster-2013.pdf78) Abbildung 9), und du wirst sehen, dass viele der sogar in der Bestimmungsliteratur als "typisch" beschriebenen Strukturen im der elektronenmikroskopischen Aufnahme sehr deutlich anders aussehen. Z.B. werden oft deutlich strichförmige Striea beschrieben, die in Wirklichkeit eine oder sogar mehrere Reihen feiner Poren sind.

Schau mal unter https://epic.awi.de/id/eprint/37468/2/MSc-MKloster-2013.pdf (https://epic.awi.de/id/eprint/37468/2/MSc-MKloster-2013.pdf) auf Seite 78 (85 nach Zählung des PDFs) auf Abbildung 55c. Das ist eine 2,5D-Visualisierung eines extrem hochwertig aufgenommenen Fokus-Stacks (hochpräziser elektronischer Z-Trieb), trotzdem sieht die Valve im Innenbereich ziemlich eingedellt aus, was sie aber definitiv nicht ist.

Was normalweise passiert, wenn solche Artefakte auftauchen, ist, dass jemand anfängt, an den vielen, vielen Parametern für das Fokus-Stacking (bei einigen Programmen können das ein Dutzend oder so sein) solange herumzuschrauben, bis ein Ergebnis herauskommt, das "besser aussieht. Hier lässt sich durchaus einiges optimieren, aber optimiert wird nur fürs Auge auf Basis der Wunschvorstellung des Betrachters, die hierbei ermittelte Tiefenkarte basiert aber genauso viel oder wenig auf der echten Objektgeometrie, wie die eindeutig falsche aus dem ersten Versuch.

Eine kleine Anmerkung noch: der Unterschied der Brechungsindizes zwischen Diatomeen- / Radiolarien-Silikat und Luft ist höher als im Vergleich mit den meisten Eindeckmedien. Dieser Unterschied ist es, was du um Mikroskop siehst, da das biogene Silikat ja ein Phasenobjekt ohne eigene Färbung ist. Bei nicht-eingedecktem Material ist daher der Kontrast stärker, d.h. du siehst mehr, was den von dir beschriebenen Effekt erklärt. Allerdings bezahlst du das mit einer dramatisch schlechteren Auflösung, was bei Diatomeen heißt, dass die ein Großteil der Valvenornamentierung verloren geht (diese kann ja, wie oben schon angesprochen, selbst mit extrem hoher NA unter Ölimmersion im Lichtmikroskop zum Teil nicht aufgelöst werden). Was der Grund ist für die vielen, vielen Anfragen hier im Forum nach Pleurax, Naphrax und anderen Eindeckmedien mit hohem Brechungsindex (>1,7), weil nur diese die Betrachtung von Diatomeen in einer Kombination von hohem Kontrast und hoher Auflösung ermöglichen.

Sorry, wenn ich in den Dozenten-Modus gesprungen bin, aber ich führe Diskussionen zum Thema Fokus-Stacking seit einem Dutzend Jahren sehr regelmäßig innerhalb der Forschungs-Community, allerdings aus der Richtung, dass ich eine Lanze zu brechen versuche FÜR Fokus-Stacking bei Diatomeen, womit sich professionelle Diatomologen aber häufig nicht sehr wohl fühlen.

Viele Grüße,
noch so'n Michael

Hallo Michaels und andere Interessierte,
hab neulich eine Publikation überflogen in der das lichtmikroskopische Bild durch Parameter mit Hilfe von artificial intelligence optimiert wird, welche wiederum von EM-Bildern lernt.  ;) Nur soviel zu den optimalen Parametern durch den lichtmikroskopischen Betrachter.
Man kann und sollte das landläufige Stacking  wohl hauptsächlich unter ästhetischen Gesichtspunkten sehen. Zur Differentialdiagnose des Diatomisten eignen sich eher die klassischen Hellfeldbilder, auch weil diese mit alten Abbildungen und Zeichnungen besser verglichen werden können.
Beste Grüße Stefan

Hallo noch so'n Michael,

vielen Dank für Deine Expertise und Deine tollen Erklärungen!!!

Die Auflösungsunterschiede der unterschiedlichen Verfahren sind mir geläufig und klar.

Bei meinen niederaperturigen Mikroskop von Keyence (Auflösung max. 1800 LP/mm) habe ich einen permanenten Arbeitsabstand von 15 mm, daher kann man leicht von der Seite betrachten, ohne an die für Immersion gesetzten Grenzen zu stoßen.

Interessant ist auch Dein Hinweis auf die unterschiedlichen Brechungsindizes der durchsichtigen Eindeckmedien / Objekte. Deshalb versucht man ja mit DIC (Dunkelheit ins Licht zu bringen  ;D ) sprich Kontaste zu erzeugen. Das fällt doch, so habe ich das verstanden, bei eingedeckten Objekten schwerer, als bei losen. Daraus leite ich ab, das man sich nicht immer sicher sein kann was man sieht.
Wenn dann noch unterschiedliche Eindeckmedien verwendet werden, ist der mögliche Einfluss doch auch nicht bekannt, ggf. von Medium zu Medium nicht unerheblich?

Es gibt leider wohl keine Möglichkeit eine Diatomee erst Lichtmikroskopisch optimal abzulichten (3D Stacken, Stitchen, ohne DIC, mit DIC, etc.), und dann anschließend das selbe Objekt im REM nochmals abzulichten, also dass man das 1 zu 1 vergleichen könnte.
Den umgekehrten Weg hat man hier schon gezeigt, aber dann ich die Diatomee ja schon besputtert worden.

Gelten die Einschränkungen eigentlich auch für Laserscanning- Mikroskope, also dass Strukturen in Z-Achse nicht sicher, zuverlässig, reproduzierbar auflösbar sind?

LG Frank

Hallo,

ZitatWas normalweise passiert, wenn solche Artefakte auftauchen, ist, dass jemand anfängt, an den vielen, vielen Parametern für das Fokus-Stacking (bei einigen Programmen können das ein Dutzend oder so sein) solange herumzuschrauben, bis ein Ergebnis herauskommt, das "besser aussieht. Hier lässt sich durchaus einiges optimieren, aber optimiert wird nur fürs Auge auf Basis der Wunschvorstellung des Betrachters, die hierbei ermittelte Tiefenkarte basiert aber genauso viel oder wenig auf der echten Objektgeometrie, wie die eindeutig falsche aus dem ersten Versuch.

da zitiere ich wieder gerne Ernst Abbe wörtlich (1873)

Zitat"Alle diejenigen Erscheinungen im mikroskopischen Bild, welche nicht schon mit dem blossen Absorptionsbilde gegeben sind, sondern der Mitwirkung der durch Beugung entstandenen Strahlengruppen bedürfen, d.h. alle Anzeigen von Structurdetail, liefern im Allgemeinen keine der wirklichen Beschaffenheit der Objecte conforme, d.h. geometrisch ähnliche, Abbildung. Wie constant, markirt und scheinbar körperlich derartige Anzeigen (Streifensysteme, Felderzeichnungen und dergl.) im Mikroskop auch auftreten mögen, so dürfen sie doch nicht morphologisch, d.h. als Bilder körperlicher Formen, sondern nur physikalisch, d.h. als Merkmale - nicht als Abbilder – gewisser materieller Verschiedenheiten in oder an den betreffenden Theilen gedeutet werden; und zwar kann aus dem mikroskopischen Befund mit Sicherheit auf Nichts weiter geschlossen werden, als auf das Vorhandensein solcher Structurbedingungen, als zur Erzeugung des die Abbildung vermittelnden Beugungsphänomens nothwendig und hinreichend sind.
... Von diesem Standpunkte aus erscheinen u.A. alle Versuche, den Bau der feineren Diatomeenschalen durch morphologische Deutung ihrer mikroskopischen Bilder festzustellen, als auf unzulässige Prämissen gegründet. Ob z.B. Pleur. angulatum zwei oder drei Streifensysteme besitze; ob überhaupt wirkliche Streifung vorliege, oder ob die sichtbaren Zeichnungen von isolirten Erhöhungen, oder von isolirten Vertiefungen herrühren u. Dergl., darüber kann kein noch so vollkommenes Mikroskop und keine noch so hohe Vergrößerung Aufschluss geben."

ZitatWas der Grund ist für die vielen, vielen Anfragen hier im Forum nach Pleurax, Naphrax und anderen Eindeckmedien mit hohem Brechungsindex (>1,7), weil nur diese die Betrachtung von Diatomeen in einer Kombination von hohem Kontrast und hoher Auflösung ermöglichen.

Nur muss man hier auch vorsichtig sein, denn wenn aufgrund des hohen Brechungsindexunterschiedes die gesamte Phasenverschiebung durch dickere Objektstrukturen "zu hoch" ist, entstehen mehr Artefakte als Vorteile.

ZitatDeshalb versucht man ja mit DIC (Dunkelheit ins Licht zu bringen  ;D ) sprich Kontaste zu erzeugen.

Da würde ich aber nur bei sehr kontrastarmen Feinstrukturen noch einen Vorteil sehen, allgemein führen gestackte DIC-Aufnahmen zu einer deutlichen Verfälschung von Strukturen. Das liegt an der Art der (nicht objektgetreuen) Objektdarstellung des differentiellen Phasenkontrastes.

Hubert

Hallo Frank,

Zitat von: Nochnmikroskop in März 08, 2024, 10:39:32 VORMITTAGGelten die Einschränkungen eigentlich auch für Laserscanning- Mikroskope, also dass Strukturen in Z-Achse nicht sicher, zuverlässig, reproduzierbar auflösbar sind?

nein, wenn du mit "Laserscanning" Konfokal-Mikroskopie meinst, sieht die Geschichte deutlich anders aus. Hierbei wird das "Out-of-focus" Licht sowohl bei der Anregung als auch bei der Emmission durch die Pinholes weitestgehend ausgeblendet, was eine deutlich höhere Tiefenauflösung ermöglicht (theoretisch so klein wie der Fleck Anregungslicht, den du ins Präparat projizieren kannst, denn nur dort kann ja Emission stattfinden). Was die Pinholes nicht schaffen, lässt sich durch Deconvolution rausrechnen, dafür braucht man Wissen über die Point Spread Funktion. Diese lässt sich konfokal in Fluoreszenz relativ einfach ausmessen oder ist schon seitens des Optik-Herstellers bekannt. Das funktioniert aber nur mit fluoreszenz-gelabelten Strukturen. Ein ehemaliger Kollege macht das regelmäßig mit Diatomeen, um daraus 3D-Modelle zu generieren, das steht bei mir ziemlich weit oben auf der "würde ich sooo gerne mal selber machen" Liste 8)

Beste Grüße,
noch so'n Michael

Zitat von: Noch so'n Michael in März 08, 2024, 11:51:39 VORMITTAGnein, wenn du mit "Laserscanning" Konfokal-Mikroskopie meinst,
...
Ein ehemaliger Kollege macht das regelmäßig mit Diatomeen, um daraus 3D-Modelle zu generieren, das steht bei mir ziemlich weit oben auf der "würde ich sooo gerne mal selber machen" Liste 8)

Beste Grüße,
noch so'n Michael

Hallo Michael,

Keyence und Olympus sprechen von Laserscanning Mikroskopen, ist aber wohl nur ein anderer Ausdruck für das Gleiche Prinzip.

So eine Keyence Vorführung habe ich mal hier zuhause gehabt, allerdings recht kurz, war auf dem Rückweg eines Kunden. Das war schon spannend. Ich hatte aber keine eingedeckten Muster vorführen lassen, nur Schmetterlinge etc.
Übrigens sind die Leute sehr gerne bereit mal Ihre Produkte privat zu präsentieren - nur zu.
Aber das vorgestellte System VK-X3000 kostet leicht 100KEuro, ohne Verhandlung.

Mir fehlt der nötige ... Platz  ;D . Ein System reicht auch. 

LG Frank

Hi Frank,

ein Keyence VHX-5000 steht hier im Labor nebenan 8) und zur Not würde ich an deiner Stelle für sowas Leckeres zuhause einfach Platz schaffen ;)

Aber wir reden hier über ganz andere Größenordnungen, was die Auflösung anbelangt, selbst mit dem hochvergrößernden Objektivkopf ist das Keyence wohl nur sehr eingeschränkt für Diatomeen geeignet. Ich scanne hier fürs Alltagsgeschäft Diatomeen mit 0,09 µm/Pixel bei einer NA von 1.42, über bis zu 100 Fokusebenen im Abstand von 0,5 x der Schärfentiefe des Objektivs.

Hallo Michael,

genau das, was du in deiner anfänglichen Überlegung und Abbildung gezeichnet hast, kann man mit PICOLAY (bitte mit einem 'C' - der Name steht für PICture OverLAY) machen. Ich habe das Verfahren, das ganz anders als das normale Stacking funktioniert (nämliche ohne Tiefenkarte), Hologramm-Stacking genannt. Jedes Pixel, das einen wählbaren Kontrastwert überschreitet, wird gezeichnet (bei jedem beliebigen Kontrastverfahren). Alternativ kann man auch nach (Fluoreszenz-)Farben statt Kontrast suchen :)

D.h. bei einem Minimum-Kontrast von 0 wird nur die oberste (oder aber unterste!!) Schicht sichtbar werden. Bei geeigneter Wahl des Minimums und der Filtergröße kann man selektiv Strukturen in allen Ebenen erkennen. Man stellt bereits vor dem Stacking den Betrachtungswinkel ein, so dass übereinander liegende Strukturen sich nicht verdecken müssen ;)

Außerdem kann man die optischen Schnitte, die einen Bilderstapel ausmachen, mit dem o.g. Filter sieben und exportieren, zum Beispiel zum 3D-Druck oder zu einer Animation, wie die innneren Strukturen eines semitransparenten Objekts aufeinander folgen.

Schaut euch dazu mal meine entsprechenden YT-Videos an...

https://www.youtube.com/watch?v=5MKPi-_whZU

https://www.youtube.com/watch?v=0kVqm5xMaMY


Viel Spaß beim Ausprobieren. Es ist nicht immer ganz einfach. Aber notfalls kann ich gern Hilfe anbieten...

LG
Heribert

Hallo Michael n.s.M,

Die höchste NA für das VHX ist ein Objektiv mit 0,82 bei 4 mm Arbeitsabstand. 
Schlimmer ist aber das kein Kondensor vorhanden ist. Auch für Deckgläser ist das Ganze kein Vorteil.  Die LED bringt zwar etwas, aber kein Vergleich. 

Du hast natürlich recht, für so feine Details ist das System nicht geeignet. 
Ich übe gerade mit der schiefen Beleuchtung, da sieht es schonmal günstiger aus. Subjektiv.

Ich lasse bei Zeiten mal Heriberts tolles Picolay drüberlaufen, mit den Anregungen und Beispielen aus dem Hologramm-Stacking könnte man trotzdem mal einen Versuch durchführen.

Mit Helicon könnte man auch die ganze Arbeit aufteilen und in Häppchen verarbeiten. Das Substacking bietet dann mehr Möglichkeiten der Einflussnahme. Kommt aber nicht an einen versierten User von Picolay heran, schätze ich.

Lieber Heribert,
Vielen Dank nochmals für Deine gute Vorarbeit und den gut erklärenden Videos.
Die Hologramm Funktion, wobei man auch schwächer kontrastierte Mermale heraus arbeiten kann ist nazürlich ein super Alleinstellungsmerkmal. (Anm. ImageJ kenne ich jetzt nicht von der Anwendung).

Hast Du schon einmal vergleichen können, ob nach Herausarbeiten der schwachen Strukturen letztendlich auch die "echte" unverfälschte Struktur dargestellt wird? Vgl. REM oä?

LG Frank