Hallo,
beim Sortieren der Website sind mir noch zwei Aufnahmen aufgefallen, die ich "nur mal so" auch hier zeigen möchte: :)
Die erste Aufnahme ist Schneckenlaich aus dem Gartenteich. Viele einzelne Tiere waren in einer "Gallerthülle" vereint. Gezeigt ist hier aber nur ein Tier. Das Gehäuse und die Gehäuseöffnung sind schon gut zu erkennen. Die Beleuchtung erfolgte im Auflicht mit Blaulicht (Fluoreszenzkondensor). Da das Euparal selbst auch fluoresziert, ergab sich dieser "goldige" Bildeindruck (Stack aus 4 Ebenen; PL APO 20x/0.6).
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/33294_7039434.jpg)
Die zweite Aufnahme zeigt Bäckerhefe aus dem Supermarkt, in Wasser suspendiert und einige Stunden bei 30°C inkubiert. Gezeigt ist eine Überlagerung von Durchlicht und Auflichtfluoreszenz. Die Zellen sind mit Calcein-AM gefärbt. Lebende Zellen fluoreszieren grün, tote fluoreszieren nicht (rötlich). (Bildüberlagerung und Bearbeitung in Photoshop).
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures001/33294_48339076.jpg)
Das Ganze funktioniert wie folgt: Calcein-AM, ein schwach fluoreszierendes Molekül, ist in der Lage, die Zellmembran zu passieren. In einer lebenden Zelle jedoch wird diese Substanz zum Substrat für Esterasen (eine Enzymfamilie), die das Calcein abspalteten. Calcein zeigt eine deutlich Fluoreszenz und kann zudem die Zellmembran nicht passieren. Dadurch wird das fluoreszierende Calcein in der Zelle angereichert, die Zelle leuchtet in der Auflichtfluoreszenz auf. Tote Zellen hingegen setzen Calcein-AM nicht um.
Viele Grüße,
Ole
Hallo Ole,
ich bin begeistert.
Könntest du noch eine genauere Beschreibung der Präparation mit dem Calcein M geben,
Wo bekommt man es her und in welchen Mengen wird es zugegeben ?
Was ich noch nicht verstehe ist, warum die toten Zellen rot aussehen. Ist dies eine Eigenfluoreszenz oder Reststreulicht aus dem Anregungsspektrum ?
viele Grüsse
Wilfried
Hallo Wilfried,
das Calcein-AM hatte ich seinerzeit noch von Molecular Probes bezogen. Die Firma ist aber zwischenzeitlich von Invitrogen aufgekauft worden. Weitere Infos findest Du, wenn Du bei www.invitrogen.com nach Calcein AM fahndest. Nicht ganz billig, dafür werden aber auch nur kleine Mengen benötigt. Die Endkonzentration im Medium betrug etwa 100nM. Die Inkubationszeit beträgt (je nach Zelltyp und Konzentration) einige Minuten bis etwa 2h.
In meinem Beispiel hatte ich eine Auflichtfluoreszenzaufnahme mit einer Hellfeldaufnahme (niedrig gedimmte Halogenbirne und Filtercube im Strahlengang, daher der Rotton) mittels Photoshop kombiniert und abschließend die Bildparameter (Helligkeit etc.) angepaßt. Da war also auch wieder mal etwas der Spieltrieb aktiviert worden, "normalerweise" würde man sicher die Auflichtfluoreszenz mit Phako (oder wahlweise DIK, Dunkelfeld etc.) kombinieren.
Der Ansatz ist auf jeden Fall ein schnelles und zuverlässiges Verfahren, um lebende und tote Zellen zu differenzieren. Ohne es bislang selbst auprobiert zu haben, könnte ich mir auch gut vorstellen, dass man so lebende Pilze auf totem Substrat (siehe die Diskussionen zu Schimmelpilzen) eindeutig identifizieren könnte.
Viele Grüße,
Ole
Hallo -
man kann auch Fluoreszein-Diazetat verwenden, das ist billiger. Funktionsprinzip und Färbung identisch, wie von Ole erklärt.
Gruß
Rolf
Danke Ole und Rolf,
ich werde mir einen der Fluoreszenzfarbstoffe mal besorgen und versuchen das Verfahren
auf meine Gäransätze vom letzten Herbst anzuwenden.
Mal sehen was da noch so an lebenden Hefezellen rumschwimmt.
viele Grüsse
Wilfried
Lieber Wilfried,
Acriflavin in geeigneter Konzentration sollte es auch tun und das habt Ihr doch bestimmt.
Herzlichen Gruß
Detlef
Hallo Detlef,
vielen dank für den Tipp.
Ich denke schon, dass unsere Biologen das alles haben, ich wollte bloss sichergehen, wo ich gegebenenfalls
bestellen muss.
Gruss
Wilfried